CN108502892A - 一种用于复制矽肺模型的标准石英粉尘的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于复制矽肺模型的标准石英粉尘的制备方法,研制石英粉尘的原料系天然水晶,制备的方法是取石英水晶放入玛瑙球磨罐中,球磨6天左右,加蒸馏水静置后分选包含所需粒径大小的石英粉尘混悬液,待混悬液静置完全后干燥沉淀,即可得到符合要求的石英粉尘。本发明研制的石英粉尘可供研究人员复制动物和细胞矽肺模型用,使用这种统一规格的标准石英粉尘使得不同研究者之间的实验结果具有可比性,将有助于推动矽肺发病机制和治疗药物的研究。本发明的方法操作简单,易于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属涉及一种医学模型材料的制备方法,尤其涉及一种用于复制动物矽肺模型的标准石英粉尘的制备方法。
背景技术
尘肺是危害接尘工人健康最广最严重的职业病,是我国职业病防治工作中的重点和难点。据国家卫生计生委发布,截止2016年底,我国尘肺病累计报告831246例,约占所有职业病总数90%,其中主要是矽肺和煤工尘肺。我们将2010-2016年国家卫生计生委(原卫生部)职业病报告病例数据进行整理,发现尘肺病报告例数逐年上升,发病形势严峻。并且据卫生部2011卫生统计年鉴估算,我国石英粉尘接触工人超过4000万,由于尘肺病潜伏期为10~20年,即便现在采取严格的粉尘控制措施,预计在未来20年内还将有大量尘肺病患者陆续发病,因此,尘肺的发病机制和治疗药物研究是我国职业病防治工作中的重要任务。
矽肺是尘肺病中的典型代表,实验研究表明石英粉尘是引起矽肺的明确病因。因此在进行矽肺发病机理和治疗矽肺药物筛选的实验研究时均需要有一定规格的石英粉尘,以复制实验性矽肺模型。由于各实验者所用石英粉尘的性质、粒度大小和制备方法的不同,因此所制备的实验性矽肺模型及实验结果往往也有些差异。为了使实验结果便于比较,则需要制备一种统一规格的标准石英粉尘,当实验者都使用这种标准石英样品进行实验时,则所复制的实验性矽肺模型及其实验结果能在各实验室之间进行比较和借鉴。此外这种粉尘如能作为产品供应时,也可节省制备粉尘所花费的时间。
到目前为止,国际上只有一种标准石英粉尘,即德国的石英粉尘DQ-12(deutschquartz,DQ),其粉尘粒子基本上在5μm以下,但这种粉尘目前已无供应来源。Sigma-Aldrich公司生产的石英粉尘系人工合成的二氧化硅,其致病性相对较弱,且其分散度达不到5μm占99%左右的要求,不能模拟工人接触粉尘的实际情况,在粉尘作用过程中,直径大于5μm的粉尘常被阻留在上呼吸道,而小于5μm的可吸入性粉尘才能进入肺泡,引起肺纤维化。
发明内容
本发明旨在满足目前尘肺研究对于标准石英粉尘的需求,提供一种用于复制矽肺模型的标准石英粉尘的制备方法,该方法操作简单,易于工业化生产。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种用于复制矽肺模型的标准石英粉尘的制备方法,该方法具体为:将天然水晶粉碎,制成直径为2-5mm的粗制水晶砂,放入球磨罐中;加入研磨球,所述研磨球由直径分别为3、5、10、20、35mm的五种研磨球按质量配比4:2:1:1:1组成,研磨球的总质量为天然水晶的7倍;再加入蒸馏水淹没固体且至距离球磨罐的罐口1cm的位置,球磨6天;用蒸馏水静置24小时以上,确定临界液面,吸出临界液面以上部分的全部混悬液;临界液面的确定标准是该液面处粒径5μm以下的粉尘粒子占该液面处所有粉尘粒子的95%以上;静置5天以上,得沉淀物,干燥,即可得到用于复制矽肺模型的标准石英粉尘。
进一步地,所述天然水晶的纯度大于99%。
进一步地,所述球磨罐为玛瑙球磨罐。
进一步地,所述研磨球为玛瑙球。
进一步地,所述干燥具体为:将沉淀物置于100℃烘箱内烘干至不含有水份。
本发明的有益效果是,本发明提供了一种制备统一规格石英粉尘的方法,根据该方法研制的石英粉尘其理化性质和致病性与德国的DQ无明显差别,可作为标准石英粉尘供国内外学者复制动物矽肺模型用,便于研究结果的相互比较和借鉴,以促进尘肺的致病机制及治疗的研究进展。本发明的方法操作简单,易于工业化生产。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明:
图1是本发明研制石英粉尘的X射线衍射谱;
图2是德国石英粉尘的X射线衍射谱;
图3是大鼠矽肺模型肺组织病理变化图,其中,A为正常对照组(Control),B为生理盐水对照组(NS),C为25mg/ml研制石英粉尘组(25mg/ml SiO2),D为25mg/ml德国石英粉尘组(25mg/ml DQ-12_SiO2),E为50mg/ml研制石英粉尘组(50mg/ml SiO2),F为50mg/ml德国石英粉尘组(50mg/ml DQ-12_SiO2),箭头指示胶原纤维。
具体实施方式
1.石英粉尘的制备
(1)石英原料的选择
选用天然石英水晶块200g,其纯度为99.28%,即游离SiO2的质量含量为99.28%。一般来说石英的纯度越纯越好。水晶块经初步加工粉碎后即成为粗制的水晶砂,粗加工的水晶砂一般粒子大小为2-5mm。
(2)水晶砂的研磨
按1份的粗制水晶砂和7份的玛瑙球(即质量比为1:7)放入500ml的玛瑙研磨罐内,玛瑙球的直径分别为3、5、10、20、35mm,按质量比4:2:1:1:1的加入。然后往玛瑙研磨罐内加蒸馏水至距离罐口约1cm水平,四个玛瑙罐的重量应该相等,若不相等可用蒸馏水调节到相等,以保持研磨时维持在平衡的状态。将玛瑙罐密封盖拧紧后,放在球磨机上,按转速为每分钟100转的速度进行研磨。研磨时间根据石英砂颗粒大小而定。一般要研磨6天,如果受时间限制,可缩短研磨时间,研磨100小时也能筛选出小于5μm的石英粉尘。
(3)石英粉尘的静置
将研磨好的石英粉尘混悬液移到15L的蒸馏水瓶内,然后添加蒸馏水到瓶内体积的90%处。之后,用手充分摇动蒸馏水瓶,使粉尘得到充分混匀,并分散在蒸馏水中,静置24小时(切不可搬动)。
(4)石英粉尘的浮选
粉尘混悬液静置24小时后,在蒸馏水瓶不同高度处,用5ml的大肚吸管取样滴一滴在载玻片上再盖上盖玻片待用,悬液样品在400倍的显微镜下计数5μm以下粉尘粒子的百分数,即得到不同高度下粉尘悬液的分散度。按照建立动物矽肺模型的要求,粒子分散度5μm以下的粒子要达到95%以上。
(5)石英粉尘的烘干
将含有5μm以下粉尘悬液层以上的悬液全部吸出,放入玻璃标本缸内静置5天,然后将沉淀物(粉尘)移到瓷蒸发皿内,并移到100℃烘箱内烘干,直到粉尘不含有水份为止,则可成为实验用的石英粉尘。
2.所制备石英粉尘的理化性质
(1)粉尘粒子的分散度
粉尘粒径的大小直接影响到粉尘粒子在呼吸道内的沉降部位和致病作用。因此它是标准石英粉尘的一项重要指标,为了了解粒径的分布情况,对粉尘进行粒子分散度的测定,粉尘样品是在400倍的显微镜下进行观测的,每个样品测量了1000个粒子,然后求其百分比,并与德国的标准石英粉尘做了对比,测量的结果如表1所示。表1为本发明研制的石英粉尘粒子的分散度测定,并与德国石英粉尘粒子的分散度进行比较。
表1
从表1可以看出,本发明研制石英粉尘的分散度,2μm以下和5μm以下者分别占82.1%和98.5%,而德国的标准石英粉尘2μm以下和5μm以下者分别占81.7%和99.0%,两者具有一定的可比性。
(2)X-光衍射粉晶分析
为了解石英粉尘中除结晶的石英外是否还有其他杂质的存在,用X射线衍射仪(X’Pert PRO,荷兰PNAlytical公司)进行了粉晶分析。
如图1和图2所示,从X射线衍射分析的结果可以看出本发明研制的石英粉尘和德国石英粉尘均具有石英晶体特征性的衍射谱线,光谱半定量分析的结果认为除二氧化硅外,还有微量的铁、铝、铜、硼等元素,但其量均小于0.001%,在两种石英粉尘中均无明显杂质存在。3、研制石英粉尘的致纤维化能力
为了解研制的石英粉尘对大鼠肺脏的致纤维化作用,采用气管注入法对大鼠进行染尘,2个月后解剖,取肺脏作病理组织检查,行苏木素-伊红(HE)染色,同时用德国石英粉尘(DQ-12)作为对比,具体操作如下:
(1)粉尘的处理
造模前一天取适量两种石英粉尘分别放在干净的培养皿中,180℃加热2h,以达到灭菌和灭活内毒素的作用,稍微冷却后,称取所需重量,在玛瑙研钵中研磨30min,边研磨边加生理盐水,最后用生理盐水分别配成25mg/ml或50mg/ml的混悬液,高压灭菌,备用。
(2)动物的分组
体重160~180g健康雄性SD大鼠30只,随机分成五组:正常对照组(Control)、生理盐水组(NS)、25mg石英组(25mg/ml SiO2)、50mg石英组(50mg/ml SiO2)、25mg石英组(25mg/ml DQ-12_SiO2)、50mg石英组(50mg/ml DQ-12_SiO2)六组。
(3)建立矽肺模型
除空白对照组外,其他组SD大鼠用乙醚麻醉后,趁大鼠吸气时迅速进行气管插管,用注射器将事先准备好的1ml SiO2悬液(25mg/ml或50mg/ml)或NS(生理盐水)快速而均匀的注入大鼠气管内。注入粉尘后,动物常出现呼吸困难或窒息,此时必须立即作人工呼吸,急救至呼吸均匀为止。
(4)病理染色
于气管内灌注后的第60天将大鼠处死取材,肺组织用10%甲醛固定,经脱水、石蜡包埋后,按4μm的厚度切片,行苏木素-伊红染色。
如图3所示,染尘后二个月时,研制石英25mg组大鼠肺组织可见肺泡间隔增厚及细胞性矽结节,部分矽结节已有胶原纤维化,肺泡结构破坏,上皮细胞脱落,肺泡间隔断裂,局部肺泡腔内有炎性渗出,个别支气管腔中可见炎性细胞。德国石英粉尘25mg组的纤维化病变与研制石英组的病变基本相似,在肺组织中可见矽结节,此时矽结节中也见有一定数量的胶原纤维,在肺泡腔中有尘细胞的聚集灶。研制石英粉尘和德国石英粉尘的50mg组大鼠肺组织病变比25mg组都明显加重,局部矽结节融合成片,胶原纤维也明显增加。按照我国实验性尘肺的病理分级标准,两种石英粉尘染尘后二个月时,25mg组大鼠肺组织病变主要以细胞性结节为主,出现Ⅱ级纤维化,肺内矽结节的病变比英国King氏分级标准的Ⅱ级纤维化强些;50mg组大鼠肺组织以细胞性和纤维性矽结节为主,出现Ⅱ~Ⅲ级纤维化,此时肺脏的病变相当于King氏分级标准的Ⅲ级纤维化。
根据上述结果可以得到以下结论:
1、选用纯石英(水晶)做原料经玛瑙球磨机研磨制备了实验用石英粉尘。
2、石英粉尘的粒子分散度测定结果表明,在5μm以下者占98.5%,2μm以下者占82.1%,分散度与德国石英粉尘DQ-12相比具有可比性。
3、X-光衍射粉晶分析的结果表明,在本发明研制的石英粉尘中,除二氧化硅外,未发现其他物相杂质,游离二氧化硅含量为99.28%。
4、石英粉尘的致病性实验结果表明,染尘后二个月大鼠肺组织出现典型的细胞性矽结节,部分矽结节已有胶原纤维化,肺泡结构破坏,高剂量组病变有所加重,低剂量组和高剂量组分别出现Ⅱ级和Ⅱ~Ⅲ级纤维化,与德国石英粉尘的病变基本一致。
结论:经研磨、水选制备的石英粉尘可供动物染尘用以复制实验性矽肺动物模型。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述,但其只是作为范例,本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言,任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此,在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改,都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (5)
1.一种用于复制矽肺模型的标准石英粉尘的制备方法,其特征在于,该方法具体为:将天然水晶粉碎,制成直径约为2-5mm的粗制水晶砂,放入球磨罐中;加入研磨球,所述研磨球由直径分别为3、5、10、20、35mm的五种研磨球按质量配比4:2:1:1:1组成,研磨球的总质量为天然水晶的7倍;再加入蒸馏水淹没固体且至距离球磨罐的罐口1cm左右的位置,球磨6天;用蒸馏水静置24小时以上,确定临界液面,吸出临界液面以上部分的全部混悬液;临界液面的确定标准是该液面处粒径5μm以下的粉尘粒子占该液面处所有粉尘粒子的95%以上;静置5天以上,得沉淀物,干燥,即可得到用于复制矽肺模型的标准石英粉尘。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述天然水晶的纯度大于99%。
3.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述球磨罐可以为玛瑙球磨罐。
4.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述研磨球可以为玛瑙球。
5.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述干燥具体为:将沉淀物置于100℃烘箱内烘干至不含有水份。
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