CN108456744A

CN108456744A - 一个珍味稻耐储藏qtl的分子标记及育种应用

Info

Publication number: CN108456744A
Application number: CN201810459242.5A
Authority: CN
Inventors: 杜雪; 隋福权; 段庆松
Original assignee: Jiangsu Gao Hang Agricultural Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Zhongken Seed Industry Co.,Ltd.
Priority date: 2018-05-15
Filing date: 2018-05-15
Publication date: 2018-08-28
Anticipated expiration: 2038-05-15
Also published as: CN108456744B

Abstract

本发明公开了一个珍味稻耐储藏QTL的分子标记及育种应用，属于水稻遗传育种学领域。本发明首先公开了与珍味稻耐储藏QTL qSVS3连锁的两个分子标记，RM161和RM7415，同时公开了该两个分子标记的引物对序列。在含有QTL qSVS3的水稻材料中，采用分子标记RM161能扩增出约165bp的特异条带，采用分子标记RM7415能扩增出136bp特异条带，因此，可通过该两个分子标记检验待鉴定水稻材料是否含有珍味稻耐储藏QTL qSVS3，从而加快了耐储藏水稻分子标记辅助选择育种进程。

Description

一个珍味稻耐储藏QTL的分子标记及育种应用

技术领域

本发明公开了一个珍味稻耐储藏QTL的分子标记及育种应用，属于水稻遗传育种学领域。

背景技术

水稻（Oryza sativa L.）是草本稻属的一种，也是稻属中作为粮食的最主要最悠久的一种，原产中国，七千年前中国长江流域就种植水稻。我国是水稻生产古国和世界上最大的稻米生产国，对我国的经济发展和人民生活具有极其重要的意义。目前，在我国三大主要粮食作物水稻、小麦、玉米中，水稻不论是播种面积还是产量都位居第一。水稻所结子实即稻谷，稻谷脱去颖壳后称糙米，糙米碾去米糠层即可得到大米。世界上近一半人口，都以大米为食。水稻除可食用外，还可以酿酒、制糖作工业原料，稻壳、稻秆，可以作为饲料。我国水稻主产区主要是东北地区、长江流域、珠江流域。水稻不仅属于直接经济作物，还是世界上三分之一人类的主食。因此，水稻对我国的粮食安全具有举足轻重的意义。

稻米（包括稻谷、大米）在储藏过程中发生的种用品质和食用品质下降的现象称为陈化。稻米陈化既与稻米自身品种有关，又与环境因素有关。水稻种子的耐储藏性能不但影响其萌发出来的植株的活力，而且与其后代的生产和管理密切相关。在中国，由于受高温高湿气候影响，种子老化变质的速度加快，从而严重影响稻谷的储藏。据不完全统计，中国每年由于稻谷储藏过程中的陈化变质、仓储害虫以及霉变等影响所造成的稻谷损失数量达数百亿斤，大约占总储存量的3%，直接经济损失不低于200亿元。另一方面，由于稻谷储藏时的发芽率下降所带来的直接和间接经济损失数目更是惊人。目前，国内主要通过建造大量的低温库和气调库来控制稻谷储藏环境的温度和湿度，以实现延长稻谷储藏时间的目的，然而，这需以高额成本为代价。

水稻耐贮藏特性的研究对水稻生产和粮食贮藏安全具有十分重要的意义。长期以来，为了保证水稻种子具有较强的生活力和保持稻米原有的食味品质，人们基本上都是采用降低温度、湿度和使用化学药剂等手段来延长稻谷的贮藏时间和提高种子发芽率。但这种方法的成本高且化学药剂易污染稻米，水稻耐储性是由仓储害虫、微生物浸染、种子含水量、环境温度和湿度、加工处理过程等外部因素与籼粳粒型、脂肪酸和淀粉的构成、谷壳及米糠抗氧化物等品种内在因素综合作用的结果。目前，在水稻耐贮藏中通过调控温、湿度来延长贮藏时间的研究报导较多，而从品种自身的特性出发进行耐贮藏资源的筛选和耐贮藏品种的选育研究还处于起步阶段，从水稻的基因型着手解决储藏过程中生活力下降和食味品质变差的问题是一条切实可行的办法，能从根本上解决贮藏粮食难题，降低仓储成本。

近年来，随着基因组测序等多种技术实现突破，基因组学、表型组学等多门“组学”及生物信息学得到迅猛发展，作物育种理论和技术也发生了重大变革。以分子标记育种、转基因育种、分子设计育种为代表的现代作物分子育种技术逐渐成为了全世界作物育种的主流。由于传统育种工作依赖于育种家的经验和机遇，往往存在很大的盲目性和不可预测性，而分子育种能显著提高育种效率，为保障我国粮食安全、生态安全提供更强有力的技术支撑。分子标记辅助育种是利用分子标记与决定目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测分子标记，即可检测到目的基因的存在，达到选择目标性状的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。分子标记辅助育种可作为鉴别亲本亲缘关系，回交育种中数量性状和隐性性状的转移、杂种后代的选择、杂种优势的预测及品种纯度鉴定等各个育种环节的辅助手段。

发明内容

本发明从一个优良的耐储藏水稻品种珍味稻内挖掘到了一个耐储藏QTL qSVS3，QTL qSVS3定位于5号染色体上SSR标记RM161和RM7415之间，应用该两个分子标记选育耐储藏水稻品种，扩增稳定、简单易行、方便快捷，大大加快筛选效率。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一个珍味稻耐储藏QTL的分子标记及育种应用，其特征在于：一个珍味稻耐储藏QTLqSVS3有两个连锁分子标记，为RM161和RM7415，RM161上游引物序列如 SEQ ID NO.1 所示，RM161下游引物序列如SEQ ID NO.2 所示；QTL qSVS3的分子标记RM7415上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，RM7415下游引物序列如SEQ ID NO.4所示。

所述珍味稻耐储藏主效QTL的分子标记方法包含以下步骤：

采用改进的种子陈化方法处理待鉴定水稻材料种子，然后检测种子的出芽率，根据出芽率差异将种子耐储藏能力进行分级；提取待鉴定水稻材料的总DNA，用权利要求1所述的分子标记RM161和RM7415的两对引物分别进行PCR扩增；制备6%变性聚丙烯酰胺凝胶，分别取PCR扩增产物进行电泳分离，银染显影；若分子标记RM161能扩增出约165bp特异条带；且分子标记RM7415能扩增出136bp特异条带，则判定为待鉴定水稻材料含有珍味稻耐储藏QTLqSVS3。

所述的分子标记RM161和RM7415的两个引物对在耐储藏水稻育种中的应用。

所述的改进的种子陈化方法为：种子陈化处理在人工气候箱内进行，将待鉴定材料种子分装于网袋中，种子摊开平铺放置于搁架上，人工气候箱内放置盛有4%过氧化氢水溶液的敞口容器，控制贮藏条件为：温度40℃，相对湿度≥90%，处理时间为15天，处理期间经常翻动网袋，以保证条件均一。

所述的种子耐储藏能力进行分级的具体方法为：将发芽率为0的水稻材料标记为0，0＜发芽率≤10%的水稻材料标记为1，10%＜发芽率≤20%的水稻材料标记为2，20%＜发芽率≤30%的水稻材料标记为3，30%＜发芽率≤40%的水稻材料标记为4，40%＜发芽率≤50%的水稻材料标记为5，发芽率＞50%的水稻材料标记为6。

本发明的有益效果：

1、本发明公开的珍味稻耐储藏主效QTL qSVS3是前人尚未报道过的全新的耐储藏QTL，预测着该位点具有新的耐储藏基因，本发明定位的耐储藏QTL qSVS3的LOD值为3.63，贡献率为23.6%，在所公开文献的耐储藏数量性状中属于效果比较显著的数量性状位点，说明该位点具有稳定表达的耐储藏基因，而且该性状来源于大田生产中米质优质的水稻品种珍味稻，因此更便于开发利用和生产实践。

2、本发明公开的珍味稻耐储藏主效QTL qSVS3定位于5号染色体上SSR标记RM161和RM7415之间，而SSR标记RM161和RM7415是较早开发的水稻分子标记，扩增非常稳定，而且操作简单易行，方便快捷，从而大大加快了筛选效率。

具体实施方式

下面结合实施案例对本发明作进一步说明，而非限制本发明。

实施例1

2014年11月初，选择当年大田新收获的多年生产实践发现耐储藏性能差异明显的30个水稻品种新收获种子，烘干处理破休眠后鉴定发芽率，选择发芽率均大于92%的14个水稻品种进行自然老化试验，2015年11月8号鉴定统计自然老化下的14个品种的种子发芽率。2015年12月选择该14个水稻品种新收获种子烘干处理破休眠后进行发芽率鉴定，发现发芽率均大于90%，品种间发芽率无显著差异，筛选颗粒饱满、无破损的种子在实验室内采用本发明的人工老化方法和前人报道的两种人工老化方法（化学法和高温高湿法）进行处理，统计该三种方法下试验水稻种子的发芽率差异，结果如下表1。

其中，化学法种子陈化方法流程为：将种子放入三角瓶中，加入50%甲醇溶液50ml，并盖紧瓶盖，处理20min后，迅速倒出甲醇溶液，用滤纸擦净种子表面残液，晾干后再进行发芽试验；

高温高湿法种子陈化方法流程为：在小型人工气候箱中设温度为40℃，相对湿度95%，处理时间10d。每处理50粒，设置3个重复；

本发明改进的种子人工老化方法流程为：种子陈化处理在人工气候箱内进行，将待鉴定材料种子分装于网袋中，种子摊开平铺放置于搁架上，人工气候箱内放置盛有4%过氧化氢水溶液的敞口容器，控制贮藏条件为：温度40℃，相对湿度≥90%，处理时间为15天，处理期间经常翻动网袋，以保证条件均一。

水稻耐储藏性研究方法主要有两种：自然老化和人工老化。自然老化是指利用种子在自然储藏或种质保存的条件下发芽力逐渐丧失的特征对其进行耐储藏性研究的方法。它比较符合种子储藏的自然特性，但由于其历时较长，因此难以广泛应用于实际研究中。人工老化是指利用人工方法加速种子老化速度来研究其耐储藏性的方法。它能够克服自然老化所需时间较长的不足，所以被大量应用于种子的耐储藏性能研究。但是人工老化法毕竟模拟于自然老化，因此，种子老化结果与自然老化需要尽量保持一致才有意义。由表1不同种子陈化方法人工模拟自然老化状态下的水稻种子发芽率损失与自然老化种子发芽率的差异比较可以发现，本发明改进的种子陈化方法相对比于目前常用的两种种子人工老化处理方法：化学法和高温高湿法，本发明采用的改进的人工老化和自然老化在种子发芽率结果上呈现更好的一致性。

实施例2

珍味稻耐储藏主效QTL qSVS3的分子标记的定位步骤如下。

（1）构建定位群体

以优良的耐储藏水稻品种珍味稻为母本，不耐储水稻品种徐稻3号为父本，配制杂种F1，构建了包含228个单株的F2分离群体，F2单株自交获得F2:3家系。

（2）F2:3家系亲子代耐储藏表型鉴定

采用改进的种子人工老化方法处理F2:3家系亲代和子代材料，处理完成后检测种子的发芽率，根据芽率差异将种子耐储藏能力进行分级，将发芽率为0的水稻材料标记为0，0＜发芽率≤10%的水稻材料标记为1，10%＜发芽率≤20%的水稻材料标记为2，20%＜发芽率≤30%的水稻材料标记为3，30%＜发芽率≤40%的水稻材料标记为4，40%＜发芽率≤50%的水稻材料标记为5，发芽率＞50%的水稻材料标记为6。

（3）提取待鉴定水稻材料的总DNA并进行PCR扩增

采用改进的CTAB法提取珍味稻、徐稻3号及其F2:3家系总DNA，PCR反应在eppendorf5333型PCR仪中进行，反应程序为：a、94℃预变性5min；b、94℃变性30s；c、55℃退火30s；d、72℃延伸30s，35个循环；e、72℃延伸6min；f、4℃保存；采用10µl的扩增体系，PCR扩增体系：总体积10µl，包含50ng/µl模板DNA1.5µl，各0.4µmol/L正反向引物1.5µl，25mmol/L Mg²⁺0.75µl，10×PCR Buffer1µl，10mmol/L dNTP 0.15µl，1000U Taq polymerase 0.1µl，ddH₂O 5µl；制备6%变性聚丙烯酰胺凝胶，每份材料吸取3~4µL PCR产物进行电泳分离，然后将电泳后的胶放入银染液中固定，蒸馏水冲洗后把胶放入显影液中显影。

（4）基因型分析和遗传连锁图谱构建

将来源于母本珍味稻的带型记为A，来源于父本徐稻3号的带型记为B，杂合带型记为H，缺失记为“-”，采用卡方测验判断 F2和F2:3家系是否发生标记偏分离，显著水平P≤0.01，并分析其特征、类型及在染色体上的分布；利用Map Maker/EXP 3.0软件对标记数据进行连锁分析，采用Kosambi函数转换遗传距离，最大遗传距离定位为50cM，连锁数据用Kosambi函数输出，用软件Map Chart 2.2绘制遗传连锁图。

（5）QTL定位

利用QGAStation软件对性状的表型值进行条件分析，运用QTL ICImapping v2.2的完备区间分析法对各性状进行非条件和条件QTL定位，在5号染色体上检测到的一个QTL位点，位于分子标记RM161和RM7415之间11.6CM的区间内，LOD值为3.63，贡献率为23.6%，采用McCouch等的方法命名为qSVS3。

（6）qSVS3在水稻材料耐储藏性能鉴定中的应用

分别采用分子标记RM161和RM7415的两对引物分别进行PCR扩增；制备6%变性聚丙烯酰胺凝胶，分别取PCR扩增产物进行电泳分离，银染显影；若分子标记RM161能扩增出约165bp特异条带；且分子标记RM7415能扩增出136bp特异条带，则判定为待鉴定水稻材料含有珍味稻耐储藏QTL qSVS3，从而加快了耐储藏水稻的筛选效率。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。

序列表

<110> 江苏高航农业科技有限公司

<120> 一个珍味稻耐储藏QTL的分子标记及育种应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgcagatgag aagcggcgcc tc 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtgtcatca gacggcgctc cg 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atctgtctga aaccccctcc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaactcgcat cagatcaccc 20

Claims

1.一个珍味稻耐储藏QTL的分子标记及育种应用，其特征在于：一个珍味稻耐储藏QTLqSVS3有两个连锁分子标记，为RM161和RM7415，RM161上游引物序列如 SEQ ID NO.1 所示，RM161下游引物序列如SEQ ID NO.2 所示；QTL qSVS3的分子标记RM7415上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，RM7415下游引物序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的一个珍味稻耐储藏QTL的分子标记及育种应用，其特征在于：所述珍味稻耐储藏主效QTL的分子标记方法包含以下步骤：

3.根据权利要求1和2所述的一个珍味稻耐储藏QTL的分子标记及育种应用，所述的分子标记RM161和RM7415的两个引物对在耐储藏水稻育种中的应用。

4.根据权利要求2所述的一个珍味稻耐储藏QTL的分子标记及育种应用，所述的改进的种子陈化方法为：种子陈化处理在人工气候箱内进行，将待鉴定材料种子分装于网袋中，种子摊开平铺放置于搁架上，人工气候箱内放置盛有4%过氧化氢水溶液的敞口容器，控制贮藏条件为：温度40℃，相对湿度≥90%，处理时间为15天，处理期间经常翻动网袋，以保证条件均一。

5.根据权利要求2所述的一个珍味稻耐储藏QTL的分子标记及育种应用，所述的种子耐储藏能力进行分级的具体方法为：将发芽率为0的水稻材料标记为0，0＜发芽率≤10%的水稻材料标记为1，10%＜发芽率≤20%的水稻材料标记为2，20%＜发芽率≤30%的水稻材料标记为3，30%＜发芽率≤40%的水稻材料标记为4，40%＜发芽率≤50%的水稻材料标记为5，发芽率＞50%的水稻材料标记为6。