CN108467866A - 一种与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体及其应用 - Google Patents

一种与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108467866A
CN108467866A CN201711364163.8A CN201711364163A CN108467866A CN 108467866 A CN108467866 A CN 108467866A CN 201711364163 A CN201711364163 A CN 201711364163A CN 108467866 A CN108467866 A CN 108467866A
Authority
CN
China
Prior art keywords
callose
aptamer
dna
specific binding
biotin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711364163.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108467866B (zh
Inventor
林勇平
杨敏
陈源
刘忠民
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Original Assignee
First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University filed Critical First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority to CN201711364163.8A priority Critical patent/CN108467866B/zh
Publication of CN108467866A publication Critical patent/CN108467866A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108467866B publication Critical patent/CN108467866B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56961—Plant cells or fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种与(1,3)‑β‑D‑葡聚糖特异性结合的核酸适配体，本发明提供的与(1,3)‑β‑D‑葡聚糖特异性结合的核酸适配体DNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明基于富集的配体系统进化技术，经过多轮的富集筛选，筛选出与(1,3)‑β‑D‑葡聚糖特异性结合的核酸适配体。基于该核酸适配体设计传感器,利用流式细胞术建立了检测(1,3)‑β‑D‑葡聚糖的检测方法。本发明的核酸适配体及检测方法可用于快速检测(1,3)‑β‑D‑葡聚糖并应用于制备侵袭性真菌感染辅助诊断的检测试剂中,为侵袭性真菌感染诊断提供了新的思路,具有良好的应用前景。

Description

一种与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体及其应用。
背景技术
深部真菌感染(Invasive fungal infection,IFI)是指真菌侵入人体组织、血液或器官，并在其中生长繁殖引起组织损害、器官功能障碍、炎症反应的病理改变及病理生理过程。近年来，由于免疫抑制剂、广谱抗生素、糖皮质激素、抗肿瘤药物等的广泛使用及外科手术导管、置管的应用，侵袭性真菌感染的发病率和死亡率逐渐增多。由于IFI的临床症状和体征缺乏特异性，确诊主要依赖组织病理学，在临床上往往较难获得，而真菌培养对取材要求高、时间长、阳性率低，导致侵袭性真菌感染的早期诊断非常困难。因此，临床上急需建立一种敏感、特异且操作便捷的用于诊断真菌感染检测方法。
(1,3)-β-D-葡聚糖是除接合菌外所有真菌细胞壁的结构成分，在酵母样真菌中含量最高，约占细胞壁干重的50％-60％，而原核生物、病毒和人类细胞均不含此多糖。真菌侵入人体时，宿主细胞会对真菌进行氧化处理，真菌破壁后持续释放出可溶性(1,3)-β-D-葡聚糖进入血液。目前应用广泛的检测真菌壁成分—(1,3)-β-D-葡聚糖的方法是G试验，其机制是(1,3)-β-D-葡聚糖可特异性激活鲎变性细胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固。但是G试验具有一定的局限性，其酶促反应容易受到很多因素的影响，易受到内毒素、药物等干扰，假阳性率高。
核酸适配体是指利用富集的配体系统进化技术(Systematic evolution ofligands by exponential enrichment,SELEX)，从随机单链核酸库中筛选出来的能与相应的靶分子高亲合性、高特异性结合的寡核苷酸片段。适配体可以是一段脱氧核苷酸或核苷酸序列，具有丰富多样的三维结构，可模拟几乎所有可能存在的与靶分子相互作用的空间结构，如发卡、假节、四聚体、I-基序、茎环等，其结合的靶分子可以是蛋白质、糖类、细胞因子、小分子毒素、病毒、细菌、金属离子等，因此核酸适配体被广泛应用于生物传感器等领域。同时适配体为核苷酸序列，容易制备和修饰，结构活性稳定，并且其分子量小，与靶分子的立体结构域进行结合，可进行分子改造，为生物化学及生物医学发展提供了一种快速识别的研究平台，并展示出良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于(1,3)-β-D-葡聚糖检测的核酸适配体及其应用。
要实现对(1,3)-β-D-葡聚糖快速定性和定量检测，需要获取到能与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合且亲和力高的物质。
为实现上述目的，本发明提供一种与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体，所述核酸适配体的DNA序列如SEQ ID NO.1。进一步地，由于适配体的可修饰性，可以通过不同的修饰达到不同的目的，还可对本发明提供的与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体DNA序列进行修饰、延长或截短，例如修饰材料可以为荧光物质、生物素、纳米物质及相关酶类物质等。
进一步地，本发明所述的与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体的序列为SEQ ID NO.1所示的DNA序列经替换、缺失和/或插入一个或几个核苷酸后形成与SEQ IDNO.1具有同等功能的序列。
本发明提供的与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体可应用于制备对(1,3)-β-D-葡聚糖定性和定量检测的试剂中，这些检测试剂可以基于但不限于以下检测方法；荧光方法检测、酶联免疫反应、放射免疫检测、免疫印迹检测、流式细胞术检测等。
本发明的与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体还可应用于对侵袭性真菌感染的辅助诊断试剂的制备中。
本发明还提供一种对(1,3)-β-D-葡聚糖进行检测的方法，包含以下步骤：
⑴将前述与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体经过生物素和荧光标记并与过量含有淬灭基团标记的DNA孵育，所述核酸适配体与该DNA链部分互补；
⑵将其与预处理的链霉亲和素磁珠孵育；
⑶清洗除去过量DNA；
⑷将含有(1,3)-β-D-葡聚糖的样品加入上述体系孵育；
⑸对检测样品荧光强度进行分析。
进一步地，所述对(1,3)-β-D-葡聚糖进行检测的方法中所述的含有淬灭基团标记的DNA为可以为5′-CATTGGGCTTGG-BHQ1。
进一步地，所述的对(1,3)-β-D-葡聚糖进行检测的方法中所述与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体经过生物素和荧光标记形成如下结构：5′-FAM-TCCAAGC-[本发明提供的与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体DNA序列]-TTTTTT-Biotin。
本发明有以下有益效果：(1)本发明借助富集的配体进化系统，利用商品化的链酶亲和素磁珠与人工偶联生物素标记(1,3)-β-D-葡聚糖进行结合筛选，再经过PCR扩增结合的核酸序列，经多轮的富集筛选，最终获得与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体；经过人工合成序列检测，该核酸适配体可与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合，并可实现对(1,3)-β-D-葡聚糖的定性及定量检测；(2)常规抗体一旦筛选完成，难于进行特定改造；本发明所提供的核酸适配体可经过商业公司合成或PCR扩增获得，可进行定点改造，易于人工合成和标记，成本低；(3)利用本发明提供的核酸适配体能建立检测(1,3)-β-D-葡聚糖的检测方法，通过相应检测标定物的偶联，进行(1,3)-β-D-葡聚糖快速定性及定量检测。
附图说明
图1A为具体实施例中提取的(1,3)-β-D-葡聚糖的苯酚-硫酸法检测结果图(1，阴性对照；2，(1,3)-β-D-葡聚糖(+))；
图1B为具体实施例中提取的(1,3)-β-D-葡聚糖的碘反应检测结果图(1，阳性对照；2，阴性对照；3，(1,3)-β-D-葡聚糖(-))；
图1C为具体实施例中提取的(1,3)-β-D-葡聚糖的茚三酮反应结果图(1，(1,3)-β-D-葡聚糖(-)；2，阳性对照)；
图1D为具体实施例中提取的(1,3)-β-D-葡聚糖的红外图谱；
图1E为具体实施例中对提取的(1,3)-β-D-葡聚糖进行定量检测使用的葡萄糖标准曲线；
图2A为具体实施例中(1,3)-β-D-葡聚糖的生物素标记、纯化鉴定使用的不同分子量的葡聚糖标准曲线；
图2B为具体实施例中生物素化(1,3)-β-D-葡聚糖的红外图谱；
图3为本发明SELEX筛选过程中ssDNA PCR电泳结果图(A SELEX筛选中ssDNA PCR扩增电泳结果图；B负筛选中ssDNA与链霉亲和素磁珠孵育的PCR扩增电泳结果图)；
图4为本发明的核酸适配体及其它各组核酸适配体对(1,3)-β-D-葡聚糖结合力检测结果图；
图5为本发明的核酸适配体的二级结构示意图；
图6为本发明的核酸适配体解离常数(Kd值)的检测结果图；
图7为流式细胞术对本发明的核酸适配体与(1,3)-β-D-葡聚糖亲和力检测结果图；
图8为流式细胞术对本发明的核酸适配体检测(1,3)-β-D-葡聚糖特异性实验结果图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步的详细说明。
国内申请号为201610902299.9发明专利申请公布了特异性结合白色念珠菌ATCC10231中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子及其筛选方法，而本发明通过不同的筛选方法筛选到序列不同的核酸适配体能特异性结合(1,3)-β-D-葡聚糖，且检测到本发明的核酸适配体解离常数(Kd值＝14.05±3.98nM)低于国内申请号为201610902299.9发明专利申请公布的特异性结合白色念珠菌ATCC64550中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配体的Kd值。Low等人公布的两条特异性结合(1,3)-β-D-葡聚糖的适配体的0.303±0.067μM和0.326±0.089μM，均高于本发明提供的核酸适配体的Kd值，说明本发明的核酸适配体具有更高的结合力，可应用于制备对(1,3)-β-D-葡聚糖的检测试剂，对侵袭性真菌感染的诊断展现良好的临床应用价值。
具体实施例中涉及的材料及仪器信息如下：白色念珠菌ATCC64550，购于美国培养物保藏中心(ATCC)；Tryptone、Glucose、Yeast extract、UNIQ-10寡聚核苷酸纯化试剂盒购于上海生工生物工程有限公司；M280链霉亲和素磁珠购于上海英潍捷基(Invitrogen)公司；生物素酰-N-羟基丁二酰亚胺、tRNA、海带多糖(Laminarin)、大麦葡聚糖(β-D-Glucanfrom barley)、甘露聚糖(Mannan)购买于Sigma-Aldrich公司；Sephadex G200、蓝色葡聚糖Dextran2000购买于广州捷贝斯公司；pUC19质粒、DNA marker、Premix Taq聚合酶购于宝柯生物工程(Takara)大连有限公司；DH5α菌种、IPTG、X-Gal购于北京全式金生物技术有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生物科技(北京)有限公司；双排磁力架(上海英潍捷基(Invitrogen)公司)；DNA电泳系统、凝胶成像分析系统、PCR仪(Bioimaging System美国UVP公司)；核酸蛋白检测仪(德国EPPENDORF公司)；台式离心机(德国EPPENDORF公司)；1420Victor3多标记分析仪(美国PerkinElmer公司)；LB943微孔板式发光仪(德国伯托(Berthold)公司)；流式细胞仪(艾森生物(杭州)有限公司)；单链DNA文库及引物由上海英潍捷基(Invitrogen)公司合成；化学试剂均为分析纯，购自广州化学试剂厂。
实施例一可溶性(1,3)-β-D-葡聚糖的提取、鉴定
1.真菌的培养与收集
从沙氏平板中挑取单个白色念珠菌ATCC64550菌落，接种至YPD液体培养基，放置台式恒温摇床中35℃振荡培养72h，离心，收集菌液沉淀，经真空离心浓缩仪60℃烘干后得干燥的白色念珠菌ATCC64550。
2.酸碱不溶性(1,3)-β-D-葡聚糖的提取
干燥后的白色念珠菌ATCC64550与1M的NaOH溶液按1g:10mL的比例混合，100℃下剧烈搅拌1h；离心后用0.75M的NaOH溶液重悬真菌沉淀，加热至100℃，维持15min；离心后沉淀用蒸馏水洗涤2次、无水乙醇脱水洗涤2次，烘干后可得碱不溶性葡聚糖；将上述碱不溶性葡聚糖加入体积百分浓度为4％的乙酸溶液中(1g:10mL比例混合)，在室温下匀速搅拌2h后离心，沉淀用蒸馏水洗涤2次，再用无水乙醇和丙酮充分洗涤产物，离心烘干后得酸碱不溶性(1,3)-β-D-葡聚糖。
3.可溶性(1,3)-β-D-葡聚糖的提取
将酸碱不溶性(1,3)-β-D-葡聚糖按照葡聚糖:NaClO(5％):NaOH(0.1M):DMSO(0.1％)＝1:10:10:10(g:mL:mL:mL)的比例配成悬浊液，混匀后4℃静置氧化24h后离心，沉淀分别加入适量无水乙醇和丙酮洗涤。沉淀重悬于1％的DMSO溶液中，在工作频率18-21kHz下400W的功率进行超声处理30min，每循环处理时间5s，间歇时间4s；将超声处理后的溶液放置在90℃水浴锅中水浴60min，离心收集上清。加4倍体积的无水乙醇，4℃静置24h后，离心。沉淀依次加入无水乙醇和丙酮对沉淀进行洗涤，浓缩干燥，即得可溶性(1,3)-β-D-葡聚糖。
4.可溶性(1,3)-β-D-葡聚糖的定性检测
(1)苯酚-硫酸反应：称取50μg多糖产物溶于1mL蒸馏水中(50μg/ml)，加入5％苯酚0.5ml和浓硫酸2.5ml，摇匀后静止10min，观察显色反应。结果显示，提取的产物呈棕黄色阳性反应，表明为多糖类碳水化合物(如图1A)；
(2)碘反应:称取KI 0.4g溶于1ml蒸馏水中，加入碘0.2g，加水至60ml配成碘液，置棕色瓶中保存；取碘液1ml，加入多糖产物，观察显色反应。结果显示，提取的产物呈阴性，表明产物不含糖元(如图1B)；
(3)茚三酮反应：称取0.2g茚三酮溶于100ml无水乙醇中，配成茚三酮-乙醇溶液，取溶液1ml，加入多糖水溶液并100℃加热，观察显色反应。结果显示，提取的产物呈阴性，表明提取产物中不含氨基酸和多肽类物质(如图1C)；
(4)G试验:将多糖产物溶于水中，充分震荡混匀，取0.1ml样品加入0.9ml样品处理液，混匀后70℃孵育10分钟，取出后立刻放入冷却槽中冷却5分钟。取0.2ml直接加入酶反应主剂，溶解后转移至平底试管中，用MB-80微生物快速动态检测系统进行反应检测。用(1,3)-β-D-葡聚糖检测试剂盒检测，产物呈阳性反应，(1,3)-β-D-葡聚糖浓度>1000pg/ml，表明提取的(1,3)-β-D-葡聚糖具有激活鲎试剂的生物活性。
(5)红外光谱鉴定分析：各取1mg酸碱不溶性多糖及可溶性多糖产物，分别与0.296g溴化钾均匀研磨，压成薄片，依次对其红外光谱进行检测。结果显示：提取产物在波数894cm-1处有特征吸收峰，表明多糖为β-构型；在波数1042cm-1、1077cm-1处有吸收峰，其结构显示为D-吡喃糖苷；在894cm-1，1372cm-1，2924cm-1处的特征吸收峰，表明葡聚糖具有(1,3)-β糖苷键(如图1D)。
5.可溶性(1,3)-β-D-葡聚糖的定量检测
(1)葡萄糖标准曲线制作:称取100mg无水葡萄糖干粉，倒入烧杯中，加少量水溶解后定容至100mL，此时浓度为1mg/ml；配置葡萄糖浓度梯度，然后各加入苯酚0.2ml，摇匀，迅速加入浓硫酸1ml，静置10min后摇匀，用490nm波长测定其吸光度值，以1ml去离子水为空白同样进行显色操作，横坐标为葡萄糖浓度，纵坐标为吸光度值(OD值)，绘图得到标准曲线。
(2)(1,3)-β-D-葡聚糖的定量检测:准确称取(1,3)-β-D-葡聚糖产物11.5mg，溶于2ml水中，充分震荡混匀，此时葡聚糖浓度为5.75mg/ml，将原液进行10倍稀释，按上述显色操作步骤读取(1,3)-β-D-葡聚糖的OD值。
(3)结果，实验测得葡萄糖标准溶液的OD值如表1，并测得(1,3)-β-D-葡聚糖的OD值为2.378，依据标准曲线(如图1E)计算得提取产物中(1,3)-β-D-葡聚糖的含量达91.31％。
表1苯酚-硫酸法测定葡萄糖及(1,3)-β-D-葡聚糖溶液OD值
实施例二可溶性(1,3)-β-D-葡聚糖的生物素标记、纯化及鉴定
1.生物素标记可溶性(1,3)-β-D-葡聚糖
准确称取75mg(1,3)-β-D-葡聚糖溶于2ml无菌水中，充分振荡混匀，加入100mM的NaIO4 100μl，混匀后在室温下置于暗处反应30min；在混合物中加入1ml的乙二胺反应2h，然后加入95％无水乙醇8ml，充分混匀，0℃/10000g离心10min，用2ml无菌水重悬沉淀；用无水乙醇洗涤沉淀三次，充分去除反应试剂，沉淀重悬于2ml无菌水中；加入5mg硼氢化钠，4℃避光反应4h，反应完毕后用无水乙醇洗3次；将生物素酰-N-羟基丁二酰亚胺(BNHS)溶于0.2ml的DMSO，加入到反应物中，室温下反应3h，反应完毕后用无水乙醇洗3次，沉淀重悬于3ml无菌水中，分管-20℃保存。
2.生物素化(1,3)-β-D-葡聚糖的纯化及分子量测定
(1)SephadexG-200预处理：称取SephadexG-200约5g，加入蒸馏水100ml，置室温下搅拌溶胀24h。
(2)装柱：将层析柱(1×25cm)垂直安装好，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降，同时打开下口慢速流出蒸馏水。装好后，用蒸馏水平衡3h。
(3)加样、洗脱与收集：加样前，保证柱内液面与凝胶表面相齐(或留一极薄液层)。然后，由层析柱的上端加水解液5mL，经恒流泵进入层析柱，以1ml/管/2min进行洗脱收集。洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干，先对蓝色葡聚糖Dextran 2000进行上样，然后将三种已知分子量的葡聚糖标准品Dextran 410、Dextran 80、Dextran 12分别进行上样层析，最后进行样品的凝胶柱层析。样品浓度均为10mg/ml。
(4)分子量测定：用蓝色葡聚糖Dextran 2000上样测定外水体积(V0)，标准葡聚糖(410×103、80×103、12×103)测定洗脱体积(Ve)。以Ve/V0为Y，LogM为X求得直线回归方程：R2＝0.9985，Y＝-2.2861x+15.788(如图2A)。根据回归方程，可求得样品分子量约为143kDa。
(5)苯酚-硫酸鉴定:对收集的样品管进行苯酚-硫酸检测，确定样品的洗脱范围。取一定量的洗脱液，加入5％苯酚和浓硫酸，摇匀后静止10min，观察显色反应。收集呈棕黄色阳性反应管。
(6)生物素标记可溶性(1,3)-β-D-葡聚糖红外光谱鉴定:将8ml无水乙醇加入2ml纯化后的生物素标记可溶性(1,3)-β-D-葡聚糖溶液，离心干燥。取1mg与0.296g溴化钾均匀研磨，压成薄片，对其红外光谱进行检测。结果表明，生物素标记可溶性(1,3)-β-D-葡聚糖保留了可溶性(1,3)-β-D-葡聚糖具有的特征吸收峰，生物素化的(1,3)-β-D-葡聚糖在1550cm-1，849cm-1处出现新的特征吸收峰，1550cm-1处为新生成的酰胺键的伸缩振动，849cm-1为生物素标记的长链带伸缩振动，表明生物素标记成功(如图2B)。
实施例三借助链霉亲和素磁珠与生物素标记的(1,3)-β-D-葡聚糖的指数富集筛选
1.随机核酸库及引物的设计
随机核酸库设计原则是，在5′端加18nt的固定序列，3′端加20nt的固定序列，用于进行后续的扩增，中间45nt的序列为随机序列，在合成引物的同时合成生物素标记的P2以备筛选鉴定。整个随机核酸库和引物的修饰和合成由上海生工完成，具体如下：
随机核酸库：5′-CGACTGACGCCTCCAAGC-N45-CACAGCACACTCACACGCAC-3′
上游引物P1：5′-CGACTGACGCCTCCAAGC-3′
下游引物P2：5′-GTGCGTGTGAGTGTGCTGTG-3′
下游生物素标记引物P2：5′-Biotin-GTGCGTGTGAGTGTGCTGTG-3′
2.PCR扩增及单链次库的制备
以随机核酸库作为模板，进行PCR扩增，具体如下：
PCR反应体系为：模板10μl，P1 1μl，生物素化P2 1μl，Premix Taq酶25μl，加水至50μl。
PCR反应条件为：循环扩增条件依据每轮鉴定的扩增效果而定，以能扩增到目的条带，非特异性条带最少的最小循环数及退火温度为准。
3.筛选
第一轮筛选：
(1)磁珠预处理，即将商品化的10mg/ml链霉亲和素磁珠悬混液100μl于1.5ml EP管中，置于磁力架上，用2x结合洗涤液(Ph 7.5，Tris-HCl 10mM，EDTA 1mM，NaCl 2M)清洗3次，加入100μl 1x结合洗涤液重悬待用；
(2)加入过量生物素标记的(1,3)-β-D-葡聚糖于预处理的链霉亲和素磁珠中，室温孵育30min，然后置于磁力架上，用等量的1x结合洗涤液清洗3次，结合磁珠用200μl 1x结合洗涤液清洗待用；
(3)取100μM初始单链DNA(ssDNA)20μl，95℃变性5min后立即放置冰上冷却5min，然后加入结合磁珠中，室温震荡孵育30min；
(4)反应结束后，置于磁力架上，静置2min至液体澄清，吸出液体，即为未结合的单链DNA文库；
(5)用500μl选择缓冲液重悬磁珠，洗涤20次，收集保存第一次和最后一次洗涤缓冲液；
(6)用200μl去离子水重悬反应产物，95℃变性5min后立即放置冰上冷却5min，收集洗脱液；
(7)以洗脱液为模板进行PCR扩增，PCR反应体系和条件同步骤2，将PCR扩增产物纯化，得到生物素化的双链DNA(dsDNA)；
(8)利用磁珠分选系统对生物素化的dsDNA进行单链化处理，得到单链次级文库，即将预处理的磁珠悬液与等体积的dsDNA混合，室温震荡孵育15min，用200μl 1x结合缓冲液重悬洗涤3次，然后加入100mM NaOH室温孵育5min，上游文库链即处于游离状态，带有生物素标记的下游文库与链霉亲和素磁珠结合，置于磁力架上吸附，收集的结合的ssDNA作为次级文库，用于下一轮筛选。
第二轮筛选：
将步骤2的单链次级文库加入已结合生物素标记的(1,3)-β-D-葡聚糖的磁珠中，同时加入0.1μg/ml tRNA混合，重复第一轮筛选步骤，得到第二轮筛选的单链次级文库。
第三轮至第五轮筛选：
参照上述步骤第二轮筛选步骤，得到第五轮筛选的单链次级文库。
第六轮筛选：
将第五轮筛选获得的单链次级文库做负筛选：即将ssDNA直接与链霉亲和素磁珠孵育，步骤同第一轮筛选步骤，收集未结合的ssDNA作为下轮筛选的文库。
第七轮至第二十轮筛选：
第十轮、第十四轮和第十九轮筛选同第六轮筛选步骤进行负筛选，其余同第二轮筛选步骤。其中各轮筛选加入磁珠、tRNA及生物素标记的(1,3)-β-D-葡聚糖的量、孵育时间及洗涤次数如表2，得到第二十轮筛选的次级文库(核酸适配体)。
每轮筛选均收集结合ssDNA文库、未结合ssDNA文库、阴性对照、第一次及最后一次洗涤液作为模板，进行3％琼脂糖凝胶电泳。筛选(负筛选除外)结果表明，经20次洗涤后，大部分非特异性结合的ssDNA被洗脱，结合ssDNA可特异性结合(1,3)-β-D-葡聚糖，可用于下一轮筛选，每轮筛选的ssDNA得到了较好的富集(结果如图3A)。负筛选结果表明，经负筛选后可较好的除去非特异性结合的ssDNA，收集未结合ssDNA文库用于下一轮筛选(结果如图3B)。
表2.核酸适配体各轮筛选的参数表
*负筛选；NS，Negative selection
实施例四核酸适配体的克隆测序分析
将第二十轮筛选的次级文库为模板，进行PCR扩增，具体如下：
PCR反应体系为：模板10μl，P1 1μl，P2 1μl，Ex Premix Taq酶25μl，加水至50μl。
PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，扩增15个循环；最后72℃延伸2min。
将扩增产物dsDNA进行3％琼脂糖凝胶电泳，对单一目的条带切胶回收，与pMD19-T载体相连接，具体如下：
连接体系为：pMD19-T载体1μl，dsDNA 4μl，反应液5μl。
反应条件为：16℃反应30min。
将连接产物加入制备好的DH5α感受态细胞的EP管中，冰上放置30min，42℃加热90s，冰上放置3min，然后在每支EP管中加入500μl LB培养基，37℃震荡孵育1h，再以4000rpm离心10min。
分别以200μl LB培养基重悬菌体，将菌液均匀涂抹在IPTG-X-Gal-Amp-LB琼脂平板上进行蓝白斑筛选，37℃过夜。
参照上述步骤，以试剂阳性质控品和去离子水分别做阳性和阴性对照。
随机挑取54个白色菌落，37℃培养过夜，将菌液送上海生工进行测序。
根据测序结果，使用DNAMAN软件对序列进行同源分析。进行多序列比对分析输出同源关系树，将具有90％以上一致性/同源性的序列归为一组，可分为9组，共23条序列。除G6组的G6-34和G6-4在同一位置上出现不同碱基外，其余8组均具有两条或两条以上的相同序列，序列具有30％的一致性(结果如表3)。用Mfold软件对所得序列进行二级结构预测，根据最低自由能预测各核酸适配体的最稳定结构。
表3经20轮SELEX筛选后的同源性ssDNA序列
#：相同序列的条数；dG：最低自由能。
实施例五核酸适配体结合力的检测
核酸适配体结合力的检测方法采用荧光方法检测，具体操作步骤为：
(1)根据测序结果选择出现频率较高的8组核酸适配体并编号，重新合成两端无固定序列的荧光标记(FAM)的核酸适配体；
(2)分别将500pmol各核酸适配体95℃变性5min，冰上放置5min，再加入与生物素标记的(1,3)-β-D-葡聚糖结合的链霉亲和素磁珠悬液中，室温避光震荡孵育25min，然后置于磁力架上静置2min，收集孵育后的上清液，即为未结合ssDNA；
(3)用200μl选择缓冲液(pH 7.6，NaCl 100mM，KCl 5mM，MgCl2 2mM，Tris-HCl20mM，CaCl2 1mM，Tween-20 0.02％)洗涤磁珠20次，收集最后一次清洗液，然后洗脱，加入200μl去离子水重悬磁珠，95℃5min，冰上放置5min，置于磁力架上静置2min，收集洗脱液，即为结合ssDNA。
(4)将孵育后上清液、最后一次清洗液及洗脱液以每孔100μl的量加入96孔荧光检测微孔板，使用1420Victor 3多标记分析仪进行荧光检测，其中激发波长494nm，发射波长522nm，反应时间1.0s，连续光能量1000。(结果见图4)
图4结果表明各组核酸适配体均与(1,3)-β-D-葡聚糖结合，以G1-45的结合力最高，其二级结构如图5所示。G1-45为本发明提供的与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体。
实施例六核酸适配体解离常数的检测
选取核酸适配体G1-45进行解离常数检测，固定生物素标记的(1,3)-β-D-葡聚糖与链霉亲和素磁珠复合物的浓度(1×107磁珠量)与不同浓度(0-500nM)荧光标记的核酸适配体进行反应，将孵育后上清液、最后一次清洗液及洗脱液以每孔100μl的量加入96孔荧光检测微孔板，利用LB943微孔板式发光仪检测不同浓度核酸适配体的荧光强度，然后根据核酸适配体浓度及荧光强度做出非线性饱和曲线。(结果如图6)
根据公式y＝Bmax×x/(Kd+x)，其中x为核酸适配体浓度，y为孵育后洗脱上清液的荧光强度，Bmax为核酸适配体与靶标的最大结合量，利用GraphPad Prism 5.0拟合计算得到Kd值为14.05±3.98nM。
实施例七利用流式细胞术方法对样品中(1,3)-β-D-葡聚糖进行检测及特异性实验
FAM(6-羧基荧光素)标记的生物素化的核酸适配体：5′-FAM-TCCAAGC-N45-TTTTTT-Biotin(N45在此表示本发明提供的与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体)
BHQ1(黑洞淬灭基团1)标记的互补DNA：5′-CATTGGGCTTGG-BHQ1
选取核酸适配体G1-45，检测样品中(1,3)-β-D-葡聚糖。
磁珠预处理，即将商品化的10mg/ml链霉亲和素磁珠悬混液0.3μl于1.5ml EP管中，置于磁力架上，用2x结合洗涤液清洗3次，加入1x结合洗涤液重悬待用；
DNA连接，取1.5μl FAM标记的生物素化的核酸适配体(浓度1μM)与8μl BHQ1标记的部分与核酸适配体互补的DNA(浓度为1μM)于100μl 1x结合洗涤液EP管中，40℃孵育10min，缓慢降温至室温；
加入预处理的磁珠，室温孵育20-30min；
加入40μl 1x结合洗涤液于EP管中，混匀后置于磁力架上2-3min，并轻轻转动EP管2-3次，使磁珠充分与磁力架结合，移去液体，清洗3次；然后加入40μl Buffer A(25mMHEPES/150mM NaCl)，按照相同的方法清洗3次后，将磁珠重悬于50μl Buffer A；
加入100μl的葡聚糖标本，室温孵育20min；
用流式细胞仪进行样品检测：用Buffer A将样品稀释至300μl，鞘液：PBS，事件数：至少20000，激发光波长490nm，发射光波长520nm，检测各样品的荧光强度。
实验结果表明，当加入FAM标记的生物素化核酸适配体后，平均荧光强度(MFI)明显增加，加入BHQ1标记的互补DNA后，MFI下降约18倍，说明与磁珠结合的DNA有很高的杂交效率。当加入(1,3)-β-D-葡聚糖后，MFI几乎全部恢复，说明(1,3)-β-D-葡聚糖能引起与磁珠结合核酸适配体构象的转换，释放BHQ1标记的互补DNA，使荧光强度增强(结果如图7)。
特异性实验结果表明，加入其他多糖，如海带多糖(Laminarin)、大麦葡聚糖(β-D-Glucan from barley)、甘露聚糖(Mannan)溶液后，MFI与加入BHQ1标记的互补DNA相近，说明上述三种多糖不能引起核酸适配体构象转变释放BHQ1标记的互补DNA，从而证明该核酸适配体与本研究中白色念珠菌来源的(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合，在基于本核酸适配体的方法检测(1,3)-β-D-葡聚糖应用中特异性好(结果如图8)。
序列表
<110> 广州医科大学附属第一医院
<120> 一种与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ccaatgagtt gtgtgtcttc tagctatgtt ggtgttgtca cctgc 45
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
cgactgacgc ctccaagc 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
gtgcgtgtga gtgtgctgtg 20
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
tccaagccca atgagttgtg tgtcttctag ctatgttggt gttgtcacct gctttttt 58
<210> 5
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
cattgggctt gg 12

Claims (9)

1.一种与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的DNA序列如SEQ ID NO.1。
2.如权利要求1所述的与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体，其特征在于，所述与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体DNA序列经过修饰、延长或截短。
3.如权利要求1所述的与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体，其特征在于，所述与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体DNA序列经替换、缺失和/或插入一个或几个核苷酸后形成与SEQ ID NO.1具有同等功能的序列。
4.如权利要求1-3所述的任一与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体在制备(1,3)-β-D-葡聚糖的定性、定量检测试剂中的应用。
5.如权利要求1-3所述的任一核酸适配在制备对侵袭性真菌感染的辅助诊断试剂中的应用。
6.一种对(1,3)-β-D-葡聚糖进行检测的方法，包含以下步骤：
⑴将权利要求1-3所述的任一与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体经过生物素和荧光标记并与过量含有淬灭基团标记的DNA孵育，所述核酸适配体与该含有淬灭基团标记的DNA链部分互补；
⑵将其与预处理的链霉亲和素磁珠孵育；
⑶清洗除去过量DNA；
⑷将含有(1,3)-β-D-葡聚糖的样品加入上述体系孵育；
⑸对检测样品荧光强度进行分析。
7.如权利要求6所述的对(1,3)-β-D-葡聚糖进行检测的方法，其特征在于所述的含有淬灭基团标记的DNA为5′-CATTGGGCTTGG-BHQ1。
8.如权利要求6所述的对(1,3)-β-D-葡聚糖进行检测的方法，其特征在于所述与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体经过生物素和荧光标记形成如下结构：5′-FAM-TCCAAGC-[权利要求1-3所述的任一与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体DNA序列]-TTTTTT-Biotin。
9.如权利要求7所述的对(1,3)-β-D-葡聚糖进行检测的方法，其特征在于所述与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体经过生物素和荧光标记形成如下结构：5′-FAM-TCCAAGC-[权利要求1-3所述的任一与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体DNA序列]-TTTTTT-Biotin。
CN201711364163.8A 2017-12-18 2017-12-18 一种与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体及其应用 Active CN108467866B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711364163.8A CN108467866B (zh) 2017-12-18 2017-12-18 一种与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711364163.8A CN108467866B (zh) 2017-12-18 2017-12-18 一种与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108467866A true CN108467866A (zh) 2018-08-31
CN108467866B CN108467866B (zh) 2021-08-24

Family

ID=63266865

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711364163.8A Active CN108467866B (zh) 2017-12-18 2017-12-18 一种与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108467866B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103642810A (zh) * 2013-11-20 2014-03-19 中山大学附属第三医院 一种核酸适配体及其筛选方法、在检测前列腺癌细胞株中的应用
CN104894243A (zh) * 2015-05-12 2015-09-09 湖南大学 用于肿瘤细胞检测的核酸适配体探针、装置及其应用
CN106124781A (zh) * 2016-07-07 2016-11-16 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种基于适配体夹心荧光淬灭技术检测去甲基睾酮的方法
CN106282193A (zh) * 2016-08-08 2017-01-04 湖南大学 人胰多肽核酸适配体及其筛选方法和应用
CN106367420A (zh) * 2016-10-17 2017-02-01 阜阳职业技术学院 特异性结合白色念珠菌中(1,3)‑β‑D‑葡聚糖的单链DNA适配子及其筛选方法和试剂

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103642810A (zh) * 2013-11-20 2014-03-19 中山大学附属第三医院 一种核酸适配体及其筛选方法、在检测前列腺癌细胞株中的应用
CN104894243A (zh) * 2015-05-12 2015-09-09 湖南大学 用于肿瘤细胞检测的核酸适配体探针、装置及其应用
CN106124781A (zh) * 2016-07-07 2016-11-16 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种基于适配体夹心荧光淬灭技术检测去甲基睾酮的方法
CN106282193A (zh) * 2016-08-08 2017-01-04 湖南大学 人胰多肽核酸适配体及其筛选方法和应用
CN106367420A (zh) * 2016-10-17 2017-02-01 阜阳职业技术学院 特异性结合白色念珠菌中(1,3)‑β‑D‑葡聚糖的单链DNA适配子及其筛选方法和试剂

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LOW SY 等: "DNA aptamers bind specifically and selectively to (1-->3)-beta-D-glucans", 《BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN》 *
TANG XL 等: "Improved detection of deeply invasive candidiasis with DNA aptamers specific binding to (1→3)-β-D-glucans from Candida albicans", 《EUR J CLIN MICROBIOL INFECT DIS》 *
王丽 等: "基于核酸适配体的荧光法检测水胺硫磷和丙溴磷", 《分析化学》 *
赵猛: "ssFABS--SELEX筛选C4--HSL特异性适配体及其体外抑制铜绿假单胞菌生物膜形成的研究", 《万方数据库》 *
陈源: "可溶性(1,3)-β-D-葡聚糖的提取及其DNA适配体筛选的研究", 《万方数据库》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108467866B (zh) 2021-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108034658B (zh) 一种检测人葡萄膜黑色素瘤细胞的核酸适体
JPH0343099A (ja) 増幅した遺伝子を使用する配列のアツセイ
CN106834295A (zh) 一种特异识别细菌脂多糖的广谱核酸适配体及其定向筛选方法
CN106544434A (zh) 多交叉扩增结合金纳米生物传感检测单增李斯特菌的方法
CN104561008A (zh) 同型半胱氨酸核酸适体HCy1及其制备方法
CN112094847B (zh) 幽门螺旋杆菌检测用核酸适配体与筛选检测方法及用途
CN103789338B (zh) 质粒、重组工程菌及制备均一分子量透明质酸的方法
CN113444773B (zh) 一种基于液相芯片检测蜱虫病原体核酸的方法及试剂盒
Zhou et al. A label-free AuNP bioprobe-assisted CRISPR/Cas12a colorimetric platform for high-throughput detection of Staphylococcus aureus ST398
CN108467866A (zh) 一种与(1,3)-β-D-葡聚糖特异性结合的核酸适配体及其应用
CN114350670A (zh) 特异性识别可溶性st2蛋白的核酸适配体及其应用
CN106442987A (zh) 金黄色葡萄球菌的荧光检测试剂盒及其使用方法
CN114457083A (zh) 一组特异识别孔雀石绿的单链dna核酸适配体及其应用
CN101429545A (zh) 一种应用悬浮芯片技术检测志贺氏菌方法
CN113249386A (zh) 一种甲氨蝶呤的核酸适配体、核酸适配体衍生物及其应用
CN112575065A (zh) 基于杂交链式反应放大输出信号的检测方法及其检测试剂盒
CN101487047B (zh) 一种应用悬浮芯片技术检测霍乱弧菌o1方法
Jiang et al. A Study of the Detection of SARS-CoV-2 by the Use of Electrochemiluminescent Biosensor Based on Asymmetric Polymerase Chain Reaction Amplification Strategy
CN104561010A (zh) 同型半胱氨酸核酸适体HCy5及其制备方法
CN106854649B (zh) 金黄色葡萄球菌肠毒素c2的核酸适配体c204及其筛选方法和应用
CN106801059B (zh) 金黄色葡萄球菌肠毒素c2的核酸适配体c205及其筛选方法和应用
CN107937402A (zh) 一种特异性识别谷胱甘肽核酸适体gsh1及其衍生物
CN107937403A (zh) 高亲和力谷胱甘肽核酸适体gsh3及其衍生物
Xiluan et al. Chemiluminescent detection of platelet derived growth factor-BB based on sandwich label-free aptasensor and biotin–streptavidin strategy
CN108396029B (zh) 一组特异性识别不同生长时期大肠杆菌o157:h7的寡核苷酸适配体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant