CN108445142A - 一种铑片纳米酶在模拟生物酶催化中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种铑片纳米酶在模拟生物酶催化中的应用,本发明提供的铑片纳米酶在模拟生物酶催化中的应用,相比于目前常见的铑催化氢化反应,本发明开发了一种全新的铑片纳米酶的催化应用,同时具有极高的模拟过氧化物酶活性、模拟氧化物酶活性、模拟超氧化物歧化酶活性和模拟过氧化氢酶活性4种催化活性,具有宽泛的pH值和温度使用范围,这使其更能适应各种催化、检测的复杂环境条件中,利于进一步拓展应用范围,可作为一种新颖的多功能纳米酶用于免疫分析、生化检测和临床诊断等领域,具有非常良好的市场前景和较高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于纳米酶领域,涉及一种铑片纳米酶在模拟生物酶催化中的应用。
背景技术
自单层石墨烯问世以来,一系列二维类石墨烯层状材料相继被报道。由于比表面积大、活性位点多、催化活性可调节和较高的稳定性,二维类石墨烯材料作为模拟酶已受到了材料、化学和生物等领域广泛的关注。如少数层金属纳米片、过渡金属硫化物、过渡金属氧化物、石墨相氮化碳、层状双氢氧化物、金属-有机框架材料等,表现出了类似辣根过氧化物酶(HRP)性质,在生物催化剂、生物传感器和生物药等领域展示出了较大的应用潜力。然而,当前的纳米酶研究存在几个突出的问题:(1)层状材料的催化效率不够高,活性相对HRP还较差;(2)材料主要表现出类似过氧化物酶性质,而其它模拟酶性质未得到充分探索,因而催化功能较单一;(3)在更广泛的意义上,纳米酶的组成多限于碳基材料以及含有Fe、Co、Ni、Mn、Au、Pt、Ag、Cu、Pd、W、Mo、Ce、Ru、Ir等的金属或其合金、氧化物、硫化物和卤化物等,而对其它元素如Rh等的利用则很少。因此,有必要开发一种高效而多功能的新型超薄层纳米酶,从而拓宽模拟酶的应用范围,以便更好地服务于生化检测、免疫分析和临床诊断等实际应用中。
理论上,材料表面原子暴露得越多,催化剂与反应物接触就越有利,催化活性就越高。而单原子层金属纳米片,其暴露的活性原子具有最大的不饱和配位,应能达到高效的表面催化效率。特别重要的是,以单层金属纳米材料为模型研究其模拟酶性质,可为探寻其表面催化机制从而实现高活性纳米酶设计提供有益的指导。然而,迄今为止,单原子层金属纳米酶尚未被报道。
因此,如何开发一种单原子层金属纳米酶应用于模拟酶催化中,具有重要的研究意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种铑片纳米酶在模拟生物酶催化中的应用。
为达到此发明目的,本发明采用以下技术方案:
本发明提供了一种铑片纳米酶在模拟生物酶催化中的应用。
本发明提供的铑片纳米酶在模拟生物酶催化中的应用,相比于目前常见的铑催化氢化反应,本发明开发了一种全新的铑片纳米酶的催化应用,同时具有极高的模拟过氧化物酶活性、模拟氧化物酶活性、模拟超氧化物歧化酶活性和模拟过氧化氢酶活性4种催化活性,可以通过利用不同的模拟酶活性构建不同的方法,或更进一步应用于未知的领域的催化研究中。
优选地,所述铑片纳米酶由单层铑原子组成。
在本发明中,铑片纳米酶由单层铑原子组成,使得铑原子最大程度暴露在纳米片表面,保证了铑片纳米酶的高催化活性,并且铑片对催化底物具有高亲和性,相当于HRP的亲和性。
在本发明中,单层铑片纳米酶相比于铑纳米颗粒,催化活性更高,并且同时具有4种催化活性,而现有公开的方法中的铑纳米颗粒仅有1种催化活性,应用范围有限。
优选地,所述模拟生物酶催化包括将铑片纳米酶用作模拟氧化物酶、模拟过氧化物酶、模拟超氧化物歧化酶或模拟过氧化氢酶中的任意一种或至少两种的组合进行催化。
优选地,当铑片纳米酶用作模拟氧化物酶或过氧化物酶时,所述铑片纳米酶能够催化氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、2,2'-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(ABTS)、多巴胺(DOPA)、二氨基联苯胺(DAB)或邻苯二胺(OPD)生成显色产物。
在本发明中,显色产物为催化不同的底物,底物经反应生成的与底物相对应的显色产物,而显色可以进一步作为指示剂、检测剂、分析试剂等进行其他应用。
在本发明中,铑片纳米酶对底物过氧化氢的催化最大反应的速率(Vmax)达到了68.09×10-8M·s-1,是HRP的8倍,相比于其它层状材料如单层石墨烯氧化物、少数层钯纳米片和少数层状过渡金属硫化物(硫化钼、硒化钼、硫化钨、硒化钨等)的活性高几倍到几十倍不等;此外,从催化常数(Kcat)来看,对于相同的催化底物TMB,铑片纳米酶的催化活性分别约是HRP、铑纳米粒子、少数层钯纳米片的21倍、212倍和7倍;对于相同的催化底物过氧化氢,铑片纳米酶的催化活性分别约是HRP、铑纳米粒子、少数层钯纳米片的128倍、323倍和34倍。
优选地,当铑片纳米酶用作超氧化物歧化酶模拟酶时,所述铑片纳米酶能够催化超氧自由基发生歧化反应生成过氧化氢和氧气。
优选地,当铑片纳米酶用作模拟过氧化氢酶时,所述铑片纳米酶能够催化过氧化氢反应生成水和氧气。
优选地,所述铑片纳米酶进行催化反应的pH值为2-12,例如可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。
优选地,所述铑片纳米酶进行催化反应的温度为5-85℃,例如可以是5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃或85℃。
在本发明中,铑片纳米酶具有宽泛的pH值和温度使用范围,这使其更能适应各种催化、检测的复杂环境条件中,利于进一步拓展应用范围。
优选地,当铑片纳米酶用作模拟氧化物酶或模拟过氧化物酶时,催化反应的pH值为2-6,例如可以是2、3、4、5或6,优选pH值为4。
在本发明中,当pH值为4时,铑片纳米酶的催化活性最高,超过4后,活性开始下降。
优选地,催化反应的温度为10-70℃,例如可以是10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃或70℃,进一步优选为30-60℃。
在本发明中,铑片纳米酶的催化活性,随着温度的变化而变化,从10℃到50℃,活性逐渐增大,在30℃到60℃范围内保持较高的活性,而当温度超过70℃后,活性降低,但相对活性也超过了50%,具有较宽的温度使用范围。
优选地,当铑片纳米酶用作模拟超氧化物歧化酶时,催化反应的pH值为6-8,例如可以是6、7或8,优选pH值为7-8。
优选地,催化反应的温度为5-55℃,例如可以是5℃、15℃、25℃、37℃、45℃或55℃,进一步优选为25-37℃。
优选地,当铑片纳米酶用作模拟过氧化氢酶时,催化反应的pH值为2-12,例如可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12,优选pH值为9-12。
优选地,催化反应的温度为5-85℃,例如可以是5℃、25℃、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃或85℃,进一步优选为37-75℃。
优选地,所述铑片纳米酶用作模拟过氧化物酶时,用于比色检测过氧化氢和/或黄嘌呤。
在本发明中,铑片纳米酶相比于纳米片状硒化钼、铱纳米粒子对于黄嘌呤的检测(检测限分别为1.964μM、5.2μM),具有非常低的检测限0.73μM,表现出更高的灵敏度;此外,对比同样条件下黄嘌呤衍生物、糖类化合物、代谢物或金属离子的比色检测,铑片纳米酶对黄嘌呤表现出了高度选择性。
在本发明中,所述铑片纳米酶还可以应用于制备免疫分析制剂、生物检测试剂或临床诊断试剂中。
本发明提供的铑片纳米酶在应用时,由于具有较宽的pH值与温度的适用范围,因此可以适用较宽的反应体系,可进一步进行免疫分析、生物检测或临床诊断等方面的研究。
相对于现有技术,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明提供的铑片纳米酶在模拟生物酶催化中的应用,相比于目前常见的铑催化氢化反应,本发明开发了一种全新的铑片纳米酶的催化应用,同时具有极高的模拟过氧化物酶活性、模拟氧化物酶活性、模拟超氧化物歧化酶活性和模拟过氧化氢酶活性4种催化活性,可以通过利用不同的模拟酶活性构建不同的方法,或更进一步应用于未知的领域的催化研究中。
(2)本发明提供的铑片模拟酶在模拟过氧化物酶催化中的应用时,对底物具有与HRP相当的亲和性,但同时有更高的催化活性。对底物过氧化氢,最大反应速率(Vmax)为68.09×10-8M·s-1,是HRP的8倍,也比其它层状材料如单层石墨烯氧化物、少数层钯纳米片、少数层过渡金属硫化物(如硫化钼、硒化钼、硫化钨、硒化钨)的活性高几倍到几十倍不等;从催化剂常数(Kcat)来看,对于相同的催化底物TMB,铑片纳米酶的催化活性分别约是HRP、铑纳米粒子、少数层钯纳米片的21倍、212倍和7倍;对于相同的催化底物过氧化氢,铑片纳米酶的催化活性分别约是HRP、铑纳米粒子、少数层钯纳米片的128倍、323倍和34倍。因此,铑片在过氧化物酶催化中表现出了极高的原子利用率。
(3)本发明提供的铑片纳米酶在应用时,具有宽泛的pH值和温度使用范围,这使其更能适应各种催化、检测的复杂环境条件中,利于进一步拓展应用范围,可作为一种新颖的多功能纳米酶用于免疫分析、生化检测和临床诊断等领域,具有非常良好的市场前景和较高的应用价值。
附图说明
图1是本发明实施例1和实施例2中铑片纳米酶催化氧气或过氧化氢对TMB氧化显色的溶液照片图。
图2是本发明实施例1和实施例2中铑片纳米酶催化反应产物的紫外光谱图。
图3是本发明实施例3中超氧自由基抑制率随铑片纳米酶浓度的变化关系图。
图4是本发明实施例4中铑片纳米酶对过氧化氢催化分解产生气泡的现象图。
图5是本发明实施例5中铑片纳米酶分别对ABTS、DOPA、DAB和OPD反应前后的体系颜色变化对比图。
图6是本发明实施例6中铑片纳米酶模拟氧化物酶时,缓冲液pH值对催化活性的影响曲线图。
图7是本发明实施例7中铑片纳米酶模拟氧化物酶时,温度对催化活性的影响曲线图。
图8是本发明实施例8中铑片纳米酶模拟过氧化物酶时,缓冲液pH值对催化活性的影响曲线图。
图9是本发明实施例9中铑片纳米酶模拟过氧化物酶时,温度对催化活性的影响曲线图。
图10是本发明实施例10中铑片纳米酶模拟过氧化氢酶时,与天然过氧化氢酶相比,其催化能力对温度的稳定性影响曲线图。
图11是本发明实施例11中铑片纳米酶模拟过氧化物酶检测过氧化氢时,过氧化氢浓度与检测体系在652nm处吸光度的依赖关系曲线图(图中吸光度值均为测定值扣除相应检测空白后的净值)。
图12是本发明实施例11中铑片纳米酶模拟过氧化物酶检测过氧化氢时,过氧化氢浓度与检测体系在652nm处吸光度的线性关系曲线图(图中吸光度值均为测定值扣除相应检测空白后的净值)。
图13是本发明实施例12中铑片纳米酶模拟过氧化物酶检测黄嘌呤时,黄嘌呤浓度与检测体系在652nm处吸光度的依赖关系图(图中吸光度值均为测定值扣除相应检测空白后的净值)。
图14是本发明实施例12中铑片纳米酶模拟过氧化物酶检测黄嘌呤时,黄嘌呤浓度与检测体系在652nm处吸光度的线性关系图(图中吸光度值均为测定值扣除相应检测空白后的净值)。
图15是本发明实施例13中铑片纳米酶模拟过氧化物酶对黄嘌呤检测的选择性柱状图(图中吸光度值均为测定值扣除相应检测空白后的净值)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
本发明以下实施例中,铑片纳米酶通过以下方法制备:
实施方法:参照文献(Nat.Commun.2014,5,3093)制备单层铑片,即将乙酰丙酮铑、聚乙烯吡咯烷酮溶解于苄醇和甲醛的混合液中,激烈搅拌后转移至不锈钢反应加热装置中,180℃下反应8h。反应结束后冷却至室温,将产物用丙酮析出,离心,以丙酮和乙醇的混合溶剂反复洗涤,分散于水中,得到良好分散的铑片水溶液,即铑片纳米酶。
在本发明中,涉及到的催化剂常数通过此公式计算:Kcat=Vmax/E,其中Vmax为最大反应速率,E为催化剂浓度,E值可根据假设一个纳米片为一个反应单元计算得出。
实施例1
取醋酸-醋酸钠缓冲液(pH=4),加入所制备的铑片分散液和TMB溶液,使体系中铑片和TMB浓度分别为3.75μg·mL-1和0.5mM,摇匀,室温下敞口放置10min;之后观察体系颜色变化,并扫描325~800nm紫外-可见光谱。
图1结果显示,未加入铑片分散液时体系为无色,加入铑片分散液后,体系变为蓝色,紫外-可见光谱结果如图2所示;说明铑片可以模拟氧化物酶催化氧气氧化TMB,具有类似氧化物酶活性。
实施例2
取醋酸-醋酸钠缓冲液(pH=4),加入铑片分散液、TMB溶液和过氧化氢溶液,使体系中铑片、TMB和过氧化氢浓度分别为1μg·mL-1、0.5mM和0.5mM,摇匀,室温下放置10min;之后观察体系颜色变化,并扫描325~800nm紫外-可见光谱。
图1结果显示,未加入铑片分散液时体系为无色,而加入铑片分散液后,体系变为蓝色;紫外-可见光谱结果如图2所示,相比实施例1的结果,652nm处的吸收值显著升高,说明铑片可以模拟过氧化物酶催化过氧化氢氧化TMB,具有类似过氧化物酶活性。
图1结果还表明,无论过氧化氢是否存在,铑片对TMB的氧化都具有很高的催化活性,表明铑片同时具有类似氧化物酶和类似过氧化物酶的性质。
实施例3
取PBS(pH=7),加入黄嘌呤溶液、NBT溶液,再加入一定量预先浓缩好的铑片分散液和黄嘌呤氧化酶溶液,使黄嘌呤、NBT和黄嘌呤氧化酶浓度分别为0.4mM、0.4mM和0.125U·mL-1。另外单做不加铑片分散液的控制实验。在室温下、空气中,黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系产生出的超氧自由基将NBT还原时,溶液由黄色变为蓝色,同时在560nm处出现最大吸收峰。
测定反应混合物在560nm处的吸光度,找出每分钟内吸光度的变化值与反应时间之间的线性关系,确定最佳的反应时间。最后,在最佳反应时间内,计算加入各浓度铑片前后对反应混合物吸光度的变化,得到铑片对超氧自由基的抑制率。
图3的结果显示,当体系中铑片浓度介于5.91μg·mL-1至118.13μg·mL-1时,铑片对超氧自由基的抑制率达到19.35%到74.73%;当抑制率达到50%时,需要铑片的浓度约为25.9μg·mL-1。上述结果说明,铑片具有类似超氧化物歧化酶活性。
实施例4
取醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH=9),加入过氧化氢溶液,使过氧化氢浓度为20mM,室温放置几分钟,观察离心管内气泡生成情况;之后向其中加入铑片分散液,使铑片浓度为1μg·mL-1,观察比色皿壁气泡生成情况;进一步,固定铑片浓度,将体系中过氧化氢浓度增加至50mM或100mM,观察离心管内气泡生成情况。
结果如图4所示(其中图4中从左至右依次为20mM H2O2、20mM H2O2和铑片、50mMH2O2和铑片、100mM H2O2和铑片),当体系中没有铑片存在时,离心管内无肉眼可见气泡生成,说明过氧化氢自身在室温下不会发生明显分解;当有铑片存在时,离心管内可见明显的气泡生成;随着过氧化氢浓度逐渐增加,溶液内产生的气泡逐渐增多。以上结果说明铑片可以模拟过氧化氢酶催化过氧化氢生成氧气和水,具有类似过氧化氢酶的活性。
实施例5
取醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH=4),加入铑片分散液,再加入ABTS、DOPA、DAB或OPD溶液,使铑片和显色底物浓度分别为3.75μg·mL-1和0.5mM,摇匀,室温下敞口放置10min;之后观察体系颜色变化。
结果如图5所示,未加入铑片分散液时溶液均为无色,加入铑片分散液后,溶液分别变为绿色、黄色、棕黄色或桔黄色;说明铑片可以模拟氧化物酶催化氧气氧化很多种有机显色底物,具有类似氧化物酶活性。
实施例6
取预先配制好pH值分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10的醋酸-醋酸钠缓冲液,加入铑片分散液和TMB溶液,使体系中铑片和TMB浓度分别为3.75μg·mL-1和0.5mM,室温下敞口反应20min,测定上述混合液在652nm处的吸光度。
图6结果显示,铑片对TMB的催化氧化是pH值依赖的:pH为4时,铑片的活性达到最大;当pH值超过4后,铑片的活性开始下降。
实施例7
将醋酸-醋酸钠缓冲液(pH=4)预热到设定的温度(温度分别为10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃和70℃),加入铑片分散液和TMB溶液,使体系中铑片和TMB浓度分别为3.75μg·mL-1和0.5mM,混匀后放入设定好温度的金属浴中敞口反应20min,测定上述混合液在652nm处的吸光度。
图7结果显示,温度从10℃变化到50℃,铑片活性逐渐增大;铑片在30℃到60℃范围内有较高的活性,即使温度增加到70℃,相对活性仍可超过50%。上述结果说明铑片有较宽的温度适用范围。
实施例8
取预先配制好pH值分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10的醋酸-醋酸钠缓冲液,加入铑片分散液、TMB溶液和过氧化氢溶液,使体系中铑片、TMB和过氧化氢浓度分别为1μg·mL-1、0.5mM和0.5mM,室温下敞口反应20min,测定上述混合溶液在652nm处的吸光度。
图8结果显示,在过氧化氢存在时,铑片对TMB的催化氧化是pH值依赖的:pH为4时的活性达到最大;当pH值超过4后,铑片的活性开始下降。
实施例9
取醋酸-醋酸钠缓冲液(pH=4)预热到设定的温度(温度分别为10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃、70℃),再加入铑片分散液、TMB溶液和过氧化氢溶液,使体系中铑片、TMB和过氧化氢浓度分别为1μg·mL-1、0.5mM和0.5mM,在设定好温度的金属浴中敞口反应20min,测定上述混合液在652nm处的吸光度。
图9结果显示,温度从10℃变化到40℃,铑片活性逐渐增大,40℃时达到最大;在30℃到60℃范围内有较高的活性,60℃时活性仍可达到最大活性的89%。而HRP通常在50℃以上时就变性失活,活性会大大降低。因此,铑片比HRP对高温保持更好的催化稳定性。
实施例10
取醋酸-醋酸钠缓冲液(pH=4)预热到设定的温度(5℃、25℃、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃或85℃),加入过氧化氢溶液和预先在该设定温度下保温2h的铑片分散液或天然过氧化氢酶溶液,使体系中过氧化氢、铑片或过氧化氢酶浓度分别为50mM、1μg·mL-1或16μg·mL-1,混匀,反应25min,按照上海碧云天生物技术研究所提供的过氧化氢酶检测试剂盒的方法,以试剂盒所提供的缓冲液稀释50倍,在520nm处测定上述溶液的吸光度。
图10结果显示,在5℃到45℃范围内,经过预先保温2h后的铑片的催化活性能稳定保持在95%以上;甚至当温度达到85℃,其催化活性仍能达到60%左右;而过氧化氢酶仅在37℃时有最高的活性,超过37℃后活性严重下降。因此,与过氧化氢酶相比,铑片的活性对温度有优异的稳定性。
实施例11
取预热到40℃的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH=4),加入过氧化氢溶液、TMB溶液和铑片分散液,使体系中过氧化氢浓度为1μM、1.5μM、2μM、5μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM或200μM,TMB和铑片浓度分别为1mM和1μg·mL-1,混匀,在40℃下敞口反应20min,测定上述混合液在652nm处的吸光度。考虑到铑片在溶解氧存在下具有类似氧化物酶活性,因而对体系中不加过氧化氢时溶液的吸光度单独进行了测定并扣除。
图11结果显示,吸光度值随着过氧化氢浓度增大而增大。图12结果显示,在1-200μM范围内,吸光度与过氧化氢浓度呈线性关系,估算出的过氧化氢检测限为0.17μM。
利用纳米酶的类似过氧化物酶性质检测过氧化氢有很多文献,典型的例子有:纳米片状硒化钼(MoSe2,J.Mater.Chem.B 2018,6,105-111),报道的线性检测范围和检测限分别为10-160μM和0.408μM;贵金属铱纳米粒子(Sens.Actuators B 2017,243,203-210),报道的线性检测范围和检测限分别为1-100μM和0.53μM。相比这些文献,本发明利用铑片模拟过氧化物酶得到的过氧化氢检测范围更宽,检测限更低。
这主要是因为本发明中铑片的表面结构为单层原子组成,表面铑原子充分暴露极大地提高了TMB的氧化反应速率。为此,本发明进一步进行了铑片模拟过氧化物酶催化的反应动力学研究,计算了米氏方程常数。对底物TMB,亲和性常数(Km)为0.264mM,最大反应速率(Vmax)为12.56×10-8M·s-1;对底物过氧化氢,亲和性常数(Km)为4.51mM,最大反应速率(Vmax)为68.09×10-8M·s-1。而辣根过氧化物酶对底物TMB的亲和性常数为0.434mM,最大反应速率为10×10-8M·s-1;对底物过氧化氢的亲和性常数为3.70mM,最大反应速率为8.71×10-8M·s-1。因此,铑片对底物具有与HRP相当的亲和性,但同时有更高的催化活性。同时,相比单层石墨烯纳米片(Adv.Mater.2010,22,2206-2210),贵金属钯纳米片(Nanoscale2015,7,19018-19026),少数层过渡金属硫化物纳米片(Nanoscale 2014,6,11856-11862;Biosens.Bioelectron.2014,62,302-307;J.Mater.Chem.B 2018,6,105-111;Nanoscale2017,9,11806-11813)等层状材料的类似过氧化物酶催化活性,本发明中的单层铑片的对于过氧化氢的活性提高了几倍到几十倍不等。为了评价铑片的催化效率,基于单个铑纳米片为一个反应单元的假设计算了催化剂常数(Kcat),即最大反应速率与反应中催化剂浓度的比值,对于底物TMB和过氧化氢,得到的Kcat值分别为8.2×104s-1和44.5×104s-1。与文献报道值比较,对于底物TMB而言,铑片活性分别约是HRP、铑纳米粒子、少数层钯纳米片的21倍、212倍和7倍;对于底物过氧化氢而言,铑片活性分别约是HRP、铑纳米粒子、少数层钯纳米片的128倍、323倍和34倍。
因此,本发明提供了一种同时对底物具有好的亲和性和高活性的过氧化物酶模拟酶。
实施例12
本实施例通过以下步骤检测黄嘌呤,黄嘌呤检测实验分为两步。
(1)取一定量的磷酸缓冲液(pH=7),加入黄嘌呤氧化酶溶液和黄嘌呤溶液,使此体系中黄嘌呤氧化酶浓度为0.05U·mL-1,黄嘌呤浓度为2μM、5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、60μM、80μM、100μM、150μM、200μM或500μM,25℃下孵育40min。(2)在上述溶液中,加入一定量的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH=4)、TMB溶液和铑片分散液,使体系中TMB和铑片浓度分别为1mM和1μg·mL-1,混匀,在40℃下反应20min,测定上述混合液在652nm处的吸光度。考虑到铑片在溶解氧存在下具有类似氧化物酶活性,因而对体系中不加过氧化氢时溶液的吸光度单独进行了测定并扣除。
图13结果显示,吸光度值随着黄嘌呤浓度增加而增加;当体系中黄嘌呤浓度达到200μM后,吸光度值变化基本达到平衡。图14结果显示,在2-80μM的黄嘌呤浓度范围内,吸光度值与黄嘌呤浓度呈线性关系,估算出的黄嘌呤检测限为0.73μM。而纳米片状硒化钼(MoSe2,J.Mater.Chem.B 2018,6,105-111)和贵金属铱纳米粒子(Sens.Actuators B2017,243,203-210),得到的检测限分别为1.964μM和5.2μM。因此,铑片模拟过氧化物酶检测黄嘌呤表现出了更高的灵敏度。
实施例13
本实施例以黄嘌呤衍生物(鸟嘌呤、腺嘌呤、茶碱、可可碱)、代谢物(尿酸、4-乙酰氨基酚)、糖类化合物(甘露醇、果糖)、金属离子(Mg2+、Ca2+、Zn2+),代替黄嘌呤进行反应,它们在反应体系中的浓度与黄嘌呤浓度相同,均为200μM。
图15的结果显示(吸光度值均为测定值扣除相应检测空白后的净值),同样条件下黄嘌呤衍生物、糖类化合物、代谢物或金属离子的比色检测,测出的吸光度值非常低,接近于0,而黄嘌呤吸光度值非常高,说明本发明提供的检测方法对于黄嘌呤表现出了很高的选择性。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的铑片纳米酶在模拟生物酶催化中的应用,但本发明并不局限于上述工艺步骤,即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种铑片纳米酶在模拟生物酶催化中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述铑片纳米酶由单层铑原子组成。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述模拟生物酶催化包括将铑片纳米酶用作模拟氧化物酶、模拟过氧化物酶、模拟超氧化物歧化酶或模拟过氧化氢酶中的任意一种或至少两种的组合进行催化。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,当铑片纳米酶用作模拟氧化物酶时,所述铑片纳米酶能够催化氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺、2,2'-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐、多巴胺、二氨基联苯胺或邻苯二胺生成显色产物;
优选地,当铑片纳米酶用作模拟过氧化物酶时,所述铑片纳米酶能够催化过氧化氢氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺、2,2'-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐、多巴胺、二氨基联苯胺或邻苯二胺生成显色产物;
优选地,当铑片纳米酶用作模拟超氧化物歧化酶时,所述铑片纳米酶能够催化超氧自由基发生歧化反应生成过氧化氢和氧气;
优选地,当铑片纳米酶用作模拟过氧化氢酶时,所述铑片纳米酶能够催化过氧化氢反应生成水和氧气。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述铑片纳米酶进行催化反应的pH值为2-12;
优选地,所述铑片纳米酶进行催化反应的温度为5-85℃。
6.根据权利要求4或5所述的应用,其特征在于,当铑片纳米酶用作模拟氧化物酶或模拟过氧化物酶时,催化反应的pH值为2-6,优选pH值为4;
优选地,催化反应的温度为10-70℃,进一步优选为30-60℃。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的应用,其特征在于,当铑片纳米酶用作模拟超氧化物歧化酶时,催化反应的pH值为6-8,优选pH值为7-8;
优选地,催化反应的温度为5-55℃,进一步优选为25-37℃。
8.根据权利要求4-8中任一项所述的应用,其特征在于,当铑片纳米酶用作模拟过氧化氢酶时,催化反应的pH值为2-12,优选pH值为9-12;
优选地,催化反应的温度为5-85℃,进一步优选为37-75℃。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的应用,其特征在于,所述铑片纳米酶用作模拟过氧化物酶时,用于比色检测过氧化氢和/或黄嘌呤。
10.根据权利要求4-9中任一项所述的应用,其特征在于,所述铑片纳米酶还包括在制备免疫分析制剂、制备生物检测试剂或制备临床诊断试剂的应用。
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