CN114835847A - 一种温敏性水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种温敏性水凝胶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种温敏性水凝胶及其制备方法和应用，所述制备方法包括如下步骤：在惰性气体下，将单体和交联剂溶于溶剂中，得到混合液；向混合液中加入引发剂进行反应，得到LCST型凝胶；将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡，除去未反应的单体和交联剂，即得所述温敏性水凝胶；本发明通过将上述温敏性水凝胶与胰岛和辅助细胞共培养，能够将各细胞吸附在凝胶上，并同时保持胰岛和辅助细胞的活性，再经相变拉近细胞间间距，有利于细胞发挥其特异性功能。

Description

一种温敏性水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及温敏性水凝胶技术领域，具体涉及一种温敏性水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
根据国际糖尿病联盟最新发布的统计数据显示，截止至2021年，全球20-79岁的成年人中有5.37亿人患有糖尿病(占该年龄组所有人口的10.5％)，预计到2030年这一数字将上升到6.43亿人。在此期间世界人口预计将增长20％，而患有糖尿病的人数预计增长幅度将高达46％，为总人口增长幅度的2倍。目前绝大多数糖尿病患者的治疗方式仍主要依赖胰岛素注射。然而胰岛素治疗并不能预防糖尿病并发症(即心血管疾病、肾病和低血糖)。另外，由于所有1型糖尿病患者以及部分2型糖尿病患者都需要胰岛素，因此随着糖尿病病患人数的不断增加，对胰岛素的需求量也将激增。
胰岛移植长期以来被认为是逆转糖尿病最有希望的治疗方法之一，并在过去20年中引起了广泛关注。胰岛移植不仅提供了胰岛素独立性的可能性，还提供了对抗糖尿病相关并发症的长期益处。尽管持续研究在一定程度上已经取得突破性成果，但长期免疫抑制和器官短缺仍然是制约胰岛移植的两个主要因素，也因此让胰岛移植无法推广成为普适性降糖手段。另外，与其他细胞移植类似，移植后的胰岛面临体内免疫排斥、局部免疫炎症反应、缺血等种种问题，导致移植后胰岛功能丧失以及胰岛死亡。
为了提高胰岛移植的临床适用性，增强移植后胰岛存活率和功能，曾使用胰岛表面功能化，即使用生物材料负载活性因子改变胰岛表面性质，增强其移植后体内抗炎和血管化能力。也构建了人工胰岛，解决器官供给不足的瓶颈问题。同样，将胰岛与干细胞(ips细胞、胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、内皮祖细胞)、血管内皮细胞(以及具有血管内皮功能的细胞)、免疫细胞(包括淋巴管内皮细胞、调节性T细胞、T细胞、B细胞、单核细胞如巨噬细胞)、神经细胞(神经干细胞、神经元细胞)等细胞，后文统称为辅助细胞共移植也能够通过减少即时炎症反应和增强胰岛血管化来维持移植后胰岛功能和存活；因此，提供一种能够同时保持胰岛与辅助细胞活性，并将这些细胞固定在胰岛周围的材料尤为关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一种温敏性水凝胶及其制备方法和应用，该温敏性水凝胶能够同时保持胰岛和辅助细胞的活性，并能够通过相变拉近细胞间间距，有利于细胞发挥其特异性功能。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种温敏性水凝胶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(a)在惰性气体下，将单体和交联剂溶于溶剂中，得到混合液，其中，所述单体选自2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(DEGMA)、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(OEGMA，n＝9)、甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐(AEMA)、丙烯酰胺(AAm和N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)中的至少一种；
(b)向混合液中加入引发剂进行反应，得到LCST型凝胶；
(c)将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡，除去未反应的单体和交联剂，即得所述温敏性水凝胶。
优选地，所述交联剂选自聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEGDMA，n＝4或14)、60％甲基丙烯酰基取代的甲基丙烯酰化明胶(GelMA 60％)和30％甲基丙烯酰基取代的甲基丙烯酰化明胶(GelMA 30％)中的一种。
优选地，所述引发剂选自偶氮二异丁腈(AIBN)、2-羟基-4’-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮(2959)和苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)中的一种。
优选地，所述交联剂为聚乙二醇二甲基丙烯酸酯时，所述单体、交联剂和引发剂的摩尔比为(80～100)∶(0.8～20)∶0.7；
所述交联剂为60％甲基丙烯酰基取代的甲基丙烯酰化明胶或30％甲基丙烯酰基取代的甲基丙烯酰化明胶时，所述单体、交联剂和引发剂的质量比为(7～15)∶(1～5)∶(0.1～0.4)。
优选地，所述引发剂为偶氮二异丁腈时，所述反应为：在65～75℃下反应5～7h；
所述引发剂为2-羟基-4’-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮或苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂时，所述反应为：在室温下，365nm紫外光照射0.8～1.2h。
优选地，所述浸泡时间为2～4天，且每间隔5～8h更换一次蒸馏水。
本发明第二方面提供一种上述制备方法制得的温敏性水凝胶。
本发明第三方面提供一种上述制备方法制得的温敏性水凝胶在胰岛体外培养或制备胰岛体内移植材料中的应用。
本发明第四方面提供一种胰岛体内移植材料，所述胰岛体内移植材料由上述制备的方法制得的温敏性水凝胶、胰岛和辅助细胞共培养制得；所述辅助细胞选自干细胞、免疫细胞和神经细胞中的至少一种。
本发明第五方面提供一种胰岛体外培养方法，所述培养方法包括：将胰岛和上述制备的方法制得的温敏性水凝胶共培养。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
本发明制备方法制得的温敏性水凝胶在低于特定相转变温度Tm的低温条件下(如4℃)使用该类水凝胶负载胰岛细胞及辅助细胞，保证细胞活力的基础上，再将水凝胶-细胞共置于高于相转变温度的环境下(如，37℃)进行培养。由于环境温度升高，高于相转变温度，水凝胶发生相转变，体积变小而导致辅助细胞与胰岛细胞及其他细胞间的相互接近，从而将辅助细胞与胰岛细胞等其他细胞在空间上固定，有利于体外培养保存细胞的存活；同时，这种相转变带来的细胞拉近也有利于移植后辅助细胞发挥其特异性功能如抗炎、促进血管的生成及血运重建、辅助胰岛神经网络化等等，保存胰岛功能和活性。
本发明通过将上述温敏性水凝胶与胰岛和辅助细胞共培养，能够将各细胞吸附在凝胶上，并同时保持胰岛和辅助细胞的活性，再经相变拉近细胞间间距，有利于细胞发挥其特异性功能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为本发明实施例8以及13～21的温敏水凝胶的扫描电镜图；
图2为本发明实施例8制备的温敏性水凝胶的不同温度下透射比；
图3为本发明实验例2中温敏性水凝胶和胰岛内皮细胞在4℃和37℃下共培养的水凝胶表面的共聚焦激光扫描显微镜观察结果；
图4为本发明实验例3中温敏性水凝胶和胰岛内皮细胞体外共培养过程中细胞死亡率；
图5为本发明实验例4中温敏性水凝胶和胰岛内皮细胞体外共培养后胰岛细胞分泌胰岛素情况。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例1
本实施例为一种温敏性水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)在氩气气体下，将相对分子质量为188的DEGMA、相对分子质量为330的PEGDMA(n＝4)溶于1,4-二氧六环中，得到混合液；
(b)在氩气气氛下，向混合液中加入相对分子质量为164的AIBN并在70℃下反应5h反应，得到LCST型凝胶；
(c)将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡3天，且每间隔6h更换一次蒸馏水，即得上述温敏性水凝胶；
上述制备方法中DEGMA、PEGDMA和AIBN的摩尔比为80∶20∶0.7。
实施例2
本实施例为一种温敏性水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)在氩气气体下，将相对分子质量为188的DEGMA、相对分子质量为330的PEGDMA(n＝4)溶于1,4-二氧六环中，得到混合液；
(b)在氩气气氛下，向混合液中加入相对分子质量为164的AIBN并在70℃下反应5h反应，得到LCST型凝胶；
(c)将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡3天，且每间隔6h更换一次蒸馏水，即得上述温敏性水凝胶；
上述制备方法中DEGMA、PEGDMA和AIBN的摩尔比为95∶5∶0.7。
实施例3
本实施例为一种温敏性水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)在氩气气体下，将相对分子质量为188的DEGMA、相对分子质量为496的OEGMA、相对分子质量为330的PEGDMA(n＝4)溶于1,4-二氧六环中，得到混合液；
(b)在氩气气氛下，向混合液中加入相对分子质量为164的AIBN并在70℃下反应5h反应，得到LCST型凝胶；
(c)将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡3天，且每间隔6h更换一次蒸馏水，即得上述温敏性水凝胶；
上述制备方法中DEGMA、OEGMA、PEGDMA和AIBN的摩尔比为90∶10∶5∶0.7。
实施例4
本实施例为一种温敏性水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)在氩气气体下，将相对分子质量为188的DEGMA、相对分子质量为496的OEGMA、相对分子质量为330的PEGDMA(n＝14)溶于1,4-二氧六环中，得到混合液；
(b)在氩气气氛下，向混合液中加入相对分子质量为164的AIBN并在70℃下反应5h反应，得到LCST型凝胶；
(c)将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡3天，且每间隔6h更换一次蒸馏水，即得上述温敏性水凝胶；
上述制备方法中DEGMA、OEGMA、PEGDMA和AIBN的摩尔比为90∶10∶5∶0.7。
实施例5
本实施例为一种温敏性水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)在氩气气体下，将相对分子质量为188的DEGMA、相对分子质量为496的OEGMA、相对分子质量为330的PEGDMA(n＝14)溶于1,4-二氧六环中，得到混合液；
(b)在氩气气氛下，向混合液中加入相对分子质量为164的AIBN并在70℃下反应5h反应，得到LCST型凝胶；
(c)将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡3天，且每间隔6h更换一次蒸馏水，即得上述温敏性水凝胶；
上述制备方法中DEGMA、OEGMA、PEGDMA和AIBN的摩尔比为90∶10∶2.5∶0.7。
实施例6
本实施例为一种温敏性水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)在氩气气体下，将相对分子质量为188的DEGMA、相对分子质量为496的OEGMA、相对分子质量为330的PEGDMA(n＝14)溶于1,4-二氧六环中，得到混合液；
(b)在氩气气氛下，向混合液中加入相对分子质量为164的AIBN并在70℃下反应5h反应，得到LCST型凝胶；
(c)将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡3天，且每间隔6h更换一次蒸馏水，即得上述温敏性水凝胶；
上述制备方法中DEGMA、OEGMA、PEGDMA和AIBN的摩尔比为90∶10∶1∶0.7。
实施例7
本实施例为一种温敏性水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)在氩气气体下，将相对分子质量为188的DEGMA、相对分子质量为330的PEGDMA(n＝14)溶于1,4-二氧六环中，得到混合液；
(b)在氩气气氛下，向混合液中加入相对分子质量为164的AIBN并在70℃下反应5h反应，得到LCST型凝胶；
(c)将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡3天，且每间隔6h更换一次蒸馏水，即得上述温敏性水凝胶；
上述制备方法中DEGMA、PEGDMA和AIBN的摩尔比为100∶1∶0.7。
实施例8
本实施例为一种温敏性水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)在氩气气体下，将相对分子质量为188的DEGMA、相对分子质量为165.6的AEMA、相对分子质量为330的PEGDMA(n＝14)溶于1,4-二氧六环中，得到混合液；
(b)在氩气气氛下，向混合液中加入相对分子质量为164的AIBN并在70℃下反应5h反应，得到LCST型凝胶；
(c)将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡3天，且每间隔6h更换一次蒸馏水，即得上述温敏性水凝胶；
上述制备方法中DEGMA、AEMA、PEGDMA和AIBN的摩尔比为98∶2∶0.8∶0.7。
实施例9
本实施例为一种温敏性水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)在氩气气体下，将相对分子质量为188的DEGMA、相对分子质量为165.6的AEMA、相对分子质量为71的AAm、相对分子质量为330的PEGDMA(n＝14)溶于1,4-二氧六环中，得到混合液；
(b)在氩气气氛下，向混合液中加入相对分子质量为164的AIBN并在70℃下反应5h反应，得到LCST型凝胶；
(c)将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡3天，且每间隔6h更换一次蒸馏水，即得上述温敏性水凝胶；
上述制备方法中DEGMA、AEMA、AAm、PEGDMA和AIBN的摩尔比为93∶2∶5∶0.8∶0.7。
实施例10
本实施例为一种温敏性水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)在氩气气体下，将相对分子质量为188的DEGMA、相对分子质量为71的AAm、相对分子质量为330的PEGDMA(n＝14)溶于1,4-二氧六环中，得到混合液；
(b)在氩气气氛下，向混合液中加入相对分子质量为164的AIBN并在70℃下反应5h反应，得到LCST型凝胶；
(c)将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡3天，且每间隔6h更换一次蒸馏水，即得上述温敏性水凝胶；
上述制备方法中DEGMA、AAm、PEGDMA和AIBN的摩尔比为95∶5∶0.8∶0.7。
实施例11
本实施例为一种温敏性水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)在氩气气体下，将相对分子质量为113的NIPAM、相对分子质量为71的AAm、相对分子质量为330的PEGDMA(n＝14)溶于1,4-二氧六环中，得到混合液；
(b)在氩气气氛下，向混合液中加入相对分子质量为164的AIBN并在70℃下反应5h反应，得到LCST型凝胶；
(c)将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡3天，且每间隔6h更换一次蒸馏水，即得上述温敏性水凝胶；
上述制备方法中NIPAM、AAm、PEGDMA和AIBN的摩尔比为95∶5∶0.8∶0.7。
实施例12
本实施例为一种温敏性水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)在氩气气体下，将相对分子质量为113的NIPAM、相对分子质量为71的AAm、相对分子质量为330的PEGDMA(n＝14)溶于1,4-二氧六环中，得到混合液；
(b)在氩气气氛下，向混合液中加入相对分子质量为164的AIBN并在70℃下反应5h反应，得到LCST型凝胶；
(c)将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡3天，且每间隔6h更换一次蒸馏水，即得上述温敏性水凝胶；
上述制备方法中NIPAM、AAm、PEGDMA和AIBN的摩尔比为98∶2∶0.8∶0.7。
实施例13
本实施例为一种温敏性水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)在氩气气体下，将相对分子质量为113的NIPAM、GelMA 60％溶于蒸馏水中，得到混合液；
(b)在氩气气氛下，向混合液中加入2959并在365nm紫外光照射1h，得到LCST型凝胶；
(c)将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡3天，且每间隔6h更换一次蒸馏水，即得上述温敏性水凝胶；
上述制备方法中NIPAM、GelMA60％和2959的质量比为15∶1∶0.1。
实施例14
本实施例为一种温敏性水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)在氩气气体下，将相对分子质量为113的NIPAM、GelMA60％溶于蒸馏水中，得到混合液；
(b)在氩气气氛下，向混合液中加入2959并在365nm紫外光照射1h，得到LCST型凝胶；
(c)将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡3天，且每间隔6h更换一次蒸馏水，即得上述温敏性水凝胶；
上述制备方法中NIPAM、GelMA60％和2959的质量比为7.5∶2.5∶0.1。
实施例15
本实施例为一种温敏性水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)在氩气气体下，将相对分子质量为113的NIPAM、GelMA 60％溶于蒸馏水中，得到混合液；
(b)在氩气气氛下，向混合液中加入2959并在365nm紫外光照射1h，得到LCST型凝胶；
(c)将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡3天，且每间隔6h更换一次蒸馏水，即得上述温敏性水凝胶；
上述制备方法中NIPAM、GelMA 60％和2959的质量比为15∶5∶0.1。
实施例16
本实施例为一种温敏性水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)在氩气气体下，将相对分子质量为113的NIPAM、GelMA30％溶于蒸馏水中，得到混合液；
(b)在氩气气氛下，向混合液中加入LAP并在365nm紫外光照射1h，得到LCST型凝胶；
(c)将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡3天，且每间隔6h更换一次蒸馏水，即得上述温敏性水凝胶；
上述制备方法中NIPAM、GelMA 30％和LAP的质量比为10∶1∶0.1。
实施例17
本实施例为一种温敏性水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)在氩气气体下，将相对分子质量为113的NIPAM、GelMA 30％溶于蒸馏水中，得到混合液；
(b)在氩气气氛下，向混合液中加入LAP并在365nm紫外光照射1h，得到LCST型凝胶；
(c)将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡3天，且每间隔6h更换一次蒸馏水，即得上述温敏性水凝胶；
上述制备方法中NIPAM、GelMA 30％和LAP的质量比为10∶2∶0.2。
实施例18
本实施例为一种温敏性水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)在氩气气体下，将相对分子质量为113的NIPAM、GelMA 30％溶于蒸馏水中，得到混合液；
(b)在氩气气氛下，向混合液中加入LAP并在365nm紫外光照射1h，得到LCST型凝胶；
(c)将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡3天，且每间隔6h更换一次蒸馏水，即得上述温敏性水凝胶；
上述制备方法中NIPAM、GelMA 30％和LAP的质量比为10∶4∶0.4。
实施例19
本实施例为一种温敏性水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)在氩气气体下，将相对分子质量为113的NIPAM、GelMA 30％溶于蒸馏水中，得到混合液；
(b)在氩气气氛下，向混合液中加入LAP并在365nm紫外光照射1h，得到LCST型凝胶；
(c)将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡3天，且每间隔6h更换一次蒸馏水，即得上述温敏性水凝胶；
上述制备方法中NIPAM、GelMA 30％和LAP的质量比为1∶7∶0.7。
实施例20
本实施例为一种温敏性水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)在氩气气体下，将相对分子质量为113的NIPAM、GelMA 30％溶于蒸馏水中，得到混合液；
(b)在氩气气氛下，向混合液中加入LAP并在365nm紫外光照射1h，得到LCST型凝胶；
(c)将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡3天，且每间隔6h更换一次蒸馏水，即得上述温敏性水凝胶；
上述制备方法中NIPAM、GelMA 30％和LAP的质量比为5∶7∶0.7。
实施例21
本实施例为一种温敏性水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)在氩气气体下，将相对分子质量为113的NIPAM、GelMA 30％溶于蒸馏水中，得到混合液；
(b)在氩气气氛下，向混合液中加入LAP并在365nm紫外光照射1h，得到LCST型凝胶；
(c)将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡3天，且每间隔6h更换一次蒸馏水，即得上述温敏性水凝胶；
上述制备方法中NIPAM、GelMA 30％和LAP的质量比为10∶7∶0.7。
实验例1
实验例1
分别获取实施例8以及13～21中制备得到的温敏性水凝胶；
分别对上述实施例8以及13～21的温敏性水凝胶进行电子显微镜扫描，扫描结果如图1所示，图1中a～j依次对应实施例8以及13～21的温敏性水凝胶；由图1可知，得到不同温敏性水凝胶的平均孔径，孔径大小如表1所示。
其中，通过紫外分光光度计(PerkinElmerTM Lambda35)测量不同温敏性水凝胶的相转变温度；实施例8制备的温敏性水凝胶的检测结果如图2所示，不同温敏水凝胶的检测结果如表1所示；
表1部分温敏性水凝胶的相转变温度及其平均孔径
Figure BDA0003650357780000131
Figure BDA0003650357780000141
由表1可知：
Gel-01和Gel-02在低温条件表现出明显的疏水性质，不适宜细胞培养，因此为了提高凝胶的性能，本工作在聚合物中引入了更多亲水性单体或更长的交联剂，然后合成了Gel-03、Gel-04、Gel-05、Gel-06和Gel-07五种凝胶，发现其中Gel-03-05也不具有良好的细胞粘附性，Gel-06和Gel-07的相转变温度，分别为49.0℃和32.5℃，无法满足本应用所需要求。Gel-09、Gel-10、Gel-11和Gel-12的相转变温度过高，在37℃时仍显示出亲水性质，即未发生相转变。Gel-13呈液态，Gel-14成半流体态，故这两种凝胶也没有用于细胞培养。
除Gel-08外，Gel-15、Gel-16、Gel-17和Gel-18与血管内皮细胞共培养后，也发现细胞可以很好地附着在凝胶表面生长，并有成管化趋势，以及促进胰岛功能的效果。Gel-19-21相转变温度过高，不适于本应用。
实验例2
本实验例为一种采用实施例8制备的温敏性水凝胶体外培养胰岛的研究，将实施例8制备的温敏性水凝胶切割成适当大小的小块，用无菌PBS溶液洗涤三次，并用紫外线照射灭菌6小时；将胰岛内皮MS1细胞以及小鼠胰岛添加到两个含有小块凝胶的细胞培养孔板中进行共培养；设两个平行组，体外培养环境(95％氧气/5％二氧化碳，RPMI1640培养基)，并用VybrantTM Dil试剂标记MS1细胞，每组在4℃冰箱中培养5h后转移到37℃恒温培养箱中；然后用共聚焦激光扫描显微镜观察凝胶表面细胞及胰岛形态，同时观察内皮细胞与胰岛之间关系；观察结果如图3所示；
图3为胰岛(白色虚线圈出部分)与胰岛内皮细胞(亮光部分)与实施例8的水凝胶共培养的共聚焦激光扫描显微镜图像(5X)；可见细胞状态良好，在37℃相转变后，由于基质胶本身的温敏特性，胰岛与周围胰岛内皮细胞距离更加接近。
实验例3
本实验例为一种采用实施例8制备的温敏性水凝胶和胰岛的体外共培养研究；
将实施例8制备的温敏性水凝胶切割成适当大小的小块，用无菌PBS溶液洗涤三次，并用紫外线照射灭菌6小时；将胰岛内皮MS1细胞以及小鼠胰岛分别添加到含有小块凝胶的细胞培养孔板和不含小块凝胶的细胞培养孔板中进行共培养(对照组)，体外培养环境(95％氧气/5％二氧化碳，RPMI1640培养基)；培养3天后，检测小鼠胰岛内胰岛细胞的存活情况，检测结果如图4所示；
由图4可知，可见本发明水凝胶和胰岛内皮MS1细胞共培育后，胰岛细胞平均死亡率较未共培养对照组显著降低。
实验例4
本实验例为实施例8水凝胶与胰岛共培育和未使用水凝胶培养胰岛的体外环境培养3天后的胰岛分泌胰岛素功能情况研究：
实验方法：将实施例8制备的温敏性水凝胶切割成适当大小的小块，用无菌PBS溶液洗涤三次，并用紫外线照射灭菌6小时；将胰岛内皮MS1细胞以及小鼠胰岛分别添加到含有小块凝胶的细胞培养孔板和不含小块凝胶的细胞培养孔板中进行共培养(对照组)，体外培养环境(95％氧气/5％二氧化碳，RPMI1640培养基)；培养1天后，吸出培养基，添加含有2mmol/L葡萄糖的组织培养液培养1-2小时，收集上清液之后，添加含有20mmol/L高浓度葡萄糖的组织培养液对胰岛细胞进行刺激，时间为30分钟-1小时，此后收集培养液上清。对在2mmol/L和20mmol/L葡萄糖浓度下收集的上清液样品分别进行胰岛素ELISA检测，并得出在20mmol/L高浓度葡萄糖刺激下胰岛素分泌量与2mmol/L基础胰岛素含量的比值，评估胰岛功能。
实验结果如图5所示；由图5可知，水凝胶和胰岛内皮MS1细胞共培育后，胰岛在高浓度葡萄糖刺激下分泌胰岛素的能力(体现为高糖刺激后培养环境中胰岛素量与未刺激基准水平培养环境中胰岛素量的比值)较未共培养对照组显著增强。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (10)

1.一种温敏性水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)在惰性气体下，将单体和交联剂溶于溶剂中，得到混合液，其中，所述单体选自2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐、丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺中的至少一种；
(b)向混合液中加入引发剂进行反应，得到LCST型凝胶；
(c)将LCST型凝胶置于蒸馏水中进行浸泡，除去未反应的单体和交联剂，即得所述温敏性水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述交联剂选自聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、60％甲基丙烯酰基取代的甲基丙烯酰化明胶和30％甲基丙烯酰基取代的甲基丙烯酰化明胶中的一种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述引发剂选自偶氮二异丁腈、2-羟基-4’-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮和苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂中的一种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述交联剂为聚乙二醇二甲基丙烯酸酯时，所述单体、交联剂和引发剂的摩尔比为(80～100)∶(0.8～20)∶0.7；
所述交联剂为60％甲基丙烯酰基取代的甲基丙烯酰化明胶或30％甲基丙烯酰基取代的甲基丙烯酰化明胶时，所述单体、交联剂和引发剂的质量比为(7～15)∶(1～5)∶(0.1～0.4)。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述引发剂为偶氮二异丁腈时，所述反应为：在65～75℃下反应5～7h；
所述引发剂为2-羟基-4’-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮或苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂时，所述反应为：在室温下，365nm紫外光照射0.8～1.2h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述浸泡时间为2～4天，且每间隔5～8h更换一次蒸馏水。
7.权利要求1～6任一所述的制备方法制得的温敏性水凝胶。
8.权利要求1～6任一所述的制备方法制得的温敏性水凝胶在胰岛体外培养或制备胰岛体内移植材料中的应用。
9.一种胰岛体内移植材料，其特征在于，所述胰岛体内移植材料由权利要求1～6任一所述的制备的方法制得的温敏性水凝胶、胰岛和辅助细胞共培养制得；所述辅助细胞选自干细胞、免疫细胞和神经细胞中的至少一种。
10.一种胰岛体外培养方法，其特征在于，所述培养方法包括：将胰岛和权利要求1～6任一所述的制备的方法制得的温敏性水凝胶共培养。
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