CN108498797B - 亚甲蓝复合体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于治疗由痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌引起的皮肤病的使用亚甲蓝的复合体粒子以及包括所述复合粒子的治疗组成物。所述复合体粒子在进行光动力治疗时被用作光敏剂，用亲水性的亚甲蓝和疏水性的2种有机酸进行复合后形成胶束状的复合体粒子，容易侵入毛孔，同时将等待时间从原有光疗所需的1至3小时显著缩短至30分钟内。另外，亚甲蓝‑有机酸复合体的光反应和光漂白效果能使故有光敏剂的光疗后残存的光敏剂副作用最小化，将原先治疗后需要24小时避光的避光期(光隔离或光屏蔽)显著缩短至3小时内。能够对引起痤疮的金黄色葡萄球菌或痤疮丙酸杆菌进行定向治疗。

Description

亚甲蓝复合体及其应用
技术领域
本发明涉及一种用于治疗由痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌等引起的痤疮等皮肤病的含有亚甲蓝和有机酸的复合粒子以及用包括所述复合粒子的用于治疗痤疮等皮肤病的组合物。
背景技术
通常，痤疮是当存在皮肤真皮层的皮脂腺提高，皮脂分泌增加导致毛孔堵塞时，由痤疮的致病真菌痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes(P.acnes))、化脓性细菌金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(S.aureus)或毛囊脂螨等致病真菌引起的炎症。处于青春期时，雄激素的刺激促进皮脂腺发育，产生痤疮；而成人后，化妆导致皮脂排出障碍，或者由于压力、睡眠不足等促使肾上腺皮脂激素增加，刺激皮脂腺，也会产生痤疮。
光动力疗法(Photodynamic Therapy,PDT)的基本概念是利用光敏剂(Photosensitizer)在光照射下产生单态氧(Singlet oxygen)和其他自由基以杀灭诱发炎症的细菌的原理，是一种通过对痤疮的致病真菌痤疮丙酸杆菌propionibacterium acnes或诱发化脓性炎症的金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的活性氧、血管闭塞、免疫、细胞凋亡Apoptosis等灭菌、杀菌作用，减少痤疮丙酸杆菌或金黄色葡萄球菌，抑制异常增生的皮脂腺，有效治疗痤疮的方法，目前众多病院和医院正在使用光动力疗法进行手术。
这一治疗方法是先将光敏剂涂抹在皮肤表面，所述光敏剂经皮脂腺和毛孔选择性吸收，照射特定波长的激光射线激活皮脂腺和毛孔中的光敏剂，产生单态氧破坏皮脂腺，在杀灭毛孔中的痤疮丙酸杆菌的同时，引起皮肤表面角质层脱落(去皮效果)，通过去除堵塞毛孔角质的去皮作用，使皮脂排出顺畅。
接受这一治疗能看到的疗效是，可快速修复炎症性痤疮，显著降低痤疮的复发率，后续的皮脂腺分泌减少、减少黑头并使毛孔缩小。
为了进行有效的治疗，要求光敏剂具备的特征有：在生物体内的稳定性、目标性；无光照时物质毒性最小化；光照从生物体表面到病患部位的有效的渗透性以及高强的光反应等。
目前被广泛使用的光治疗用剂有ALA(5-氨基乙酰丙酸)、MAL(甲基-氨基酮戊酸盐)、色氨酸等。尤其是，ALA、MAL注入细胞，使用卟啉类光敏剂后经过代谢，在特定波长的光照下体现光动力疗法的疗效，因为注入患部后需要时间进行代谢，所以大约需要等待2个小时以上较长的时间。由此引起的问题有：治疗费用的提高；虽然短期内具有治疗痤疮的疗效，但长期使用可能诱发皮肤干燥症；治疗后的日常生活中，至少40小时的避光期(光隔离期、光屏蔽期、去光期)内要注意避免强光刺激。此外，在进行光动力治疗时，皮肤多处产生单态氧，可能杀灭痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌之外的健康细胞或破坏皮脂腺，因此不能达到既定的治疗目的。
一方面，亚甲蓝作为用于各种治疗的物质被研究至今，(Marilyn T Wan,JenniferY Lin光动力学疗法在皮肤科的应用现状及应用。临床研究、化妆品和皮肤病学7(1):145-163)，近期，使用亚甲蓝的皮肤病PDT也正被使用，但亚甲蓝作为亲水性分子很难穿透细胞膜或皮肤脂质层，定向性较低，因此为了将亚甲蓝用作光敏剂有效的定向性PDT治疗皮肤病，需要将亚甲蓝和其他疏水性粒子等混合在一起，改变其特性。
本说明书的全部内容参照了众多论文和专利文献，并对有关引用进行标识。所引用的论文和知识产权文献的所有内容被整个插入本说明书作为参照，对本发明所属技术领域的技术水平和本发明的内容进行更加明确的说明。
【先行技术文献】
【专利文献】
(专利文献11)US2002/0128695A(寻常性痤疮光动力治疗高能量的装置和方法APPARATUS AND METHOD FOR HIGH ENERGY PHOTODYNAMIC THERAPY OF ACNE VULGARISAND SEBORRHEA)
(专利文献2)US2008/0014248A(酸含光敏剂，试剂盒开发PHOTOSENSITIZERCONTAINING INDOLE-3-ALKYLCARBOXYLIC ACID,AND KIT FOR PHOTODYNAMIC THERARYCONTAINING THE SAME)
【非专利文献】
(非专利文献1)Marilyn T Wan,Jennifer Y Lin。光动力学疗法在皮肤科的应用现状及应用(Current evidence and applications of photodynamic therapy indermatology)
发明内容
本发明为解决如上所述使用光动力疗法的卟啉类光敏剂的缺陷，使用另一种光敏剂亚甲蓝。第一个目的是进行光动力治疗时，为了在注入患部后产生效果，将等待时间缩短为0至1小时以内，同时治疗后的避光期缩短至0到3小时之内，将副作用和治疗后的光敏反应降至最低；第二个目的是提供一种复合体粒子，就是将光敏剂有效地注入皮肤脂质，提高细胞透湿性，使光动力治疗产生效果，将亲水性的亚甲蓝和两种有机酸以合适的比例混合形成胶束。
本发明的另一目的是提供一种将亚甲蓝和有机酸以及界面活性剂混合形成的颗粒，解决一个原有的技术问题，即使用亚甲蓝进行光动力治疗时，单态氧产生在病患部位以外任意部位的现象。所述本发明的复合体粒子成胶束状，亚甲蓝粒子位于中心，疏水性界面活性剂位于外部，由于仅在发病部位产生单态氧，所以可以进行定向治疗的光动力治疗光敏剂的利用度就高。
另外，本发明提供一种痤疮治疗中有效的光动力治疗的含有亚甲蓝(Methylenebule)、有机酸和界面活性剂的复合纳米粒子的用于治疗痤疮等皮肤病的组成物。所述有机酸选自DHA：二十二碳六烯酸(DHA:docosahexaenoic acid)、吲哚-3-乙酸(IAA:indole-3-acetic,acid)、凝血酸(Tranexamic acid)、水杨酸(Salicylic acid),抗坏血酸(Ascorbicacid)、亚油酸(Linoleic acid)、亚麻脂酸(Linolenic acid),油酸(Oleic acid)、脱氧胆酸(Deoxycholic acid)、叶酸(Folic acid)、视黄酸(Retinoic acid)、胆酸(Cholicacid)、甘氨胆酸(Glycocholic acid)、牛磺胆酸(Taurocholic acid)、鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid)、甘氨鹅脱氧胆酸钠(Glycochenodeoxycholic acid)、牛磺鹅〔去氧〕胆酸(Taurochenodeoxycholic acid)、石胆酸(Lithocholic acid)、双水杨酯(Salicylsalicylic acid)、乙酰水杨酸(Acetylsalicylic acid)、水杨酸甲酯(Methylsalicylic acid)、苯醋酸(Phenylacetic acid)使用，提供具有这一特征的亚甲蓝纳米粒子组成物，在光动力疗法中使用亚甲蓝复合体粒子用于痤疮治疗。
本发明提供一种含有亚甲蓝和两种有机酸的复合体组成的亚甲蓝复合体粒子。
为形成亚甲蓝复合体粒子，所使用的亚甲蓝、有机酸1和有机酸2的理想的质量比是，有机酸1的质量是亚甲蓝的1至5倍，有机酸2与亚甲蓝和有机酸1的混合物的质量对比是50至500倍。所述有机酸1和2只要是不同的有机酸就可以。
本发明的又一理想案例是，为形成亚甲蓝复合体粒子，所使用的亚甲蓝、有机酸和界面活性剂的理想的质量比是，有机酸的质量是亚甲蓝的1至5倍，界面活性剂与亚甲蓝和有机酸混合物的质量对比是50至500倍。
本发明中用亚甲蓝复合体粒子进行光疗时，患部用药后的等待时间在0秒至1小时，理想的是在0秒和30分钟以内，患者在治疗后可以维持日常生活，避光期在0秒和3小时以内，理想的是0秒和1小时以内，最理想的是在0秒和30分钟以内。
本发明中，亚甲蓝复合体粒子是由通过临床试验等认证了活体稳定性的化合物和源自人体的物质构成的。
本发明一理想的实施例的特征有，本发明的亚甲蓝复合体粒子的直径在50nm以上100μm以下，最好是50nm以上200nm。
本发明的理想的实施例的特征有，本发明的亚甲蓝复合体粒子中的界面活性剂使用的是油酸。
本发明的理想的实施例的特征有，本发明的亚甲蓝复合体粒子治疗由痤疮丙酸杆菌或金黄色葡萄球菌引起的痤疮。
本发明的亚甲蓝纳米粒子中使用的有机酸：二十二碳六烯酸(DHA:docosahexaenoic acid)、吲哚-3-乙酸(IAA:indole-3-acetic,acid)、凝血酸(Tranexamicacid)、水杨酸(Salicylic acid),抗坏血酸(Ascorbic acid)、亚油酸(Linoleic acid)、亚麻脂酸(Linolenic acid),油酸(Oleic acid)、脱氧胆酸(Deoxycholic acid)、叶酸(Folicacid)、视黄酸(Retinoic acid)、胆酸(Cholic acid)、甘氨胆酸(Glycocholic acid)、牛磺胆酸(Taurocholic acid)、鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid)、甘氨鹅脱氧胆酸钠(Glycochenodeoxycholic acid)、牛磺鹅〔去氧〕胆酸(Taurochenodeoxycholic acid)、石胆酸(Lithocholic acid)、双水杨酯(Salicylsalicylic acid)、乙酰水杨酸(Acetylsalicylic acid),水杨酸甲酯(Methyl salicylic acid)、苯醋酸(Phenylaceticacid)分别为如下所示的化合物，用化学式1至22一一标识，最理想的是使用水杨酸和油酸的亚甲蓝复合体粒子。
【化学式1】
Figure BDA0001488232330000051
DHA：二十二碳六烯酸
【化学式2】吲哚-3-乙酸，酸
Figure BDA0001488232330000052
吲哚-3-乙酸
【化学式3】
Figure BDA0001488232330000053
凝血酸
【化学式4】
Figure BDA0001488232330000061
水杨酸【化学式5】
Figure BDA0001488232330000062
抗坏血酸【化学式6】
Figure BDA0001488232330000063
亚油酸
【化学式7】
Figure BDA0001488232330000071
亚麻脂酸【化学式8】
Figure BDA0001488232330000072
油酸
【化学式9】
Figure BDA0001488232330000073
脱氧胆酸【化学式10】
Figure BDA0001488232330000081
叶酸
【化学式11】
Figure BDA0001488232330000082
视黄酸
【化学式12】
Figure BDA0001488232330000083
胆酸
【化学式13】甘氨胆酸(Glycocholic acid)
Figure BDA0001488232330000091
甘氨胆酸【化学式14】
Figure BDA0001488232330000092
牛磺胆酸
【化学式15】
Figure BDA0001488232330000093
鹅去氧胆酸【化学式16】
Figure BDA0001488232330000101
甘氨鹅脱氧胆酸钠
【化学式17】
Figure BDA0001488232330000102
牛磺鹅〔去氧〕胆酸【化学式18】
Figure BDA0001488232330000103
石胆酸
【化学式19】
Figure BDA0001488232330000111
双水杨酯【化学式20】
Figure BDA0001488232330000112
乙酰水杨酸【化学式21】
Figure BDA0001488232330000113
水杨酸甲酯【化学式22】
Figure BDA0001488232330000121
苯醋酸
亚甲蓝(Methtylene bule)是由吩噻嗪结合而成的染料，在光照下，吩噻嗪发生反应显现活病毒效果。活病毒效果是1940年开始被知晓的，利用其特性使用于金黄色葡萄球菌的杀菌治疗。
由于亚甲蓝是正电荷性染料，所以靠其自身进入细胞内是十分困难的，但本发明的亚甲蓝复合体粒子含有具有正电荷性的亚甲蓝和具有负电荷性和疏水性的脂肪酸系的两种有机酸，同时具有亚甲蓝粒子位于中心、所述两种有机酸位于外部的这一特性的复合体粒子呈胶束状。在亲水性溶媒中，分子的疏水性部分集中在中央形成一个核，亲水性部分则形成与水接触的外围部分，本专利的亚甲蓝粒子在水溶性溶媒中和油等疏水性物质位于胶束的内侧，变得稳定，且溶解于溶媒。与由脂质组成的皮肤接触的瞬间，突显疏水性的部分就位于外围部分，所以所述复合体粒子所表现出的疏水性的特质就对皮肤脂质具有高强的渗透力。
一具体示例中，所述亚甲蓝复合体粒子的制造方法是亚甲蓝和有机酸混合后形成亚甲蓝-有机酸混合物，将之冻结并干燥，使形成复合体，再将这一所述复合体与其他有机酸混合。但方法并不一定限于此。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明中，为了光动力疗法中使用的光敏剂使用纳米粒子，作为由亲水性亚甲蓝和疏水性有机酸组成的胶束状复合体粒子，容易渗入毛孔，与传统的需要2到3小时代谢时间的光疗法相比，可将等待时间明显缩短至1小时以内。另外，为了减少传统光疗法中残留的光敏剂的副作用，凭借亚甲蓝-有机酸复合体的光反应和光漂白的效果，可将避光、光隔离或光屏蔽的时间从使用以往的光敏剂时所需要的40个小时明显缩短至3小时以下，对诱发痤疮的痤疮丙酸杆菌或金黄色葡萄球菌等具有治标疗效。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1是本发明由亚甲蓝-水杨酸-油酸组成的复合体粒子的模式图；
图2是测定本发明亚甲蓝和有机酸组成的胶束状复合体粒子分散于水中时的吸光度和荧光强度的图表；
图3是实施例1中将制备的纳米粒子用马尔文激光粒度仪(Zetasiser nano ZS)和透过式电子显微镜测定复合体粒子大小的图表(图3a)和分布图(图3b)；
图4是将亚甲蓝充入复合体粒子内部的本发明中由亚甲蓝和有机酸形成的复合体粒子(MBX NPs)和相同量的亚甲蓝溶解于水的亚甲蓝溶液(MB Sol.)中亚甲蓝的单态氧(singlet oxygen)的生成能进行比较的坐标图；
图5是实施例3中所实施的评估光毒性和暗毒性的坐标图；
图6是实施例5中由亚甲蓝和水杨酸形成的复合体粒子的光毒性的评估，展现痤疮丙酸杆菌(P.Acnes)的形态(图6a)和对痤疮丙酸杆菌的光照毒性的评估(图6b)。
具体实施方式
以下，通过实施例对本发明进行更为详细的说明。这些实施例只是为了详尽说明本发明，本发明的范围并不仅限于此，对具备本发明所属技术领域一般知识的人是可以理解的。
实施例
实施例1:光敏剂(亚甲蓝)和有机酸的疏水化复合体(complex)的制备
(1)静电力下亚甲蓝/DHA的疏水化
将20mg的亚甲蓝(MB,购自Aldrich)和20mg的DHA(D,购自Aldrich)放入50ml的四氢呋喃(THF,购自大正化学)并在60-90℃的温度下加热1到5分钟，使亚甲蓝溶解。使用注射型疏水性过滤器(0.2μm)过滤亚甲蓝溶解后的混合物以获取过滤液并加以干燥。用氯仿和水抽取融化于有机层的亚甲蓝复合体提炼后冻结干燥，获取MBD(亚甲蓝和DHA的复合体)。
(2)静电力下亚甲蓝/吲哚乙酸(IAA)的疏水化
将20mg的亚甲蓝(MB,购自Aldrich)和20mg的吲哚乙酸(I,购自Aldrich)放入50ml的四氢呋喃(THF,购自大正化学)并在60-90℃的温度下加热1到5分钟，使亚甲蓝溶解。使用注射型疏水性过滤器(0.2μm)过滤亚甲蓝溶解后的混合物以获取过滤液并加以干燥。用氯仿和水抽取融化于有机层的亚甲蓝复合体提炼后冻结干燥，获取MBI(亚甲蓝和IAA的复合体)。
(3)静电力下亚甲蓝/凝血酸的疏水化
将20mg的亚甲蓝(MB,购自Aldrich)和20mg的凝血酸(I,购自Aldrich)放入50ml的四氢呋喃(THF,购自大正化学)并在60-90℃的温度下加热1到5分钟，使亚甲蓝溶解。使用注射型疏水性过滤器(0.2μm)过滤亚甲蓝溶解后的混合物以获取过滤液并加以干燥。用氯仿和水抽取融化于有机层的亚甲蓝复合体提炼后冻结干燥，获取MBT(亚甲蓝和凝血酸的复合体)。
(4)静电力下亚甲蓝/水杨酸盐的疏水化
将20mg的亚甲蓝(MB,购自Aldrich)和20mg的水杨酸盐(S,购自Aldrich)放入50ml的四氢呋喃(THF,购自大正化学)并在60-90℃的温度下加热1到5分钟，使亚甲蓝溶解。使用注射型疏水性过滤器(0.2μm)过滤亚甲蓝溶解后的混合物以获取过滤液并加以干燥。用氯仿和水抽取融化于有机层的亚甲蓝复合体提炼后冻结干燥，获取MBS(亚甲蓝和水杨酸的复合体)。
(5)静电力下亚甲蓝/抗坏血酸的疏水化
将20mg的亚甲蓝(MB,购自Aldrich)和20mg的抗坏血酸(A,购自Aldrich)放入50ml的四氢呋喃(THF,购自大正化学)并在60-90℃的温度下加热1到5分钟，使亚甲蓝溶解。使用注射型疏水性过滤器(0.2μm)过滤亚甲蓝溶解后的混合物以获取过滤液并加以干燥。用氯仿和水抽取融化于有机层的亚甲蓝复合体提炼后冻结干燥，获取MBA(亚甲蓝和抗坏血酸的复合体)。
实施例2：水相环境中，使用经疏水处理的光敏剂(亚甲蓝)和有机酸的complex(复 合体)的自行组成的复合体粒子的形成
(1)包括MBD和两亲性物质的纳米粒子的制备和评估
取0.2mg的所述实施例1(1)中获取的MBD，用已溶入20mg油酸(购自Aldrich)的水溶液2ml进行充分的分散，制备复合体粒子(MBD NPs)。
评估溶解于水的MB(MB Sol.)和所述分散于水中的复合体粒子(MBD NPs)的吸光度和荧光的图表，从图2可以确认溶解于水的MB的吸收波长和荧光波长随着复合体粒子的形成移往短波长区域。
另外，所述复合体粒子的大小和外形使用马尔文激光粒度仪Zetasiser nano ZS(马尔文仪器,英国)评估粒子的大小，并用透过式电子显微镜(TEM,Tecnai)进行观察，分别如图3(a)和图3(b)所示。通过图3(a)和图3(b)可以确认所述复合体粒子是直径为50到200nm的球形粒子。
(2)包括MBI和两亲性物质的复合体粒子的制备和评估
取0.2mg的所述实施例1(2)中获取的MBI，用已溶入20mg油酸(购自Aldrich)的水溶液2ml进行充分的分散，制备复合体粒子(MBI NPs)。
评估溶解于水的MB(MB Sol.)和所述分散于水中的复合体粒子(MBI NPs)的吸光度和荧光的图表，从图2可以确认溶解于水的MB的吸收波长和荧光波长随着复合体粒子的形成移往短波长区域。
另外，所述复合体粒子的大小和外形使用马尔文激光粒度仪Zetasiser nano ZS(马尔文仪器,英国)评估粒子的大小，并用透过式电子显微镜(TEM,Tecnai)进行观察，分别如图3(a)和图3(b)所示。通过图3(a)和图3(b)可以确认所述复合体粒子是直径为50到200nm的球形粒子。
(3)包括MBT和两亲性物质的复合体粒子的制备和评估
取0.2mg的所述实施例1(3)中获取的MBT，用已溶入20mg油酸(购自Aldrich)的水溶液2ml进行充分的分散，制备复合体粒子(MBT NPs)。
评估溶解于水的MB(MB Sol.)和所述分散于水中的复合体粒子(MBT NPs)的吸光度和荧光的图表，从图2可以确认溶解于水的MB的吸收波长和荧光波长随着复合体粒子的形成移往短波长区域。
另外，所述复合体粒子的大小和外形使用马尔文激光粒度仪Zetasiser nano ZS(马尔文仪器,英国)评估粒子的大小，并用透过式电子显微镜(TEM,Tecnai)进行观察，分别如于图3(a)和图3(b)所示。通过图3(a)和图3(b)可以确认所述复合体粒子是直径为50到200nm的球形粒子。
(4)包括MBS和两亲性物质的复合体粒子的制备和评估
取0.2mg的所述实施例1(4)中获取的MBS，用已溶入20mg油酸(购自Aldrich)的水溶液2ml进行充分的分散，制备复合体粒子(MBS NPs)，复合体粒子的构造模式化如图1所示。
评估溶解于水的MB(MB Sol.)和所述分散于水中的复合体粒子(MBS NPs)的吸光度和荧光的图表，从图2可以确认溶解于水的MB的吸收波长和荧光波长随着复合体粒子的形成移往短波长区域。
另外，所述复合体粒子的大小和外形使用马尔文激光粒度仪Zetasiser nano ZS(马尔文仪器,英国)评估粒子的大小，并用透过式电子显微镜(TEM,Tecnai)进行观察，分别如图3(a)和图3(b)所示。通过图3(a)和图3(b)可以确认所述复合体粒子是直径为50到200nm的球形粒子。
(5)包括MBA和两亲性物质的复合体粒子的制备和评估
取0.2mg的所述实施例1(5)中获取的MBA，用已溶入20mg油酸(购自Aldrich)的水溶液2ml进行充分的分散，制备复合体粒子(MBA NPs)。
评估溶解于水的MB(MB Sol.)和所述分散于水中的复合体粒子(MBA NPs)的吸光度和荧光的图表，从图2可以确认溶解于水的MB的吸收波长和荧光波长随着复合体粒子的形成移往短波长区域。
另外，所述复合体粒子的大小和外形使用马尔文激光粒度仪Zetasiser nano ZS(马尔文仪器,英国)评估粒子的大小，并用透过式电子显微镜(TEM,Tecnai)进行观察，分别如图3(a)和图3(b)所示。通过图3(a)和图3(b)可以确认所述复合体粒子是直径为50到200nm的球形粒子。
所述实施例1中用静电力对亚甲蓝和有机酸进行疏水化，然后在实施例2中可以在水相环境中将亚甲蓝有效充入脂肪酸类油酸内部。在水相环境中两亲性物质内部充入了亚甲蓝的复合体粒子维持粒子状态的稳定性好，通过其大小和外形得到了确认。
实施例3：水相环境中，包括作为光敏剂的亚甲蓝的自组复合体粒子的单态氧产能 的评估
为了将分散于水中的MBS NPs用作用于光动力疗法的光敏剂，在受光源照射的纳米粒子的单态氧产能与MB(MB Sol.)比较后进行了验证。使用的光源是能使MB产生单态氧的633nm波长的光源(Healite II 633,Lutronic Corporation)。
所产生的单态氧的量的测定使用了一种化学方法，使用与单态氧结合后失去了固有的OD max值的N,N-二甲基-4-亚硝基苯胺(N,N-Dimethyl-4-nitrosoaniline，购自Aldrich)。
图4显示了该结果，将内部充入了亚甲蓝的复合体粒子MBD、MBA、MBT、MBS、MBA NPs分别与相同量的MB溶解于水中形成的MB Sol.进行比较，确认了单态氧产能不存在差异。
实施例4：水相环境中含有光敏剂亚甲蓝的自组复合体粒子的金黄色葡萄球菌的 光毒性(photo-toxicity)和暗毒性(dark-toxicity)的评估
(1)用金黄色葡萄球菌评估光毒性
①MBD NPs的光毒性评估
为了评估经实施例1和实施例2后制备的复合体粒子(MBD NPs)在不同浓度下对菌的光毒性影响，在培养盘(12孔培养盘)的各孔内放入分散有1X 106个/ml金黄色葡萄球菌(S.aureus)的培养液(LB培养液)1ml，在各孔内放入0.5ml各浓度纳米粒子(最终浓度40.4mg/mL、20.2mg/mL,8.08mg/mL,4.04mg/mL,0mg/mL)。10分钟后，使用Healite II 633(购自Lutronic Corporation)光照10分钟(Intensity 4)来评估光毒性。光照射后各浓度下的菌稀释为1X 10-6，在菌落总数测试片(Petrifilm，购自3M)上各滴1ml，然后在培养基((37℃)中培养24小时，测定菌落总数。
作为对比实验，准备复合体粒子的各浓度的MB水溶液并经过与所述实施例4(1)①相同的过程测定菌落总数。
另外，为了确认除去光源之外的复合体粒子的单独的细菌毒性，进行暗毒性评估，如实施例4(2)所示。
②MBI NPs的光毒性评估
为了评估经实施例1和实施例2后制备的复合体粒子(MBI NPs)在不同浓度下对菌的光毒性影响，在培养盘(12孔培养盘)的各孔内放入分散有1X 106个/ml金黄色葡萄球菌(S.aureus)的培养液(LB培养液)1ml，在各孔内放入0.5ml各浓度纳米粒子(最终浓度40.4mg/mL、20.2mg/mL,8.08mg/mL,4.04mg/mL,0mg/mL)。10分钟后，使用Healite II 633(购自Lutronic Corporation)光照10分钟(Intensity 4)来评估光毒性。光照射后各浓度下的菌稀释为1X 10-6，在菌落总数测试片(Petrifilm，购自3M)上各滴1ml，然后在培养基((37℃)中培养24小时，测定菌落总数。
作为对比实验，准备复合体粒子的各浓度的MB水溶液并经过与所述实施例4(1)②相同的过程测定菌落总数。
另外，为了确认除去光源之外的复合体粒子的单独的细菌毒性，进行暗毒性评估，如实施例4(2)所示。
③MBT NPs的光毒性评估
为了评估经实施例1和实施例2后制备的复合体粒子(MBT NPs)在不同浓度下对菌的光毒性影响，在培养盘(12孔培养盘)的各孔内放入分散有1X 106个/ml金黄色葡萄球菌(S.aureus)的培养液(LB培养液)1ml，在各孔内放入0.5ml各浓度纳米粒子(最终浓度40.4mg/mL、20.2mg/mL,8.08mg/mL,4.04mg/mL,0mg/mL)。10分钟后，使用Healite II 633(购自Lutronic Corporation)光照10分钟(Intensity 4)来评估光毒性。光照射后各浓度下的菌稀释为1X 10-6，在菌落总数测试片(Petrifilm，购自3M)上各滴1ml，然后在培养基((37℃)中培养24小时，测定菌落总数。
作为对比实验，准备复合体粒子的各浓度的MB水溶液并经过与所述实施例4(1)③相同的过程测定菌落总数。
另外，为了确认除去光源之外的复合体粒子的单独的细菌毒性，进行暗毒性评估，如实施例4(2)所示。
④MBS NPs的光毒性评估
为了评估经实施例1和实施例2后制备的复合体粒子(MBS NPs)在不同浓度下对菌的光毒性影响，在培养盘(12孔培养盘)的各孔内放入分散有1X 106个/ml金黄色葡萄球菌(S.aureus)的培养液(LB培养液)1ml，在各孔内放入0.5ml各浓度纳米粒子(最终浓度40.4mg/mL、20.2mg/mL,8.08mg/mL,4.04mg/mL,0mg/mL)。10分钟后，使用Healite II 633(购自Lutronic Corporation)光照10分钟(Intensity 4)来评估光毒性。光照射后各浓度下的菌稀释为1X 10-6，在菌落总数测试片(Petrifilm，购自3M)上各滴1ml，然后在培养基((37℃)中培养24小时，测定菌落总数。
作为对比实验，准备复合体粒子的各浓度的MB水溶液并经过与所述实施例4(1)④相同的过程测定菌落总数。
另外，为了确认除去光源之外的复合体粒子的单独的细菌毒性，进行暗毒性评估，如实施例4(2)所示。
⑤MBA NP的光毒性评估
为了评估经实施例1和实施例2后制备的复合体粒子(MBS NPs)在不同浓度下对菌的光毒性影响，在培养盘(12孔培养盘)的各孔内放入分散有1X 106个/ml金黄色葡萄球菌(S.aureus)的培养液(LB培养液)1ml，在各孔内放入0.5ml各浓度纳米粒子(最终浓度40.4mg/mL、20.2mg/mL,8.08mg/mL,4.04mg/mL,0mg/mL)。10分钟后，使用Healite II 633(购自Lutronic Corporation)光照10分钟(Intensity 4)来评估光毒性。光照射后各浓度下的菌稀释为1X 10-6，在菌落总数测试片(Petrifilm，购自3M)上各滴1ml，然后在培养基((37℃)中培养24小时，测定菌落总数。
作为对比实验，准备复合体粒子的各浓度的MB水溶液并经过与所述实施例4(1)⑤相同的过程测定菌落总数。
另外，为了确认除去光源之外的复合体粒子的单独的细菌毒性，进行暗毒性评估，如实施例4(2)所示。
(2)用金黄色葡萄球菌进行暗毒性评估
①MBD NPs的暗毒性评估
为了评估经实施例1和实施例2后制备的复合体粒子(MBD NPs)在不同浓度下对菌的光毒性影响，在培养盘(12孔培养盘)的各孔内放入分散有1X 106个/ml金黄色葡萄球菌(S.aureus)的培养液(LB培养液)1ml，在各孔内放入0.5ml各浓度纳米粒子(最终浓度40.4mg/mL、20.2mg/mL,8.08mg/mL,4.04mg/mL,0mg/mL)。各浓度下的菌稀释为1X 10-6，在菌落总数测试片(Petrifilm，购自3M)上各滴1ml，然后在培养基((37℃)中培养24小时，测定菌落总数。作为对比实验，准备复合体粒子的各浓度的MB水溶液并经过与所述实施例4(2)①相同的过程测定菌落总数。所述实施例4(2)①的所有过程均是在切断光源的暗室里进行的。
②MBI NPs的暗毒性评估
为了评估经实施例1和实施例2后制备的纳米粒子(MBI NPs)在不同浓度下对菌的光毒性影响，在培养盘(12孔培养盘)的各孔内放入分散有1X 106个/ml金黄色葡萄球菌(S.aureus)的培养液(LB培养液)1ml，在各孔内放入0.5ml各浓度纳米粒子(最终浓度40.4mg/mL、20.2mg/mL,8.08mg/mL,4.04mg/mL,0mg/mL)。各浓度下的菌稀释为1X 10-6，在菌落总数测试片(Petrifilm，购自3M)上各滴1ml，然后在培养基((37℃)中培养24小时，测定菌落总数。作为对比实验，准备复合体粒子的各浓度的MB水溶液并经过与所述实施例4(2)②相同的过程测定菌落总数。所述实施例4(2)②的所有过程均是在切断光源的暗室里进行的。
③MBT NPs的暗毒性评估
为了评估经实施例1和实施例2后制备的复合体粒子(MBT NPs)在不同浓度下对菌的光毒性影响，在培养盘(12孔培养盘)的各孔内放入分散有1X 106个/ml金黄色葡萄球菌(S.aureus)的培养液(LB培养液)1ml，在各孔内放入0.5ml各浓度纳米粒子(最终浓度40.4mg/mL、20.2mg/mL,8.08mg/mL,4.04mg/mL,0mg/mL)。各浓度下的菌稀释为1X 10-6，在菌落总数测试片(Petrifilm，购自3M)上各滴1ml，然后在培养基((37℃)中培养24小时，测定菌落总数。作为对比实验，准备复合体粒子的各浓度的MB水溶液并经过与所述实施例4(2)③相同的过程测定菌落总数。所述实施例4(2)③的所有过程均是在切断光源的暗室里进行的。
④MBS NPs的暗毒性评估
为了评估经实施例1和实施例2后制备的复合体粒子(MBS NPs)在不同浓度下对菌的光毒性影响，在培养盘(12孔培养盘)的各孔内放入分散有1X 106个/ml金黄色葡萄球菌(S.aureus)的培养液(LB培养液)1ml，在各孔内放入0.5ml各浓度纳米粒子(最终浓度40.4mg/mL、20.2mg/mL,8.08mg/mL,4.04mg/mL,0mg/mL)。各浓度下的菌稀释为1X 10-6，在菌落总数测试片(Petrifilm，购自3M)上各滴1ml，然后在培养基((37℃)中培养24小时，测定菌落总数。作为对比实验，准备复合体粒子的各浓度的MB水溶液并经过与所述实施例4(2)④相同的过程测定菌落总数。所述实施例4(2)④的所有过程均是在切断光源的暗室里进行的。
⑤MBA NPs的暗毒性评估
为了评估经实施例1和实施例2后制备的复合体粒子(MBA NPs)在不同浓度下对菌的光毒性影响，在培养盘(12孔培养盘)的各孔内放入分散有1X 106个/ml金黄色葡萄球菌(S.aureus)的培养液(LB培养液)1ml，在各孔内放入0.5ml各浓度纳米粒子(最终浓度40.4mg/mL、20.2mg/mL,8.08mg/mL,4.04mg/mL,0mg/mL)。各浓度下的菌稀释为1X 10-6，在菌落总数测试片(Petrifilm，购自3M)上各滴1ml，然后在培养基((37℃)中培养24小时，测定菌落总数。作为对比实验，准备复合体粒子的各浓度的MB水溶液并经过与所述实施例4(2)⑤相同的过程测定菌落总数。所述实施例4(2)⑤的所有过程均是在切断光源的暗室里进行的。
所述实施例4(1)光毒性和(2)暗毒性的评估如图5所示。
实施例5：水相环境中用作光敏剂的含有亚甲蓝和水杨酸的自组复合体粒子对痤 疮丙酸杆菌(P.Acnes)的光毒性(photo-toxicity)评估
选择经所述实施例1和实施例2后制备的复合体粒子中单态氧产能率最高的MBSNPs，为了评估在相同光照不同浓度下作用于痤疮丙酸杆菌的光毒性，在培养盘(12孔培养盘)的各孔内放入分散有痤疮丙酸杆菌(P.Acnes)1X 106个/mL的培养液(LB培养液)，在各孔内放入0.5ml各浓度纳米粒子(最终浓度40.4mg/mL、20.2mg/mL,8.08mg/mL,4.04mg/mL,0mg/mL)。10分钟后，使用Healite II 633(购自Lutronic Corporation)光照10分钟(Intensity 4)。光照结束后，对各浓度下的菌使用Live/
Figure BDA0001488232330000212
BacLightTM BacterialViability Kits染色并稀释为1X 10-6，96孔培养盘的各孔里分别装入200ml，测定其荧光(IVIS-Spectrum),用荧光图像ROI值计算活菌的荧光量。对实施例5痤疮丙酸杆菌的图像和光毒性评估如图6a和6b所示，所述实施例5的所有过程均在切断光源的暗室里进行。
根据本发明，光疗用复合体粒子(MBX NPs)与传统的光感治疗剂ALA、MAL等的使用效果的对比如下表所示。
如下表所记录的，在治疗痤疮等皮肤病时，与使用传统的光感治疗剂ALA、MAL相比，本发明使用光疗用复合体粒子看不出显著的疗效，但等待时间比传统的治疗药剂短，副作用小，以及为了治疗后患者的日常生活的避光期与ALA、MAL相比明显更短等是一目了然的。
表1
Figure BDA0001488232330000211
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于皮肤病光疗的亚甲蓝复合体，其特征有：是由亚甲蓝和两种有机酸组成的复合体，所述复合体的所述亚甲蓝粒子和第一种有机酸位于中心，第二种有机酸为脂肪类有机酸，脂肪类有机酸位于外部并形成胶束状；
所述第一种有机酸选自二十二碳六烯酸、吲哚-3-乙酸、凝血酸、水杨酸、抗坏血酸、亚油酸、亚麻脂酸、脱氧胆酸、叶酸、视黄酸、胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸钠、牛磺鹅去氧胆酸、石胆酸、双水杨酯、乙酰水杨酸,水杨酸甲酯、苯醋酸中的一种；
脂肪类有机酸为油酸。
2.根据权利要求1所述的亚甲蓝复合体，其特征有：用所述复合体进行皮肤病光疗时，涂抹所述复合体后的等待时间在0-1小时以内，治疗后避光期在0秒至3小时以内。
3.根据权利要求1或2所述的亚甲蓝复合体，其特征有：所述复合体的直径在50nm以上100μm以下。
4.根据权利要求1或2所述的亚甲蓝复合体,其特征有：所述皮肤病是由金黄色葡萄球菌或痤疮丙酸杆菌引起的。
5.根据权利要求1所述的亚甲蓝复合体,其特征有：所述亚甲蓝和两种有机酸的质量比为，第一种有机酸的质量是亚甲蓝的1至5倍，第二种有机酸的质量是亚甲蓝和所述第一种有机酸形成的复合体的质量的50至500倍。
6.一种皮肤病光疗用组成物，其特征有：包含亚甲蓝复合体，所述亚甲蓝复合体是由亚甲蓝和两种有机酸组成的复合体，所述复合体包含所述位于中心亚甲蓝粒子和第一种有机酸位于中心，第二种有机酸为脂肪类有机酸，脂肪类有机酸位于外部并形成胶束状；
所述第一种有机酸选自二十二碳六烯酸、吲哚-3-乙酸、凝血酸、水杨酸、抗坏血酸、亚油酸、亚麻脂酸、脱氧胆酸、叶酸、视黄酸、胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸钠、牛磺鹅去氧胆酸、石胆酸、双水杨酯、乙酰水杨酸,水杨酸甲酯、苯醋酸中的一种；
脂肪类有机酸为油酸。
7.根据权利要求6所述的组成物，其特征有：使用所述组成物进行皮肤病光疗时，涂抹所述纳米粒子后，等待时间在0秒到1小时以内，治疗后避光期在0秒到3小时之内。
8.根据权利要求6所述的组成物，其特征有：所述亚甲蓝复合体的直径在50nm以上100μm以下。
9.根据权利要求6所述的组成物，其特征有：所述皮肤病是由痤疮丙酸杆菌或金黄色葡萄球菌引起。
10.根据权利要求6或9所述的组成物，其特征有：所述亚甲蓝和两种有机酸的质量比为，第一种有机酸质量是亚甲蓝的1至5倍，第二种有机酸的质量是亚甲蓝和所述第一种有机酸形成的复合体的质量的50至500倍。
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