CN108486128B - 丝瓜果实苦味基因LaBt及用于果实苦味性状辅助选择的分子标记 - Google Patents

丝瓜果实苦味基因LaBt及用于果实苦味性状辅助选择的分子标记 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及有棱丝瓜苦味位点LaBt的基因组序列、CDS序列、蛋白质序列，对应位点的普通丝瓜基因组序列，依据上述有棱丝瓜、普通丝瓜间序列差异发展的多态标记及应用。本发明通过分子标记技术，构建丝瓜的遗传连锁图谱，定位了丝瓜苦味基因LaBt，获得与LaBt基因共分离的InDel分子标记LuBt1‑2，建立了分子标记辅助选择体系，并最终获得了该位点的基因组序列。本发明有助于实现丝瓜果实苦味性状的分子标记辅助选择，克服感官品尝鉴定果实苦味方法的缺点，省时省力。

Description

丝瓜果实苦味基因LaBt及用于果实苦味性状辅助选择的分子 标记
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及克隆的有棱丝瓜果实苦味位点LaBt的基因组序列、对应位点普通丝瓜的基因组序列、两者之间的SNP及InDel差异信息及应用、新开发的用于遗传图谱构建的SSR标记及精细定位标记、鉴定有棱丝瓜苦味性状的InDel分子标记LuBt1-2及其引物和应用。
背景技术
丝瓜是葫芦科蔬菜重要作物之一，在我国普遍栽植的有棱丝瓜[Luffaacutangula(L.)Roxb.]以及普通丝瓜[Luffa cylindrica(L.)Rome.]两个亚种，各自具有许多优良性状，如有棱丝瓜果肉脆、不褐变，普通丝瓜产量高、抗性强。有棱丝瓜与普通丝瓜都不苦，都能食用，但两个亚种杂交会产生苦味，说明两个亚种中含有不同的、使苦味合成途径完整的互补基因。因为苦味给消费者带来不利的健康影响，从而为丝瓜两个种间优良基因的综合利用带来麻烦，因此，丝瓜选育种中需要剔除苦味这一性状。
在育种工作中，目前国内外广大育种科学家只能用感官品尝来鉴定丝瓜苦味的存在与否。
通常的工作程序为：果实达到商品果时，对成熟瓜近果柄处果肉进行品尝，由3名志愿者独立进行品尝、记录，相互之间不透露自己的结果避免相互干扰。为了减少前面果实苦味物质在口腔残留影响下一个果实的鉴定，要求志愿者在品尝每一个果实后都用清水进行漱口；为了避免味蕾工作疲劳，每天鉴定的果实数量不超过40个。3人出现分歧时找味觉未被干扰的第四人或者第五人鉴定，最后确定果实苦味与否。
感官品尝果实苦味与否方法的主要缺点为：
1)鉴定比较费时费力；
2)各品尝者对苦味的敏感性不同；而且味蕾容易出现工作疲劳，导致鉴定结果常常不一致；
3)只能在果实阶段进行鉴定，在种子、幼苗或植株阶段不能鉴定，不能提前淘汰结苦味果实的植株；
4)植株所结果实苦味的出现容易受环境的影响，有时苦有时不苦，导致鉴定不准确。
因此，克隆果实苦味基因、阐明果实苦味的分子机理，开发新的丝瓜苦味性状鉴定方法，对于丝瓜育种具有紧迫而重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供有棱丝瓜果实苦味基因、建立有棱丝瓜果实苦味性状的分子标记辅助选择体系。
本发明的目的还在于提供上述有棱丝瓜果实苦味位点的基因组序列及普通丝瓜对应位点的基因组序列。
本发明的目的还在于提供一种效率高、准确率高、以及成本低的丝瓜果实苦味位点的鉴定方法以及引物。
本发明的目的还在于实现有棱丝瓜果实苦味位点的分子标记辅助育种，指导丝瓜育种实践工作，同时在分子水平上揭示丝瓜果实苦味遗传规律。
本发明的上述目的通过以下技术手段实现：
本发明主要是应用分子标记技术寻找与有棱丝瓜果实苦味性状的分子标记，通过图位克隆法、同源克隆法克隆有棱丝瓜果实苦味位点的基因组序列。
一方面，本发明定位了有棱丝瓜苦味基因，将其命名为LaBt，其位于丝瓜遗传连锁图谱的连锁群6上的标记SGE292与SGC196之间，与两个标记的遗传距离分别为6.3cM、3.0cM，其具有SEQ IDNO.137所示的核苷酸序列。
另一方面，本发明还提供了有棱丝瓜果实苦味基因LaBt的CDS序列，其具有SEQ IDNO.139所示的核苷酸序列。
另一方面，本发明还提供了对应于有棱丝瓜果实苦味基因LaBt位点的普通丝瓜的基因组序列，其具有SEQ ID NO.138所示的核苷酸。
另一方面，本发明还提供了SEQ IDNO.137和SEQ IDNO.138所示的核苷酸序列编码的蛋白。其中，SEQ ID NO.137编码的蛋白具有SEQ ID NO.140所示的氨基酸序列。
另一方面，本发明还提供了一种筛选丝瓜苦味性状相关的分子标记方法，其在于通过比较核苷酸序列SEQ ID NO.137及SEQ ID NO.138的差异性位点，可获得丝瓜苦味性状相关的分子标记位点。其中，所述的分子标记可为SNP分子标记位点或者InDel位点。
另一方面，本发明还提供了丝瓜苦味性状的分子标记，其为SEQ ID NO.137及SEQID NO.138的差异性位点中的至少一个。
作为一种示范性的实施方式，所述的分子标记为InDel分子标记，将命名为LuBt1-2，其具有由SEQ ID NO.133所示的核苷酸序列。
另一方面，本发明还提供了检测InDel分子标记：LuBt1-2的引物对，上游引物如SEQ ID NO.127所示，下游引物如SEQ ID NO.128所示。该引物对的LuBt1-2标记扩增带型清晰、共显性，能够特异性地标记有棱丝瓜果实苦味基因LaBt。另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，其含有SEQ ID NO.127，SEQ ID NO.128所示的引物对。
另一方面，本发明还提供了一种检测丝瓜苦味基因LaBt的方法，其为采用SEQ IDNO.127，SEQ ID NO.128所示的引物对进行PCR扩增待检测丝瓜基因组DNA，如果能够扩增出SEQ ID NO.133所示的片段，则说明该待检丝瓜存在苦味基因LaBt。如果，扩增产物具有SEQID NO.134所示的核苷酸序列。则说明该待检丝瓜不存在苦味基因LaBt，其为普通丝瓜。
另一方面，本发明还提供了上述的多核苷酸/蛋白/分子标记/引物对/试剂盒/方法在丝瓜育种中的应用。
本发明应用分子标记技术寻找到与有棱丝瓜果实苦味位点连锁的分子标记，首次克隆到该位点的基因组序列，有助于对丝瓜果实苦味性状进行分子标记辅助选择，克服感官品尝鉴定果实苦味方法的缺点，省时省力；最终实现有棱丝瓜、普通丝瓜有用性状的综合。
本发明带来的有益效果：
(1)综合有棱丝瓜、普通丝瓜优良性状变得更容易，利用分子标记跟踪、剔除LaBt位点就能使杂交后代不出现苦味，果实因此可以实用。
(2)选择效率高：在育种过程中，利用该标记进行辅助选择，可以在幼苗阶段就将可能产生苦味果实的植株排除掉，无需等到果实成熟期，从而节省人力物力，提高育种效率。
(3)准确可靠：分子标记主要通过PCR及电泳检测，不受人为主观因素影响，也不受气候条件对苦味表现的影响，因而完全是客观的评价。
(4)成本低：分子标记鉴定的成本为0.5元/样本(按2017年物价)，非常便宜，降低了鉴定成本。
附图说明
图1丝瓜遗传图谱及有棱苦味基因LaBt初定位；
图2有棱丝瓜苦味LaBt基因精细定位局部连锁图；
图3有棱丝瓜、普通丝瓜间LaBt位点基因组序列比对；注：4为有棱丝瓜，48为普通丝瓜。
具体实施方式
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
实施例1丝瓜果实苦味鉴定及遗传分析
利用多代自交材料4-0-0-0做母本(P1，不苦，有棱，后简称4)、48-1-0-0做父本(P2，不苦，无棱，后简称48)，杂交获得F1(4×48)、再进行回交(48×4)×48获得回交群体BC1。对F1及回交群体BC1的果实苦味用感官品尝方法鉴定表型：F1全部表现苦味，87株回交后代材料里41份表现为不苦，41份表现为苦，有5份由于果实过于衰老苦味难以判断或者是未挂果造成数据缺失(表1)。经卡方测验，实际比值符合理论比值的1：1，证明有棱丝瓜中存在一个单显性苦味基因，命名为LaBt。
其中感官品尝方法为：
果实达到商品果时，对各单株成熟瓜近果柄处果肉进行品尝，由3名志愿者独立进行品尝、记录，相互之间不透露自己的结果避免相互干扰，并且每次品尝完一条瓜后都要用矿泉水进行漱口。3人出现分歧时找味觉未被干扰的第四人或者第五人鉴定，最后确定瓜条苦味与否。
葫芦科作物苦味的表现受多种因素的影响，包括内在遗传因素、外在环境因子的影响。黄瓜苦味的相关研究较为深入，高温高湿会造成苦味(顾兴芳等，2000；李宗扬等，2013；Aleksi et al.,2014)，但具体影响机制还未清楚明确，还没有看到具体某一环境条件或某一指标对苦味造成影响的详细研究。
选择果实苦味鉴定时期及部位十分重要，经过多次的品尝以及鉴定，本试验发现：1)嫩瓜与商品瓜苦味差异非常大，嫩瓜苦味较淡或者没有苦味，不能反映商品口感的真实情况，商品果期苦味基本表现，果实纤维化初期苦味更浓。本试验选取商品果时期鉴定苦味，在黄瓜上国内外研究者也多选择在这个时期进行鉴定苦味(Davidovich-Rikanati etal.,2014；顾兴芳等，2006)。2)靠近果把部位的果肉比中部的果肉苦味更重，可能原因是苦味物质在植株叶部合成，向果实运输，苦味物质在果把部位的累积浓度大一些。因此本发明采用商品果时期的近果柄处处果肉进行鉴定。
表1亲本、F1以及回交群体果实苦味鉴定
Figure BDA0001570892770000041
实施例2利用SRAP及SSR标记构建丝瓜遗传图谱构建
1.引物筛选
从发明人课题组开发的引物及前人研究结果(Wu et al.,2014)的引物中挑选192对SSR引物在亲本材料‘4’与‘48’上进行PCR扩增，从中挑选出90对共显性、扩增稳定、重现性好的SSR引物供遗传作图使用。利用324对SRAP引物组合在亲本材料上扩增后筛选获得36对具有多态性、条带清晰的SRAP引物组合。
丝瓜SSR扩增体系为10μL，含：DNA模板5ng/μL，正、反向引物各0.1μmol/L，1×TaqBuffer(含Mg2+)，dNTPs 0.1mmol/L。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，36个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。
发明人课题组开发的在有棱丝瓜及普通丝瓜间有多态的SSR引物见表2，其余引物参考前人研究结果(Wu et al.,2014)中的引物。
Figure BDA0001570892770000051
丝瓜SRAP扩增体系为10μL，含：DNA模板5ng/μL，正、反向引物各0.3μmol/L，1×TaqBuffer，dNTPs 0.1mmol/L。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸1min，5个循环；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。丝瓜SRAP扩增所应用的引物见表3，上游引物和下游引物随机配对扩增。
表3丝瓜SRAP扩增引物
Figure BDA0001570892770000061
2.利用SRAP及SSR标记构建丝瓜遗传图谱
利用筛选获得的具有多态性的36对SRAP及90对SSR标记对回交群体87个单株扩增，利用JoinMap3.0软件构建了一张分子连锁图谱(图1)。该图谱整合了33个SRAP、79个SSR标记，其他标记未被整合进连锁群，共包含13个连锁群，覆盖遗传距离总长为741.96cM，标记的平均间距是6.62cM，单个连锁群的长度为17.79～81.36cM，最长连锁群为LG2，最短连锁群为LG13，标记数目介于2～14个。
实施例3有棱丝瓜果实苦味基因LaBt的定位
1.有棱丝瓜果实苦味基因LaBt的初步定位
将丝瓜果实苦味性状作为一个标记LaBt，与其他标记一起进行共分离分析，将LaBt基因定位在连锁群6上的标记SGE292与SGC196之间，与SGE292间隔距离约6.3cM，与SGC196的间隔距离在3.0cM。
2.有棱丝瓜果实苦味基因LaBt的精细定位
利用生物信息学分析，将发展标记SGE292与SGC196的来源序列通过序列比对锚定到黄瓜的基因组上，再从黄瓜基因组网站下载两个标记间的黄瓜序列，查找资料发现，黄瓜上在该区域定位到一个苦味相关基因Csa1G044890，基因功能为细胞色素P450。将Csa1G044890基因的核苷酸序列在NCBI数据库中与甜瓜、西瓜的序列进行比对，在序列保守区域设计了7对引物；同时，利用Blastn软件将黄瓜基因组序列与有棱丝瓜及无棱丝瓜转录组测序的数据比对，获得定位区段内在有棱丝瓜及无棱丝瓜间序列可能具有多态的SNP及InDel位点，锚定这些SNP及InDel位点设计了17个标记(见表4)。
用两个亲本检测以上标记的多态性，有14对引物具有多态性，利用定位群体构建局部连锁图，2个标记未整合进图谱，12个标记构建的连锁图如图2所示。从图2中可以看出根据Csa1G044890基因发展的标记LuBt1A、LuBt1-2与苦味基因LaBt共分离，据此推测丝瓜上存在一个与黄瓜基因Csa1G044890同源的基因控制有棱丝瓜果实苦味，其可能就是LaBt基因。
Figure BDA0001570892770000081
3.共分离标记扩增产物测序
将LuBt1-2在有棱丝瓜及无棱丝瓜上的扩增产物送公司测序，证实扩增产物大小有棱为216bp、无棱为186bp，扩增产物的序列如下。
有棱丝瓜序列SEQ ID NO.133：
ACATTATAAACACTCGTAACCGCTTTTAAAATAATTGCTGGCAGTTATGTTTTTGAAAAAAAAAATTGTTGTTATATGAAGTAAATAAATGTTAGAAGTAAGATAAAATGAGAATTCAAAAAAGTTTGTTAGGTTAAAAGTGACATCAAAATTAGTTTTATCCAACACTAATAACAGTTAAAATTCTCTCACAATCTCGCTTTTAATGTAAGCAAA；
无棱丝瓜序列SEQ ID NO.134：
ACATTATAAACACTCGTAACCGCTTTTAAAATAATTGATGGCAGTTATGTTTCAAGTAACTAAGTGTTAGAAATATGATAAAATGAGAATTCAAAAAAGTTTGTTAGGAGTGGCATCAGAATTAGTTTTATCAAATGCTAATAACAGTTAAAATTCTCTCGCAATCTCGCTTTTAATGTAAGCAAA。
实施例3有棱丝瓜果实苦味基因LaBt的全基因组序列克隆
为了扩增出全长的LaBt基因序列，根据Csa1G044890基因上下游黄瓜、甜瓜的保守序列设计引物LaBt，其正向引物序列为SEQ ID NO.135
GGGCTTGTCTTCTGATTGGAAA，反向引物序列为SEQ ID NO.136
CAAAGGAAGAAGAAAATAGTAGTACAAGTAG。该引物对在有棱丝瓜、普通丝瓜基因组DNA上都能有效扩增，大小约为3kb。
利用TA克隆法将PCR产物连接到质粒中，分别送2个公司测序全长，获得LaBt基因的有棱丝瓜、普通丝瓜的基因组序列全长。
有棱丝瓜LaBt位点的基因组序列为SEQ ID NO.137：
GGGCTTGTCTTCTGATTGGAAAATTATATCGAACATACGATGTGGACGATCGTGCTCGGTTTGGCGACG CTGGCAATCGCCTACTACATCCATTGGATCAACAAATGGAGGGATTCAAAATTCAACGGAGTTCTGCCACCAGGCAC CATGGGCCTGCCCCTCATCGGAGAGACCATTCAGTTGAGTCGACCCAGTGACTCCCTTGACGTTCACCCTTTCATTC AAAGCAAAGTTAAAAGGTATTTTTATTATTGTTATAAACCTTATAAACACTCGTAACCGCTTTTAAAATAATTGCTGGCAGTTATGTTTTTGAAAAAAAAAATTGTTGTTATATGAAGTAAATAAATGTTAGAAGTAAGATAAAATGAGAATTCAAAAAAGTTTGTTAGGTTAAAAGTGACATCAAAATTAGTTTTATCCAACACTAATAACAGTTAAAATTCTCTCACAATCTCGCTTTTAATGTAAGCAAAATCAATCCCGAATTAGGTCATCAAGTCAAATCGAAAATTTTTTTAACAACAATAATAGACGAAGAACTAAAACATATATTTAGCGGGATAATTAAAATTAAAATTAAAATTGGGGAAAATGTGATGGTTTTTAGGTATGGACCAATCTTCAAGACATGTTTGGCGGGAAGGCCGGTGGTGGTTTCAACAGATGCAGAGTTCAACCATTA CATAATGTTGCAAGAAGGAAGGGCTGTGGAAATGTGGTATTTGGATACACTCTCCAAATTCTTTGGCCTTGACACTG AGTGGCTCAAAGCCCTTGGCCTCATCCACAAGTACATCAGAAGCATTACTTTGAACCACTTCGGTGCCGAGTCGCTC CGCGAGCGCTTTCTTCCTCGTATCGAAGAATCCGCTAGGGAAACCCTTCATTATTGGTCCACTCAATCCAGCGTTGA AGTCAAAGACTCCGCCGCTGCGGTATGTCAATTCCTTAACCTAATTTAATATCTGATGTGAGATCTCCAACATGTCTCCTCAAAGATAAATCGAGTTTAGTACTGATTTAAAGAATAATTCTCTTTGCTGAATTTTGCAGATGGTCTTCAGAAC TTCGGTGGCTAAGATGTTTAGCGAAGATTCGAGTAAATTACTGACAGGTGGTCTCACCAAGAAGTTCACTGGACTTC TCGGAGGTTTTCTCACTCTGCCTCTAAACTTGCCTGGCACCACTTACAACAAGTGCATGAAGGTGATTAGCAGAACTATCGCTCGATCATAAAGCTTAAACTAATGGGTTATGTTCATTCTATCGACTACGAAATATTCAATTTTTGATTTTTTCTTTTAATTTTTGGATAACTCTAGGACATGAAGGAAATCCAAAAGAAGCTCAAAGATATCTTAGAGGACAGGTTGGC TTCAGGGGCAGGTAGTGATGAGGATTTCTTGGGGCAGGCCATTAAAGATAAGGAATCACAAAAGTTCATCTCAGAGG AATTCATCATCCAATTGTTGTTTTCCATCAGCTTTGCTAGCTTTGAGTCCATCTCCACCACTCTCACTTTGATTCTC AACTTCCTCGCCGATCATCCCGACGTAGTGAAAGAGTTGGAAGTAAGACCCGAAAGACACTTAAAAAAAAAAATTATTCGATGAGGCTGGAACAATGTGACTGTTTCATACGTCGTTGGATGTTAAAGGAGAATTTAAAAATCGTGTGCTTTAATTTTACATCCATCGCTTAAGAGACAACCACGTCGTCGTAACAACCCCGTTAAATAATTTTTTTTTTTTTCACTAATGAATATTTACTAAGTTGTGTTGATGATTTTAATGTATATTTTGTTGTGTGTTTAAAGGCTGAGCATGAAGCCATCAGA AAAGCAAGGGCAGATCCAGATGGACCAATCACTTGGGAAGAATACAAATCCATGACTTTCACACTTAATGTAATATTTAAATCTTTTATATATACAATTTGTCAATTTCTTGTTAATTTCTTTTTCCAATTTGATAACATTTTTTTTTCTTTTGTCTATTTTGGATTCTAGGTTATCAGTGAAGCACTTAGGTTGGGGAGTGTAACACCTGCCTTGTTGAGGAAAACAACC AAAGAAATTCAAATTAAAGGTAAAAAAAATAATTTTACCGTATTTTGTTAAATACGGTTGTTATCGTATCAATTAATTGAGATGCTATATTCATATTAATTTAACTGATTCACTAATTTGCATTTGATTAATATATAGGATACACAATTCCCGA AGGATGGACGGTTATGCTTGTCACTGCTTCTCGTCACAGAGACCCAGCAGTCTACAAGGACCCTGATACCTTCAATC CATGGCGTTGGAAGGTAGACCCTAAAAATAAAAAGGACAAAAAAAAACCATAATAAATACATTTTCTAATATACTTCTAATTAATTAATTGTTAACACAAAATGCTAACTTTGTTTTAAATCATTATGGATATATCATAGGACTTGGACTCAAT TACTGTTCAAAAGAACTTCATGCCATTTGGAGGAGGTTTAAGGCATTGTGCTGGTGCTGAGTACTCTAAAGTCTACT TGAGCACCTTCCTCCATATCCTTTTCACCAAATACAGGTGCGTAGTCTATAAGTTCAGGCTTCGTTTGATAACGATTTTGTTTTAGTTTTCTGCTTCTTTCATTTCTTTACTGTAATTTTCACTTTTTTAGGGACATTGGAATTCTCAGCCAAATTCCAAAAATAAAAATAAATTTTTAAAGACTACTTTTTTAGTTTTCAAAAAATAGATAACAAAAAAAAAAAAATGTTGTGAAATGGGGTTAAGTTTTCAAATTTATTAGTAATTTAACATTAGTATATAAGATAGTTTAATTATGTGTATATATACAATCTCATTTAATTTTAATTTTGATAGATGGACCAAACTTAAGGGAGGAAAGATTGCAAGAGCTCATATATTGAA GTTTGAAGATGGGCTACATGTGAAGTTCACTCCCAAGGAATGATTGAATAAATTAAAAAAAAAAAAAATGTCATTTCTATTATTCTTATGGGATCATCTACTTGTACTACTATTTTCTTCTTCCTTTG
对应位点普通丝瓜基因组序列为SEQ ID NO.138：
GGGCTTGTCTTCTGATTGGAAAATTATATCGAAGATACGATGTGGACGATCGTGCTCGGTTTGGCGACGCTGGCAATCGCCTATTACATCCATTGGATCAACAAATGGAGGGATTCAAAATTCAACGGAGTTCTGCCGCCAGGCACCATGGGCCTGCCCCTCATCGGAGAGACCATTCAGTTGAGTCGACCCAGTGACTCCCTTGATGTTCACCCTTTCATTCAGAGCAAAGTTAAAAGGTATTTTTAATTATTATTGTTATAAACATTATAAACACTCGTAACCGCTTTTAAAATAATTGATGGCAGTTATGTTTCAAGTAACTAAGTGTTAGAAATATGATAAAATGAGAATTCAAAAAAGTTTGTTAGGAGTGGCATCAGAATTAGTTTTATCAAATGCTAATAACAGTTAAAATTCTCTCGCAATCTCGCTTTTAATGTATGCAAAATCAATCCTGAATTAGGTCATATAATCAATTCAAACGTTAAACTACGAGTCAAATCGAAAATTTTTGAACAACAATAATAGACGAAGAACTAAAACATATATTTAGCGGAATTAATTAAATTAAAATTTAAATTGGGGGAAATGTGATGGTTTTTAGATATGGACCAATCTTCAAGACATGTTTGGCGGGAAGGCCGGTGGTGGTTTCAACAGATGCAGAGTTCAACCATTACATAATGTTGCAAGAAGGAAGGGCTGTGGAAATGTGGTATTTGGATACACTCTCCAAATTCTTTGGCCTTGACACTGAGTGGCTCAAAGCCCTTGGCCTCATCCACAAGTACATCAGAAGCATTACTTTGAACCACTTCGGCGCCGAGTCGCTCCGCGAGCGCTTTCTTCCTCGTATCGAAGAATCCGCTAGGGAAACCCTTCATTATTGGTCCACTCAATCCAGCGTTGAAGTCAAAGAATCTGCTGCTGCGGTATGTCAATTTCCTTAACCTAACCAATATCTGATGTGAGATCCCCAACATGTTCCTAAAAGATAGATCGAGTTTAGTACTAGTTTAAGAATAATTCTCTTTGTTGAATTTTGCAGATGGTCTTCAGAACTTCGGTGGCTAAGATGTTTAGTGAAGATTCGAGTAAATTACTGACAGGCGGTCTCACCAAGAAGTTCACCGGACTTCTCGGAGGTTTTCTCACTTTGCCTCTAAATTTGCCTGGCACCACTTACAACAAATGCATGAAGGTGATTATCAGAGCTATCGCTCGATCATAAAGCTTAAACTAGTGGATTATGTTCATTATGCCAAGAACGAAATATTCAATTTTTAAAATATTTTTTTTTAATTTTTGGATGACTCTAGGACATGAAGGAAATCCAAAAGAAGCTGAAAGATATTTTAGAGGACAGGTTGGCTTCAGGGGCAGGTAGTGATGAGGATTTCTTGGGGCAGGCCATTAAAGATAAGGAATCACAAAAGTTCATCACAGAGGAATTCATCATCCAATTGTTGTTTTCCATCAGCTTTGCTAGCTTTGAGTCCATCTCCACCACTCTCACTTTGATTCTCAACTTCCTCGCCGGTCATCCGACGTAGTGAAAGAGTTGGAAGTAAGACCCGAAAGACACTTAAAAAAAAATTATTCGATGAGGCTGGAACAATGTGACTGTTTCATACGTCGTTGGATGTTAAAGGAGAAATTAAAAATCGTGCTTTAATTTTACATCCAACGCTTAAGGGACAACCACGTCGTAACAGCCACGTTAAATAGTTTTTTTTTTCACTAATGAATATTTACTAAGTTTTGTGGATGATTTTAATGTATATTTTGTTGTGTGTTAAAGGCTGAGCATGAAGCCATCCGAAAAGCTAGGGCAGATCCAGATGGGCCAATCACTTGGGAAGAATACAAATCCATGACTTTCACACTTAATGTAATATTTAAATCTTTTATATATACAATTTGTCAATTTCTTGTTCATTTCTTTTTCCAATTTGATAACTTTTTTTTTTCTTTTGTCTATTTTGGATTCTAGGTTATCAGTGAAGCACTTAGGTTGGGGAGTGTAACACCTGCCTTGTTGAGGAAAACAACCAAAGAAATTCAAATAAAAGGTATAAAAAATAATTAATTTTATGGTATTTTGTTAAATACGGTTGTTATCGTATCAATTAATTGAGATGCTATATTCATAGTAATTAACTGATTCACTCATTTGCATTTGATTAATATAGGATACACGATCCCAGAAGGATGGACGGTTATGCTTGTCACTGCTTCTCGTCATAGAGACCCAGCAGTCTATAAGGATCCAGATACCTTCAATCCATGGCGTTGGAAGGTACACCCTAAAAATAAAAAGAAAGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCATAATAAATACATTTTCTAATATACTTCTAATTAATTAATTGTTAACACAATGCTAACTTTGTTTTAAATCATTATGGATATATCATAGGACTTGGACTCAATTACTGTTCAGAAGAACTTCATGCCATTTGGGGGAGGCTTAAGGCATTGTGCTGGTGCTGAGTACTCTAAAGTCTACTTGAGCACCTTCCTCCATATCCTTTTCACCAAATACAGGTGCGTAGTCTATAATTTCAGGTTTCGTTTGATAACGATTTTGTTTTAATTTTTTGTTTCTATTATTTCTTTACCGTGATTTTCACCTTTTTTTAGGAGCATTAAAATTCTCAGCCAAATTCCAAAAATAAAGATAAAATTTTAAAGGCTATTGTTTTAGTTTTCAAATTTTAGTTTGGATTTTTAAAACATTTTTAAAAAATAGATAGAAAATTGTTATGAAATGGGGTTAAGTTTTCAAATTTATTAGTAATTTAACATTAGTATATAAGATAGTTTAATTGTGTATATATACAATCTAATTTAATTTAAATTTTGATAGATGGACCAAACTCAAGGGAGGAAAGATTGCAAGAGCTCATATATTGAAGTTTGAAGATGGGCTACATGTGAAGTTCACTCCCAAGGAATGATTGAATAAATTCAAAAAAAAAAAATGTCATTTCTATTATTCTTATGGGATCACCTACTTGTACTACTATTTTCTTCTTCCTTTG
利用NCBI数据库预测有棱丝瓜苦味基因LaBt的CDS序列为SEQ ID NO.139：ATGTGGACGATCGTGCTCGGTTTGGCGACGCTGGCAATCGCCTACTACATCCATTGGATCAACAAATGGAGGGATTCAAAATTCAACGGAGTTCTGCCACCAGGCACCATGGGCCTGCCCCTCATCGGAGAGACCATTCAGTTGAGTCGACCCAGTGACTCCCTTGACGTTCACCCTTTCATTCAAAGCAAAGTTAAAAGGTATGGACCAATCTTCAAGACATGTTTGGCGGGAAGGCCGGTGGTGGTTTCAACAGATGCAGAGTTCAACCATTACATAATGTTGCAAGAAGGAAGGGCTGTGGAAATGTGGTATTTGGATACACTCTCCAAATTCTTTGGCCTTGACACTGAGTGGCTCAAAGCCCTTGGCCTCATCCACAAGTACATCAGAAGCATTACTTTGAACCACTTCGGTGCCGAGTCGCTCCGCGAGCGCTTTCTTCCTCGTATCGAAGAATCCGCTAGGGAAACCCTTCATTATTGGTCCACTCAATCCAGCGTTGAAGTCAAAGACTCCGCCGCTGCGATGGTCTTCAGAACTTCGGTGGCTAAGATGTTTAGCGAAGATTCGAGTAAATTACTGACAGGTGGTCTCACCAAGAAGTTCACTGGACTTCTCGGAGGTTTTCTCACTCTGCCTCTAAACTTGCCTGGCACCACTTACAACAAGTGCATGAAGGACATGAAGGAAATCCAAAAGAAGCTCAAAGATATCTTAGAGGACAGGTTGGCTTCAGGGGCAGGTAGTGATGAGGATTTCTTGGGGCAGGCCATTAAAGATAAGGAATCACAAAAGTTCATCTCAGAGGAATTCATCATCCAATTGTTGTTTTCCATCAGCTTTGCTAGCTTTGAGTCCATCTCCACCACTCTCACTTTGATTCTCAACTTCCTCGCCGATCATCCCGACGTAGTGAAAGAGTTGGAAGCTGAGCATGAAGCCATCAGAAAAGCAAGGGCAGATCCAGATGGACCAATCACTTGGGAAGAATACAAATCCATGACTTTCACACTTAATGTTATCAGTGAAGCACTTAGGTTGGGGAGTGTAACACCTGCCTTGTTGAGGAAAACAACCAAAGAAATTCAAATTAAAGGATACACAATTCCCGAAGGATGGACGGTTATGCTTGTCACTGCTTCTCGTCACAGAGACCCAGCAGTCTACAAGGACCCTGATACCTTCAATCCATGGCGTTGGAAGGACTTGGACTCAATTACTGTTCAAAAGAACTTCATGCCATTTGGAGGAGGTTTAAGGCATTGTGCTGGTGCTGAGTACTCTAAAGTCTACTTGAGCACCTTCCTCCATATCCTTTTCACCAAATACAGATGGACCAAACTTAAGGGAGGAAAGATTGCAAGAGCTCATATATTGAAGTTTGAAGATGGGCTACATGTGAAGTTCACTCCCAAGGAATGA
有棱丝瓜苦味基因LaBt的蛋白序列为SEQ ID NO.140：
MWTIVLGLATLAIAYYIHWINKWRDSKFNGVLPPGTMGLPLIGETIQLSRPSDSLDVHPFIQSKVKRYGPIFKTCLAGRPVVVSTDAEFNHYIMLQEGRAVEMWYLDTLSKFFGLDTEWLKALGLIHKYIRSITLNHFGAESLRERFLPRIEESARETLHYWSTQSSVEVKDSAAAMVFRTSVAKMFSEDSSKLLTGGLTKKFTGLLGGFLTLPLNLPGTTYNKCMKDMKEIQKKLKDILEDRLASGAGSDEDFLGQAIKDKESQKFISEEFIIQLLFSISFASFESISTTLTLILNFLADHPDVVKELEAEHEAIRKARADPDGPITWEEYKSMTFTLNVISEALRLGSVTPALLRKTTKEIQIKGYTIPEGWTVMLVTASRHRDPAVYKDPDTFNPWRWKDLDSITVQKNFMPFGGGLRHCAGAEYSKVYLSTFLHILFTKYRWTKLKGGKIARAHILKFEDGLHVKFTPKE-
将有棱丝瓜LaBt基因序列与普通丝瓜的对应序列比对，结果见附图3，从比对结果可以看出在普通丝瓜中LaBt基因的第907位碱基缺失，导致编码框移位，终止密码子提前出现，普通丝瓜因基因短截而失去功能。
实施例4丝瓜苦味性状的分子标记辅助选择
从(48×4)×48的回交后代种子中随机挑选40粒重新播种，先用LuBt1-2分子标记方法预测每个植株所结果实苦味与否，结果期取果实用感官品尝方法鉴定表型，结果表明，符合率为100％。据此，我们发展了一个用于选择有棱丝瓜果实苦味基因LaBt的分子标记LuBt1-2。
分子标记方法预测每个植株所结果实苦味的具体步骤为：1)播种丝瓜种子；2)在长出第一片真叶后，取少量幼嫩叶片提取基因组DNA；3)PCR扩增：反应体系、PCR程式同上面的实施例；4)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、读带：只有216bp条带(SEQ IDNO.133)的说明是LaBt纯合位点，只有186bp条带(SEQ ID NO.134)的说明是纯合无苦味位点，有216bp、186bp两条带的说明是杂合位点。5)判断：如果受体的遗传背景是普通丝瓜，则含LaBt纯合基因或杂合基因的植株接出的果都具有苦味。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 丝瓜果实苦味基因LaBt及用于果实苦味性状辅助选择的分子标记
<160> 140
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatgcctcgt tyaaactygt ctgta 25
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaatccttca agttgtrcaa cg 22
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcttaattcc cagtacaagg catct 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tagaaaaccc caaaccyaac agatc 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agctcccatg atcatctcat taact 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttgtttctt gggaatttaa ggaag 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aagagagagt gagagagctt agcct 25
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
catcgctgtc tcctgcttgg t 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgacctcaac atcatgggtt tc 22
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cttccttcca cttacgcgat acta 24
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aactctctgc cttctkggtc tgc 23
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agtccaaayc tacggcgcat aa 22
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctctyttgct cwctccaaac cataa 25
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaatctcacm cctttgytga cct 23
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gactcscact tkctgctctg c 21
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cttccgtgca aaagctgttg at 22
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccagtgcaag gawttcacag tt 22
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccttagtttt tcctgttcaa tatca 25
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgrtttaaat tgatacactw atgaa 25
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ygaktaggga gctggraaca 20
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aagttgttga atgtgccmtc tga 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cgcctaggag cattctacaa gca 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggccgtwact ttctccatct atc 23
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
yggcatggac aagactaaag c 21
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
scaaaggaaa gcaacagagg 20
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ctcaggagga aggagmttgt c 21
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cctttgactt tccacccata tctc 24
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gggraaaatc aaaatgaggg gtc 23
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gatcaccgcc tgcaataacg c 21
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ccgtcgccgt tcttgtcg 18
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tgwtgcattt ttacagcawa ttcct 25
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tctcgaccat ttgtttagtt sgttc 25
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
caamcccaat ccataaacaa gac 23
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cctgtctcty ttatatyatc caacca 26
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ttggsctgtt cggtttcc 18
<210> 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gaggaaagta tagaaggaat mtgtga 26
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<212> DNA
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<400> 37
tgaaattgat cccactggca g 21
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttggaagctc ctttgccga 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gcatatygca tgaatgtggc a 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ccccaagcag tcaaataacc c 21
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gcccgatgat ggratactct ga 22
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
agcctctaca catcmttaac cactc 25
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ggatctmaac aartgcgagc c 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcycccattt tagccytccc tg 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ccagggaaca atgtaaagcc a 21
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<212> DNA
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ggaagacggt gagcttatcg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
cccwacaatc tccagacaac ttc 23
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
agcaaactca aacagaagac ataaac 26
<210> 49
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tgagtccaaa ccggata 17
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<211> 17
<212> DNA
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<210> 51
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gtacatagaa ccggagt 17
<210> 57
<211> 17
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<210> 59
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<400> 59
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<210> 60
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<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
tgagtcgtat ccggagt 17
<210> 65
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
tgagtcgtat ccggtag 17
<210> 66
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
taaacaatgg ctactcaag 19
<210> 67
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gactgcgtac gaattaat 18
<210> 68
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
gactgcgtac gaatttgc 18
<210> 69
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
gactgcgtac gaattgac 18
<210> 70
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
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<210> 71
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
gactgcgtac gaattaac 18
<210> 72
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
gactgcgtac gaattgca 18
<210> 73
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
gactgcgtac gaatttag 18
<210> 74
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
gactgcgtac gaattatt 18
<210> 75
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
gactgcgtac gaattatg 18
<210> 76
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
gactgcgtac gaattctg 18
<210> 77
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
aggcggttgt caattgac 18
<210> 78
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
tgtggtccgc aaatttag 18
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
ttcttcttcc tggacacaaa 20
<210> 80
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
cgcaagaccc accacaa 17
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
ttaccttggt catacaacat t 21
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
ataagaatca gcagacgcat 20
<210> 83
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
acgagttgcg gaagtgg 17
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
gttagtatca aggttagagt t 21
<210> 85
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
tcccccaaat ggcatgaagt tc 22
<210> 86
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
gtgtaacacc tgccttgttg aggaa 25
<210> 87
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
tcccccaaat ggcatgaagt tc 22
<210> 88
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
cacttgggaa gaatacaaat ccatg 25
<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
gtggaccaat aatgaagggt ttc 23
<210> 90
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
aaagatatgg accaatcttc aagac 25
<210> 91
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
tgaaaccatg ttctaattaa ttaaactta 29
<210> 92
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
taaactgcca cccttacttc tcc 23
<210> 93
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
atcgagacta ggagaattgt tgacg 25
<210> 94
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
cttatcgttt cccatgcctt tg 22
<210> 95
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
gacggagaat gggagtggta ca 22
<210> 96
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
acatcataca cattcctcga aacct 25
<210> 97
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
ccttctacta atccttccag atttcct 27
<210> 98
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
gtttgaattt gatgagatag ctgac 25
<210> 99
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
gaatgccaag atgcttctgc tttag 25
<210> 100
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
aagtaacttt tggttgctga ttagac 26
<210> 101
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
actgcttggc aagcccaaag tag 23
<210> 102
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
ttggaacaca ctctataaca tcgac 25
<210> 103
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
ctcgtccttt ttgttcttcc acc 23
<210> 104
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
agcgagcttt acattcaatc tca 23
<210> 105
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
gaggcggagc ttcgagcatt ag 22
<210> 106
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
tcgcactcga gcttctgtaa atc 23
<210> 107
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
aactacggct ttctaggggt tc 22
<210> 108
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
ctgcatattg gttcaagcaa ctact 25
<210> 109
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
cattgagaaa ccagaaaatt ggaaag 26
<210> 110
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
aaagaaggca gcaggttatt gattg 25
<210> 111
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
tttggaccct gttggtgaaa ac 22
<210> 112
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
gaggtttcat tacaatgcca cag 23
<210> 113
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
ggtaatatac atcaattggg accat 25
<210> 114
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
actcggcttc ttgatctctt tgtc 24
<210> 115
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
gaaaatggcg gttatggtaa tgg 23
<210> 116
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
agacccagtt ccagtgccat tc 22
<210> 117
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
tcaagagcaa acccccaaac aa 22
<210> 118
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
cggataggtc agtggtgaag cag 23
<210> 119
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
gaatttgaca aaccgtttaa acttac 26
<210> 120
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
aagaccatta cagggttaaa acagg 25
<210> 121
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
tttcgactac ggtgacacta aca 23
<210> 122
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
ggttcatttg tcatcagtaa cacacta 27
<210> 123
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
agtgaaggtg accatgtgct taga 24
<210> 124
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
cactatgcat tacacctctc ctctat 26
<210> 125
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
tatgaaggtt atcacccatg atcgc 25
<210> 126
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
tgggaagtgc aacagaaaca tag 23
<210> 127
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
acattataaa cactcgtaac cgctt 25
<210> 128
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
tttgcttaca ttaaaagcga gattg 25
<210> 129
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
acaagcataa ccgtccatc 19
<210> 130
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
catccgacgt agtgaaagag 20
<210> 131
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
tcactaaaca tcttagccac c 21
<210> 132
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
caccctttca ttcagagca 19
<210> 133
<211> 216
<212> DNA
<213> 有棱丝瓜(Luffa acutangula(L.) Roxb.)
<400> 133
acattataaa cactcgtaac cgcttttaaa ataattgctg gcagttatgt ttttgaaaaa 60
aaaaattgtt gttatatgaa gtaaataaat gttagaagta agataaaatg agaattcaaa 120
aaagtttgtt aggttaaaag tgacatcaaa attagtttta tccaacacta ataacagtta 180
aaattctctc acaatctcgc ttttaatgta agcaaa 216
<210> 134
<211> 186
<212> DNA
<213> 普通丝瓜(Luffa cylindrica(L.)Rome.)
<400> 134
acattataaa cactcgtaac cgcttttaaa ataattgatg gcagttatgt ttcaagtaac 60
taagtgttag aaatatgata aaatgagaat tcaaaaaagt ttgttaggag tggcatcaga 120
attagtttta tcaaatgcta ataacagtta aaattctctc gcaatctcgc ttttaatgta 180
agcaaa 186
<210> 135
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
gggcttgtct tctgattgga aa 22
<210> 136
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
caaaggaaga agaaaatagt agtacaagta g 31
<210> 137
<211> 3046
<212> DNA
<213> 有棱丝瓜(Luffa acutangula(L.) Roxb.)
<400> 137
gggcttgtct tctgattgga aaattatatc gaacatacga tgtggacgat cgtgctcggt 60
ttggcgacgc tggcaatcgc ctactacatc cattggatca acaaatggag ggattcaaaa 120
ttcaacggag ttctgccacc aggcaccatg ggcctgcccc tcatcggaga gaccattcag 180
ttgagtcgac ccagtgactc ccttgacgtt caccctttca ttcaaagcaa agttaaaagg 240
tatttttatt attgttataa accttataaa cactcgtaac cgcttttaaa ataattgctg 300
gcagttatgt ttttgaaaaa aaaaattgtt gttatatgaa gtaaataaat gttagaagta 360
agataaaatg agaattcaaa aaagtttgtt aggttaaaag tgacatcaaa attagtttta 420
tccaacacta ataacagtta aaattctctc acaatctcgc ttttaatgta agcaaaatca 480
atcccgaatt aggtcatcaa gtcaaatcga aaattttttt aacaacaata atagacgaag 540
aactaaaaca tatatttagc gggataatta aaattaaaat taaaattggg gaaaatgtga 600
tggtttttag gtatggacca atcttcaaga catgtttggc gggaaggccg gtggtggttt 660
caacagatgc agagttcaac cattacataa tgttgcaaga aggaagggct gtggaaatgt 720
ggtatttgga tacactctcc aaattctttg gccttgacac tgagtggctc aaagcccttg 780
gcctcatcca caagtacatc agaagcatta ctttgaacca cttcggtgcc gagtcgctcc 840
gcgagcgctt tcttcctcgt atcgaagaat ccgctaggga aacccttcat tattggtcca 900
ctcaatccag cgttgaagtc aaagactccg ccgctgcggt atgtcaattc cttaacctaa 960
tttaatatct gatgtgagat ctccaacatg tctcctcaaa gataaatcga gtttagtact 1020
gatttaaaga ataattctct ttgctgaatt ttgcagatgg tcttcagaac ttcggtggct 1080
aagatgttta gcgaagattc gagtaaatta ctgacaggtg gtctcaccaa gaagttcact 1140
ggacttctcg gaggttttct cactctgcct ctaaacttgc ctggcaccac ttacaacaag 1200
tgcatgaagg tgattagcag aactatcgct cgatcataaa gcttaaacta atgggttatg 1260
ttcattctat cgactacgaa atattcaatt tttgattttt tcttttaatt tttggataac 1320
tctaggacat gaaggaaatc caaaagaagc tcaaagatat cttagaggac aggttggctt 1380
caggggcagg tagtgatgag gatttcttgg ggcaggccat taaagataag gaatcacaaa 1440
agttcatctc agaggaattc atcatccaat tgttgttttc catcagcttt gctagctttg 1500
agtccatctc caccactctc actttgattc tcaacttcct cgccgatcat cccgacgtag 1560
tgaaagagtt ggaagtaaga cccgaaagac acttaaaaaa aaaaattatt cgatgaggct 1620
ggaacaatgt gactgtttca tacgtcgttg gatgttaaag gagaatttaa aaatcgtgtg 1680
ctttaatttt acatccatcg cttaagagac aaccacgtcg tcgtaacaac cccgttaaat 1740
aatttttttt tttttcacta atgaatattt actaagttgt gttgatgatt ttaatgtata 1800
ttttgttgtg tgtttaaagg ctgagcatga agccatcaga aaagcaaggg cagatccaga 1860
tggaccaatc acttgggaag aatacaaatc catgactttc acacttaatg taatatttaa 1920
atcttttata tatacaattt gtcaatttct tgttaatttc tttttccaat ttgataacat 1980
ttttttttct tttgtctatt ttggattcta ggttatcagt gaagcactta ggttggggag 2040
tgtaacacct gccttgttga ggaaaacaac caaagaaatt caaattaaag gtaaaaaaaa 2100
taattttacc gtattttgtt aaatacggtt gttatcgtat caattaattg agatgctata 2160
ttcatattaa tttaactgat tcactaattt gcatttgatt aatatatagg atacacaatt 2220
cccgaaggat ggacggttat gcttgtcact gcttctcgtc acagagaccc agcagtctac 2280
aaggaccctg ataccttcaa tccatggcgt tggaaggtag accctaaaaa taaaaaggac 2340
aaaaaaaaac cataataaat acattttcta atatacttct aattaattaa ttgttaacac 2400
aaaatgctaa ctttgtttta aatcattatg gatatatcat aggacttgga ctcaattact 2460
gttcaaaaga acttcatgcc atttggagga ggtttaaggc attgtgctgg tgctgagtac 2520
tctaaagtct acttgagcac cttcctccat atccttttca ccaaatacag gtgcgtagtc 2580
tataagttca ggcttcgttt gataacgatt ttgttttagt tttctgcttc tttcatttct 2640
ttactgtaat tttcactttt ttagggacat tggaattctc agccaaattc caaaaataaa 2700
aataaatttt taaagactac ttttttagtt ttcaaaaaat agataacaaa aaaaaaaaaa 2760
tgttgtgaaa tggggttaag ttttcaaatt tattagtaat ttaacattag tatataagat 2820
agtttaatta tgtgtatata tacaatctca tttaatttta attttgatag atggaccaaa 2880
cttaagggag gaaagattgc aagagctcat atattgaagt ttgaagatgg gctacatgtg 2940
aagttcactc ccaaggaatg attgaataaa ttaaaaaaaa aaaaaatgtc atttctatta 3000
ttcttatggg atcatctact tgtactacta ttttcttctt cctttg 3046
<210> 138
<211> 3064
<212> DNA
<213> 普通丝瓜(Luffa cylindrica(L.)Rome.)
<400> 138
gggcttgtct tctgattgga aaattatatc gaagatacga tgtggacgat cgtgctcggt 60
ttggcgacgc tggcaatcgc ctattacatc cattggatca acaaatggag ggattcaaaa 120
ttcaacggag ttctgccgcc aggcaccatg ggcctgcccc tcatcggaga gaccattcag 180
ttgagtcgac ccagtgactc ccttgatgtt caccctttca ttcagagcaa agttaaaagg 240
tatttttaat tattattgtt ataaacatta taaacactcg taaccgcttt taaaataatt 300
gatggcagtt atgtttcaag taactaagtg ttagaaatat gataaaatga gaattcaaaa 360
aagtttgtta ggagtggcat cagaattagt tttatcaaat gctaataaca gttaaaattc 420
tctcgcaatc tcgcttttaa tgtatgcaaa atcaatcctg aattaggtca tataatcaat 480
tcaaacgtta aactacgagt caaatcgaaa atttttgaac aacaataata gacgaagaac 540
taaaacatat atttagcgga attaattaaa ttaaaattta aattggggga aatgtgatgg 600
tttttagata tggaccaatc ttcaagacat gtttggcggg aaggccggtg gtggtttcaa 660
cagatgcaga gttcaaccat tacataatgt tgcaagaagg aagggctgtg gaaatgtggt 720
atttggatac actctccaaa ttctttggcc ttgacactga gtggctcaaa gcccttggcc 780
tcatccacaa gtacatcaga agcattactt tgaaccactt cggcgccgag tcgctccgcg 840
agcgctttct tcctcgtatc gaagaatccg ctagggaaac ccttcattat tggtccactc 900
aatccagcgt tgaagtcaaa gaatctgctg ctgcggtatg tcaatttcct taacctaacc 960
aatatctgat gtgagatccc caacatgttc ctaaaagata gatcgagttt agtactagtt 1020
taagaataat tctctttgtt gaattttgca gatggtcttc agaacttcgg tggctaagat 1080
gtttagtgaa gattcgagta aattactgac aggcggtctc accaagaagt tcaccggact 1140
tctcggaggt tttctcactt tgcctctaaa tttgcctggc accacttaca acaaatgcat 1200
gaaggtgatt atcagagcta tcgctcgatc ataaagctta aactagtgga ttatgttcat 1260
tatgccaaga acgaaatatt caatttttaa aatatttttt tttaattttt ggatgactct 1320
aggacatgaa ggaaatccaa aagaagctga aagatatttt agaggacagg ttggcttcag 1380
gggcaggtag tgatgaggat ttcttggggc aggccattaa agataaggaa tcacaaaagt 1440
tcatcacaga ggaattcatc atccaattgt tgttttccat cagctttgct agctttgagt 1500
ccatctccac cactctcact ttgattctca acttcctcgc cggtcatccg acgtagtgaa 1560
agagttggaa gtaagacccg aaagacactt aaaaaaaaat tattcgatga ggctggaaca 1620
atgtgactgt ttcatacgtc gttggatgtt aaaggagaaa ttaaaaatcg tgctttaatt 1680
ttacatccaa cgcttaaggg acaaccacgt cgtaacagcc acgttaaata gttttttttt 1740
tcactaatga atatttacta agttttgtgg atgattttaa tgtatatttt gttgtgtgtt 1800
aaaggctgag catgaagcca tccgaaaagc tagggcagat ccagatgggc caatcacttg 1860
ggaagaatac aaatccatga ctttcacact taatgtaata tttaaatctt ttatatatac 1920
aatttgtcaa tttcttgttc atttcttttt ccaatttgat aacttttttt tttcttttgt 1980
ctattttgga ttctaggtta tcagtgaagc acttaggttg gggagtgtaa cacctgcctt 2040
gttgaggaaa acaaccaaag aaattcaaat aaaaggtata aaaaataatt aattttatgg 2100
tattttgtta aatacggttg ttatcgtatc aattaattga gatgctatat tcatagtaat 2160
taactgattc actcatttgc atttgattaa tataggatac acgatcccag aaggatggac 2220
ggttatgctt gtcactgctt ctcgtcatag agacccagca gtctataagg atccagatac 2280
cttcaatcca tggcgttgga aggtacaccc taaaaataaa aagaaagaca aaaaaaaaaa 2340
aaaaaaaacc ataataaata cattttctaa tatacttcta attaattaat tgttaacaca 2400
atgctaactt tgttttaaat cattatggat atatcatagg acttggactc aattactgtt 2460
cagaagaact tcatgccatt tgggggaggc ttaaggcatt gtgctggtgc tgagtactct 2520
aaagtctact tgagcacctt cctccatatc cttttcacca aatacaggtg cgtagtctat 2580
aatttcaggt ttcgtttgat aacgattttg ttttaatttt ttgtttctat tatttcttta 2640
ccgtgatttt cacctttttt taggagcatt aaaattctca gccaaattcc aaaaataaag 2700
ataaaatttt aaaggctatt gttttagttt tcaaatttta gtttggattt ttaaaacatt 2760
tttaaaaaat agatagaaaa ttgttatgaa atggggttaa gttttcaaat ttattagtaa 2820
tttaacatta gtatataaga tagtttaatt gtgtatatat acaatctaat ttaatttaaa 2880
ttttgataga tggaccaaac tcaagggagg aaagattgca agagctcata tattgaagtt 2940
tgaagatggg ctacatgtga agttcactcc caaggaatga ttgaataaat tcaaaaaaaa 3000
aaaatgtcat ttctattatt cttatgggat cacctacttg tactactatt ttcttcttcc 3060
tttg 3064
<210> 139
<211> 1425
<212> DNA
<213> 有棱丝瓜(Luffa acutangula(L.) Roxb.)
<400> 139
atgtggacga tcgtgctcgg tttggcgacg ctggcaatcg cctactacat ccattggatc 60
aacaaatgga gggattcaaa attcaacgga gttctgccac caggcaccat gggcctgccc 120
ctcatcggag agaccattca gttgagtcga cccagtgact cccttgacgt tcaccctttc 180
attcaaagca aagttaaaag gtatggacca atcttcaaga catgtttggc gggaaggccg 240
gtggtggttt caacagatgc agagttcaac cattacataa tgttgcaaga aggaagggct 300
gtggaaatgt ggtatttgga tacactctcc aaattctttg gccttgacac tgagtggctc 360
aaagcccttg gcctcatcca caagtacatc agaagcatta ctttgaacca cttcggtgcc 420
gagtcgctcc gcgagcgctt tcttcctcgt atcgaagaat ccgctaggga aacccttcat 480
tattggtcca ctcaatccag cgttgaagtc aaagactccg ccgctgcgat ggtcttcaga 540
acttcggtgg ctaagatgtt tagcgaagat tcgagtaaat tactgacagg tggtctcacc 600
aagaagttca ctggacttct cggaggtttt ctcactctgc ctctaaactt gcctggcacc 660
acttacaaca agtgcatgaa ggacatgaag gaaatccaaa agaagctcaa agatatctta 720
gaggacaggt tggcttcagg ggcaggtagt gatgaggatt tcttggggca ggccattaaa 780
gataaggaat cacaaaagtt catctcagag gaattcatca tccaattgtt gttttccatc 840
agctttgcta gctttgagtc catctccacc actctcactt tgattctcaa cttcctcgcc 900
gatcatcccg acgtagtgaa agagttggaa gctgagcatg aagccatcag aaaagcaagg 960
gcagatccag atggaccaat cacttgggaa gaatacaaat ccatgacttt cacacttaat 1020
gttatcagtg aagcacttag gttggggagt gtaacacctg ccttgttgag gaaaacaacc 1080
aaagaaattc aaattaaagg atacacaatt cccgaaggat ggacggttat gcttgtcact 1140
gcttctcgtc acagagaccc agcagtctac aaggaccctg ataccttcaa tccatggcgt 1200
tggaaggact tggactcaat tactgttcaa aagaacttca tgccatttgg aggaggttta 1260
aggcattgtg ctggtgctga gtactctaaa gtctacttga gcaccttcct ccatatcctt 1320
ttcaccaaat acagatggac caaacttaag ggaggaaaga ttgcaagagc tcatatattg 1380
aagtttgaag atgggctaca tgtgaagttc actcccaagg aatga 1425
<210> 140
<211> 474
<212> PRT
<213> 有棱丝瓜(Luffa acutangula(L.) Roxb.)
<400> 140
Met Trp Thr Ile Val Leu Gly Leu Ala Thr Leu Ala Ile Ala Tyr Tyr
1 5 10 15
Ile His Trp Ile Asn Lys Trp Arg Asp Ser Lys Phe Asn Gly Val Leu
20 25 30
Pro Pro Gly Thr Met Gly Leu Pro Leu Ile Gly Glu Thr Ile Gln Leu
35 40 45
Ser Arg Pro Ser Asp Ser Leu Asp Val His Pro Phe Ile Gln Ser Lys
50 55 60
Val Lys Arg Tyr Gly Pro Ile Phe Lys Thr Cys Leu Ala Gly Arg Pro
65 70 75 80
Val Val Val Ser Thr Asp Ala Glu Phe Asn His Tyr Ile Met Leu Gln
85 90 95
Glu Gly Arg Ala Val Glu Met Trp Tyr Leu Asp Thr Leu Ser Lys Phe
100 105 110
Phe Gly Leu Asp Thr Glu Trp Leu Lys Ala Leu Gly Leu Ile His Lys
115 120 125
Tyr Ile Arg Ser Ile Thr Leu Asn His Phe Gly Ala Glu Ser Leu Arg
130 135 140
Glu Arg Phe Leu Pro Arg Ile Glu Glu Ser Ala Arg Glu Thr Leu His
145 150 155 160
Tyr Trp Ser Thr Gln Ser Ser Val Glu Val Lys Asp Ser Ala Ala Ala
165 170 175
Met Val Phe Arg Thr Ser Val Ala Lys Met Phe Ser Glu Asp Ser Ser
180 185 190
Lys Leu Leu Thr Gly Gly Leu Thr Lys Lys Phe Thr Gly Leu Leu Gly
195 200 205
Gly Phe Leu Thr Leu Pro Leu Asn Leu Pro Gly Thr Thr Tyr Asn Lys
210 215 220
Cys Met Lys Asp Met Lys Glu Ile Gln Lys Lys Leu Lys Asp Ile Leu
225 230 235 240
Glu Asp Arg Leu Ala Ser Gly Ala Gly Ser Asp Glu Asp Phe Leu Gly
245 250 255
Gln Ala Ile Lys Asp Lys Glu Ser Gln Lys Phe Ile Ser Glu Glu Phe
260 265 270
Ile Ile Gln Leu Leu Phe Ser Ile Ser Phe Ala Ser Phe Glu Ser Ile
275 280 285
Ser Thr Thr Leu Thr Leu Ile Leu Asn Phe Leu Ala Asp His Pro Asp
290 295 300
Val Val Lys Glu Leu Glu Ala Glu His Glu Ala Ile Arg Lys Ala Arg
305 310 315 320
Ala Asp Pro Asp Gly Pro Ile Thr Trp Glu Glu Tyr Lys Ser Met Thr
325 330 335
Phe Thr Leu Asn Val Ile Ser Glu Ala Leu Arg Leu Gly Ser Val Thr
340 345 350
Pro Ala Leu Leu Arg Lys Thr Thr Lys Glu Ile Gln Ile Lys Gly Tyr
355 360 365
Thr Ile Pro Glu Gly Trp Thr Val Met Leu Val Thr Ala Ser Arg His
370 375 380
Arg Asp Pro Ala Val Tyr Lys Asp Pro Asp Thr Phe Asn Pro Trp Arg
385 390 395 400
Trp Lys Asp Leu Asp Ser Ile Thr Val Gln Lys Asn Phe Met Pro Phe
405 410 415
Gly Gly Gly Leu Arg His Cys Ala Gly Ala Glu Tyr Ser Lys Val Tyr
420 425 430
Leu Ser Thr Phe Leu His Ile Leu Phe Thr Lys Tyr Arg Trp Thr Lys
435 440 445
Leu Lys Gly Gly Lys Ile Ala Arg Ala His Ile Leu Lys Phe Glu Asp
450 455 460
Gly Leu His Val Lys Phe Thr Pro Lys Glu
465 470

Claims (9)

1.一种多核苷酸，其为有棱丝瓜果实苦味基因LaBt序列，其序列如SEQ ID NO.137所示。
2.一种多核苷酸，其为对应于有棱丝瓜果实苦味基因LaBt位点的普通丝瓜的基因组序列，其序列如SEQ ID NO.138所示。
3.一种多核苷酸，其为有棱丝瓜果实苦味基因LaBt的CDS序列，其序列如SEQ IDNO.139所示。
4.权利要求1～3任一所述的多核苷酸编码的蛋白；所述的SEQ ID NO.137编码的蛋白其序列如SEQ ID NO.140所示的氨基酸序列。
5.丝瓜苦味性状的分子标记，所述的分子标记为InDel分子标记：LuBt1-2，其序列如SEQ ID NO.133所示的核苷酸序列。
6.检测权利要求5所述的InDel分子标记的引物对，其特征在于，上游引物如SEQ IDNO.127所示，下游引物如SEQ ID NO.128所示。
7.一种试剂盒，其含有权利要求6所示的引物对。
8.一种检测丝瓜苦味基因LaBt的方法，其特征在于，用权利要求7所述的引物对进行PCR扩增待检测丝瓜基因组DNA，如果能够扩增出SEQ ID NO.133所示的片段，则说明该待检丝瓜存在苦味基因LaBt。
9.权利要求1～8任一所述多核苷酸/蛋白/分子标记/引物对/试剂盒/方法在丝瓜育种中的应用。
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