CN111250072A - 一种天然凹凸棒石作为天然纳米矿物酶的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种天然凹凸棒石作为天然纳米矿物酶的应用，属于酶催化技术领域。实施例的结果表明，天然凹凸棒石具有类过氧化物酶活性、类过氧化氢酶活性或类超氧化物歧化酶活性，并且具有良好的生物相容性。与蛋白酶相比，天然凹凸棒石具有储量大、易于获得、成本低、耐高温和pH值范围广等优点；相比于已研发的人工纳米酶，其又具有多功能、天然无毒(来自于自然界，不含重金属)、生物相容性好、获取简单、不需复杂的加工处理且其巨大的表面积还为细胞提供了生长、增殖的场所等优势。
Description
技术领域
本发明涉及酶催化技术领域，尤其涉及一种天然凹凸棒石作为天然纳米矿物酶的应用。
背景技术
医疗技术发展迅速，对具有更优异性能的生物材料的需求也在增长。催化材料尤其是酶已被广泛研究，因为它们对人类生理活性的调节具有很大的作用。但是，天然酶的实际使用受到限制，因为它们难以提取且价格昂贵。酶虽然体积小，但是其功能却是强大的，酶促进了生命系统中发生的大多数反应。然而，诸如高成本、稳定性差和提取困难等缺点给酶的应用带来很大限制。随着对酶的需求增加，寻找一种天然无毒、催化有效和低成本的酶成为科研工作的重中之重。目前，已经有学者在研究人工纳米酶，且取得了一定的成果，如磁性纳米酶，在人工酶领域开创了先河。
天然凹凸棒石由于其独特的纳米结构已经在材料学、催化和生物医学等许多领域有了重要的研究和应用，在催化方面，凹凸棒石由于其比表面积大和吸附能力强而被用作催化剂载体。但是，目前还未发现其在其他领域的相关应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种天然凹凸棒石作为天然纳米矿物酶的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种天然凹凸棒石作为天然纳米矿物酶的应用。
优选的，所述天然凹凸棒石具有类过氧化物酶活性、类过氧化氢酶活性或类超氧化物歧化酶活性。
优选的，所述天然凹凸棒石以分散液的形式使用，所述天然凹凸棒石的分散液的有效浓度≥1mg/mL。
优选的，所述天然凹凸棒石的分散液的制备方法包括：将所述天然凹凸棒石进行研磨处理，将所得粉末与水混合，进行超声处理，得到天然凹凸棒石分散液。
优选的，所述研磨处理的时间为20～180min，转速为20～100r/min。
优选的，所述超声处理的时间为20～180min，功率为40kHz。
优选的，当所述天然凹凸棒石具有类过氧化物酶活性或类过氧化氢酶活性时，将所述天然凹凸棒石用于酶催化的过程包括：将所述天然凹凸棒石分散液、过氧化氢溶液、底物溶液和缓冲溶液混合，进行酶催化。
优选的，所述缓冲溶液为HAc-NaAc或PB缓冲溶液，所述缓冲溶液的pH值为2～10。
优选的，当所述天然凹凸棒石具有类超氧化物歧化酶活性时，将所述天然凹凸棒石用于酶催化的过程按照SOD试剂盒的方法进行。
本发明提供了一种天然凹凸棒石作为天然纳米矿物酶的应用。实施例的结果表明，天然凹凸棒石具有类过氧化物酶活性、类过氧化氢酶活性或类超氧化物歧化酶活性，并且具有良好的生物相容性，因此，天然凹凸棒石具有天然蛋白酶的催化活性。与蛋白酶相比，天然凹凸棒石具有储量大、易于获得、成本低、耐高温和pH值范围广等优点；相比于已研发的人工纳米酶，其又具有多功能、天然无毒(来自于自然界，不含重金属)、生物相容性好、获取简单、不需复杂的加工处理且其巨大的表面积还为细胞提供了生长、增殖的场所等优势。因此，天然凹凸棒石酶活性的发现以及其储量巨大、天然无毒等优势将为其在生物医药、工业催化、环境治理等领域开发更多功能性应用提供基础，天然凹凸棒石可以成为新一代的天然酶，甚至为多功能酶，对生命健康有着重要的意义。
附图说明
图1为实施例1中天然凹凸棒石的透射电子显微镜图和扫描电子显微镜图；
图2为天然凹凸棒石在不同浓度下的细胞活力测定数据；
图3为实施例1中TMB、DAB和OPD的显色反应结果；
图4为实施例2中天然凹凸棒石与水的类过氧化物酶活性对照图；
图5为实施例3中天然凹凸棒石与水的类过氧化氢酶活性对照图；
图6为实施例4中天然凹凸棒石的类超氧化物歧化酶活性对照图。
具体实施方式
本发明提供了一种天然凹凸棒石作为天然纳米矿物酶的应用。
在本发明中，若无特殊说明，所需原料或试剂盒均为本领域技术人员熟知的市售商品。
在本发明中，所述天然凹凸棒石是一维纤维状水合镁铝硅酸盐粘土矿物，所述天然凹凸棒石的基本结构包括两层硅氧四面体层和一层八面体金属阳离子，其具有独特的层链状结构特征，晶体呈针状，纤维状或纤维集合状。在本发明中，所述天然凹凸棒石具有大的表面积和孔体积、较强的吸附性、良好的热稳定性以及H+、Na+和K+的优异交换性。
在本发明中，所述天然凹凸棒石的氧化物含量如表1所示：
表1天然凹凸棒石的氧化物含量
| 成分 | SiO<sub>2</sub> | Al<sub>2</sub>O<sub>3</sub> | Fe<sub>2</sub>O<sub>3</sub> | Na<sub>2</sub>O | K<sub>2</sub>O | CaO | MgO | MnO | TiO<sub>2</sub> | 灼减 |
| 含量 | 55.6-60.5 | 9.0-10.1 | 5.7-6.7 | 0.03-0.11 | 0.96-1.30 | 0.42-1.95 | 10.7-11.35 | 0.61 | 0.32-0.63 | 10.53-11.30 |
在本发明中，采用常规方法对天然凹凸棒石进行微量元素光谱分析，所得分析结果如表2所示，单位：Y/kg
表2天然凹凸棒石的微量元素光谱分析结果
| 元素 | Cu | Pb | Zn | Cr | No | Bi | W | Sn | Ca | Ge |
| 含量 | 35-50 | ≤10 | 40-60 | 30-60 | <1 | <10 | <30 | <10 | <5 | <5 |
| 元素 | Ag | V | Co | Cd | As | Be | Sb | Ni | Ti | Mn |
| 含量 | <0.5 | 60-100 | <10 | <30 | <100 | <1 | <30 | 20-30 | 2500-3500 | 400-700 |
在本发明中，天然凹凸棒石具有巨大的比表面积(129.415m2/g)，而且天然凹凸棒石含有Fe等金属元素，能够发挥催化功能，作为其具有酶催化活性的基础。
本发明所用天然凹凸棒石优选购自河南省巩义市元亨净水材料厂。
在本发明中，所述天然凹凸棒石优选以分散液的形式使用，所述天然凹凸棒石的分散液的有效浓度≥1mg/mL。在本发明的实施例中，为了便于测定所述天然凹凸棒石的酶催化活性，所述天然凹凸棒石分散液的浓度优选为1～5mg/mL，更优选为1.5～3.5mg/mL。
在本发明中，所述天然凹凸棒石的分散液的制备方法包括：将所述天然凹凸棒石进行研磨处理，将所得粉末与水混合，进行超声处理，得到天然凹凸棒石分散液。在本发明中，所述研磨处理的时间优选为20～180min，更优选为50～150min，转速优选为20～100r/min，更优选为50～80r/min；所述超声处理的时间优选为20～180min，更优选为50～150min，功率优选为40kHz。本发明通过控制研磨处理和超声处理的条件，能够保证天然凹凸棒石具有优异的酶活性。
在本发明中，所述天然凹凸棒石具有类过氧化物酶活性、类过氧化氢酶活性或类超氧化物歧化酶活性。
在本发明中，当所述天然凹凸棒石具有类过氧化物酶活性时，将所述天然凹凸棒石用于酶催化的过程优选包括：将所述天然凹凸棒石分散液、过氧化氢溶液、底物溶液和缓冲溶液混合，进行酶催化。在本发明中，所述过氧化氢溶液作为电子受体，便于催化底物发生氧化反应。在本发明中，所述缓冲溶液优选为HAc-NaAc或PB缓冲溶液，所述缓冲溶液的pH值优选为2～10，更优选为3～7。本发明优选根据不同的酶催化反应对所述缓冲溶液的具体pH值进行调整。本发明对所述过氧化氢溶液和底物溶液的浓度没有特殊的限定，根据具体酶催化反应进行调整即可。
在本发明的实施例中，研究所述天然凹凸棒石的类过氧化物酶活性的过程优选包括以下两种方法：
第一种方法：将50μLTMB溶液(用DMSO溶解，浓度为10mg/mL)放在0.9mLPB缓冲液(0.2M，pH 3.6)中，并置于透明小瓶中，然后依次向其中加入100μL H2O2(30％)和50μL天然凹凸棒石分散液(浓度为1mg/mL)，然后分别用DAB(3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐)或OPD(邻苯二胺)替换TMB，重复上述步骤，观察试剂的颜色变化。在本发明中，所述第一种方法中，以过氧化氢为电子受体，天然凹凸棒石催化底物(DAB、OPD或TMB)氧化，产生显色反应。
在本发明中，所述第一种方法中，通过对显色反应的结果观察，实现对天然凹凸棒石具有酶活性的定性分析。
第二种方法：将200μL H2O2(30％)、100μL TMB(3,3,5,5-四甲基联苯胺)和100μL天然凹凸棒石分散液(浓度为1mg/mL)依次添加到1.8mL浓度为0.1M HAc-NaAc缓冲溶液(pH＝3.6)中，其中，TMB被用作底物来显示过氧化物酶活性的显色反应，然后用Lambda 650S UV-Vis分光光度计在一定的反应时间内记录显色反应的吸光度(对于652nm的TMB)，研究天然凹凸棒石类似过氧化物酶的活性。在本发明中，所述第一种方法中，以过氧化氢为电子受体，天然凹凸棒石催化底物TMB氧化。
在本发明中，所述第二种方法可以验证天然凹凸棒石具有类过氧化物酶的酶活性，并且通过计算其吸光度值实现定量分析，在具体实施例中，可以通过计算天然凹凸棒石的吸光度与时间形成的线性曲线的斜率，侧面反应其催化速度的高低。
在本发明中，当所述天然凹凸棒石具有类过氧化氢酶活性时，研究所述天然凹凸棒石的过氧化氢酶活性的过程优选包括以下步骤：在便携式溶解氧设备(HQ30d-hach)上使用氧电极测量氧气的浓度，在室温下进行天然凹凸棒石的过氧化氢酶活性测定。将0.4mL(2.5mg/mL)天然凹凸棒石分散液加到5.0mL缓冲溶液(0.1M PB缓冲液，pH＝7.0)中，然后添加100μL H2O2溶液(30％(wt/vol))，在不同的反应时间测量产生的O2溶解度(单位：mg/L)。
在本发明中，当所述天然凹凸棒石具有类超氧化物歧化酶活性时，将所述天然凹凸棒石用于酶催化的过程按照SOD试剂盒的方法进行。在本发明的实施例中，具体是按照说明书使用SOD测定试剂盒在室温下进行天然凹凸棒石的超氧化物歧化酶活性测定，并使用浓度为5mg/mL天然凹凸棒石的超氧化物歧化酶的酶活性表示为对WST对超氧化物的响应的抑制百分比，其中WST为SOD测定试剂盒中所用材料。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
前处理
将所述天然凹凸棒石进行研磨处理180min(转速为50r/min)，将所得粉末与水混合，进行超声处理180min(超声功率为40kHz)，得到天然凹凸棒石分散液，所述天然凹凸棒石分散液的浓度为1～5mg/mL，分别为1mg/mL、2.5mg/mL和5mg/mL。
性能测试
1)天然凹凸棒石的形貌结构表征：
通过日本电子JSM-7500F冷场发射扫描电子显微镜和透射电子显微镜(JEOL，型号JEM-1400)对实施例1的天然凹凸棒石分散液进行测试，结果如图1所示，其中a为透射电子显微镜图，b为扫描电子显微镜图。由图1可知，天然凹凸棒石具有规则的棒状结构，总体而言，凹凸棒石是分散的，由许多直径为10～50nm的小束聚集成纤维束，长约几百纳米不等，并且许多杂质吸附在凹凸棒石表面。
2)天然凹凸棒石生物相容性的测试：
试剂：cck-8试剂盒购自Sigma-Aldrich。
方法：按照cck-8试剂盒说明书进行实验操作。
结果发现，天然凹凸棒石具有良好的生物相容性，在浓度为250mg/μL时对HepG2细胞没有杀伤(如图2)，故基于天然凹凸棒石良好生物相容性的生物医学材料有巨大的发展潜力。
实施例1
天然凹凸棒石具有类过氧化物酶的催化活性(定性测试)：
试剂：3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)购自Sigma-Aldrich Inc.(USA)，3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)和邻苯二胺(OPD)均购自国药集团化学试剂有限公司。
方法：将50μLTMB溶液(在DMSO中为10mg/mL)置于0.9mL 0.2M PB缓冲液(pH＝3.6)中，并置于透明小瓶中，依次向瓶中加入100μL H2O2(30％(wt/vol))和50μL天然凹凸棒石分散液(1mg/mL)，然后分别用DAB或OPD替换TMB，重复上述步骤。
结果：五分钟后，可观察到如图3所示试剂的颜色变化，这证明了天然凹凸棒石具有类过氧化物酶活性，可催化现有过氧化物酶(比如辣根过氧化物酶)催化的不同底物进而显色。
实施例2
天然凹凸棒石具有类过氧化物酶的催化活性(定量测试)：
试剂：3,3,5,5-四甲基联苯胺(3,3,5,5-Tetramethyylbenzidine，TMB)，购自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30％H2O2和醋酸钠购自北京化学试剂公司。
方法：将200μL H2O2(30％)、100μL TMB和100μL天然凹凸棒石分散液(浓度为1mg/mL)依次添加到1.8mL浓度为0.1M的HAc-NaAc缓冲溶液(pH＝3.6)中，其中，TMB被用作底物来显示过氧化物酶活性的显色反应，然后用Lambda 650S UV-Vis分光光度计在一定的反应时间内记录显色反应的吸光度(对于652nm处的TMB)，以表达天然凹凸棒石的类似过氧化物酶活性。
结果：图4为天然凹凸棒石与对照组(水)在H2O2存在的情况下催化TMB的类过氧化物酶活性对照图，由图可知，在该体系中，天然凹凸棒石的催化动力学曲线斜率为对照组(H2O)的7.41倍。
实施例3
天然凹凸棒石具有类过氧化氢酶的催化活性：
试剂：30％H2O2和醋酸钠购自北京化学试剂公司。
方法：将0.4mL(2.5mg/mL)天然凹凸棒石分散液加入含有100μL 30％H2O2溶液的5.1mL缓冲溶液(0.1M PB缓冲液，pH＝7.0)中，通过使用便携式溶解氧装置(HQ30d-hach)上的氧电极测量体系中的氧浓度。
结果：图5为天然凹凸棒石与对照组(水)催化H2O2产生氧气的类过氧化氢酶活性对照图，由图可知，在该体系中，天然凹凸棒石可催化H2O2分解为H2O和O2，与对照组(H2O)相比，能够导致体系中的O2浓度增加。
实施例4
天然凹凸棒石具有类超氧化物歧化酶的催化活性：
试剂：SOD试剂盒购自获自Amresco。
方法：使用浓度为5mg/mL的天然凹凸棒石，根据SOD试剂盒制造商的说明书进行超氧化物歧化酶活性的测定，将其活性表示为天然凹凸棒石对WST响应的抑制百分比。
结果：超氧化物歧化酶可降低比H2O2更具活性的超氧自由基(O2 -·)的量。图6为天然凹凸棒石的类超氧化物歧化酶酶活性图，由图可知，天然凹凸棒石展现出一定的类超氧化物歧化酶活性。超氧化物是人体内的一种强氧化物，人体中该物质的酶含量极低，由该实施例可见，可以利用天然凹凸棒石的天然无毒、储量大、获取方便等特性应用于体内清除超氧化物。
由以上实施例可知，本发明提供了一种天然凹凸棒石作为天然无机酶在酶催化领域中的应用，所述天然凹凸棒石具有酶催化活性。实施例的结果表明，天然凹凸棒石具有过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性，并且具有良好的生物相容性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种天然凹凸棒石作为天然纳米矿物酶的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述天然凹凸棒石具有类过氧化物酶活性、类过氧化氢酶活性或类超氧化物歧化酶活性。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述天然凹凸棒石以分散液的形式使用，所述天然凹凸棒石的分散液的有效浓度≥1mg/mL。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述天然凹凸棒石的分散液的制备方法包括：
将所述天然凹凸棒石进行研磨处理，将所得粉末与水混合，进行超声处理，得到天然凹凸棒石分散液。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述研磨处理的时间为20～180min，转速为20～100r/min。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述超声处理的时间为20～180min，功率为40kHz。
7.根据权利要求3～6任一项所述的应用，其特征在于，当所述天然凹凸棒石具有类过氧化物酶活性或类过氧化氢酶活性时，将所述天然凹凸棒石用于酶催化的过程包括：将所述天然凹凸棒石分散液、过氧化氢溶液、底物溶液和缓冲溶液混合，进行酶催化。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述缓冲溶液为HAc-NaAc或PB缓冲溶液，所述缓冲溶液的pH值为2～10。
9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，当所述天然凹凸棒石具有类超氧化物歧化酶活性时，将所述天然凹凸棒石用于酶催化的过程按照SOD试剂盒的方法进行。
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