CN108467849A - 一种皮肤细胞分散液 - Google Patents

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高文涛
乐畅
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Abstract

本发明提供了一种适用于快速消化分解皮肤活组织的混合液，该悬液可以将皮肤组织分散为单个细胞，加入细胞基质后进行扩增培养。

Description

一种皮肤细胞分散液
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及了一种适用于快速消化分解皮肤活组织的混合液，该悬液可以将皮肤组织分散为单个细胞，加入细胞基质后进行扩增培养。
背景技术
细胞培养是生物学和医学研究最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。进行原代培养可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件，因为细胞刚刚从活体组织分离出来，更接近于生物体内的生活状态。利用此方法还可直接服务于临床实践。
进行原代培养的关键步骤在于将取代的样本消化为单个活细胞，这一限速步骤关系到原代培养的成功与否。现有的方法主要包括机械法或化学法，干扰因素较多，成功几率不高。
发明内容
在本发明提供了一种适用于快速消化分解皮肤活组织的混合液，该悬液可以将皮肤组织分散为单个细胞，加入细胞基质后进行扩增培养。
技术方案如下：
1. 实验准备：
实验解剖器材(眼科剪，眼科镊，手术刀，200目细胞筛)高压灭菌121℃ 20min
25ml Hu16培养基的配制：
20ng/ml bFGF +10ng/ml CT+ 20μg/ml IBMX
+1*gentamicin
+10%FBS
+1*青链霉素溶液
+DMEM/F12
2.取皮
皮肤样本处理：将皮肤组织用手术刀裁成1cm2大小，共5份，然后用0.01MPBS（含1%双抗）洗涤2-3次。
3.分散消化
用新的眼科剪和眼科镊将1cm2皮肤剪碎，约1mm3大小，移入含20ml 0.25%胰酶的50ml离心管中；
将5个离心管置于37℃水浴锅中，消化30-60min。
消化方案如表1
表1：
消化时，每5min颠倒混匀一次，使胰酶于皮肤组织充分接触，于30min和60min取细胞悬液做台盼蓝染色并计数活细胞数目。
台盼蓝染色步骤：
1.、4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时，用PBS稀释至0.4%。
3、染色：细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9:1混合混匀。（终浓度0.04%）
4、计数：在5分钟内，分别计数活细胞和死细胞。
5、镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。
6、统计细胞活力：活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%
结果：镜下观察细胞，未见明显死细胞，大多数细胞保持完整细胞膜结构。细胞计数：胰酶0.25%-0.15%消化30min，细胞数105数量级；胰酶0.25%-0.15%消化60min，细胞数有所减少。
4.培养
消化60min后，200目细胞筛过滤，滤液转移至新的50ml离心管中，750rpm离心5min，1500rpm离心5min，弃上清
用0.01MPBS（含1%双抗）洗涤1次，1500rpm离心5min，弃上清
用完全培养基重悬细胞，接种于6孔板中，于37℃ 5%CO2 95%湿度培养箱中培养并观察。
胰酶浓度设置：0.25% 0.20% 0.15% 消化15min 20min 30min，其他同上
优选的，0.25% 0.20%胰酶消化皮肤组织，消化15-20min细胞计数达108数量级。最终确认0.25%胰酶消化15-20min为 最佳选择。
上述实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种皮肤分散液，其特征在于快速消化分解皮肤活组织。
2.如权利要求2所述的分散液，特征在于可以将皮肤组织分散为单个细胞，加入细胞基质后进行扩增培养。
3.如权利要求1所述的分散液消化的皮肤组织样本，特征在于来源人的上皮。
4.如权利要求3所述的方法取得的皮肤样本，进行消化分散的主要步骤如下：
1)将样本用剪刀剪碎约1mm3大小；
2)用0.01MPBS（含1%双抗）洗涤2-3次；
3)加分散液；
4)置于37℃水浴锅中，消化30-60min；
5)于30min和60min取细胞悬液，台盼蓝染色并计数活细胞数目；
6)消化60min后，200目细胞筛过滤；
7)用0.01MPBS（含1%双抗）洗涤1次，1500rpm离心5min，弃上清；
8)用完全培养基重悬细胞，接种于6孔板中，于37℃ 5%CO2 95%湿度培养箱中培养并观察。
5.如权利要求4中所述的步骤，特征在于皮肤样本要用眼科剪和眼科镊剪碎，优选的，约1mm3大小。
6.如权利要求4中所述的消化，特征在于消化时，每5min颠倒混匀一次，使于皮肤组织充分接触。
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