CN101579355A - 一种维护线粒体功能的营养组合物及其应用 - Google Patents
一种维护线粒体功能的营养组合物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101579355A CN101579355A CNA2009100850185A CN200910085018A CN101579355A CN 101579355 A CN101579355 A CN 101579355A CN A2009100850185 A CNA2009100850185 A CN A2009100850185A CN 200910085018 A CN200910085018 A CN 200910085018A CN 101579355 A CN101579355 A CN 101579355A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- compositions
- ubiquinone
- free radical
- selenium
- vitamin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
本发明提供一种维护保养线粒体功能的营养组合物，它是辅酶Q10、硒元素和自由基清除剂的组合；所述组分的重量比为：辅酶Q10∶硒元素∶自由基清除剂＝0.5～2∶0.001∶1～3；所述自由基清除剂可以是各种用于减少自由基损伤的化合物、中药提取物或它们的组合。本发明提供的组合物在维护保养线粒体功能上与任何单一组分相比具有互补增强的效果，能提高“呼吸链”传递电子制造ATP的活性，保护线粒体DNA免受损伤。以该组合物为核心成分制成的药物或保健品可用于延缓衰老、预防老年退行性疾病的发生、以及用于心脑血管疾病的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种维护线粒体功能的营养组合物，及其制备方法。
背景技术
本发明涉及发明人对呼吸链和线粒体研究的一项突破性进展，即发现了呼吸链电子漏旁路，并提出了线粒体自由基代谢的概念。根据这一概念可以确定呼吸链和ATP酶偶联在一起就是一部坐落在线粒体内膜上的“分子发动机”，一个细胞内有很多的线粒体，每个线粒体内又有很多这样的“分子发动机”，如此巨大的“分子发动机”群成为维持和推动细胞生命活动的动力。如果多数“分子发动机”被损伤，细胞将失去必要的能量供给，其结果将是耗能最大的神经和肌肉组织发生病变并引起衰老、衰竭、和死亡。过去对“呼吸链”的研究主要是在探讨“呼吸链”传递电子的功能，“呼吸链”传递电子是把食物中固化的太阳能释放出来用于制造ATP的过程。本发明人在对“呼吸链”的一项研究中，突破性地发现了“呼吸链”在传递电子制造ATP的同时也通过漏电旁路制造O2 -.和H2O2，这些O2 -.和H2O2是氧毒性分子具有潜在危害性。过多的O2 -.和H2O2会引起“分子发动机”自身的氧化损伤，这种自身的氧化损伤正是细胞衰老的内在原因。
图1引自发明人发表的科学论文(Xu Jian-xing 2004 Ann.N.Y.Acad.Sci.1011：57-60)，该图根据呼吸链电子漏旁路原理和线粒体自由基代谢的概念描述了“分子发动机”的工作原理。图的下半部分表示呼吸链传递电子与ATP酶偶联制造ATP的过程，相当于“分子发动机”做“有用功”；图的上半部分表示呼吸链漏电子进行自由基代谢的过程，相当于“分子发动机”做“无用功”。根据热力学原理，任何热机做“无用功”都是导致机器磨损老化的内在原因。
基于这一原理本发明从维护保养“分子发动机”的角度提出一种营养组合物，能够有效抑制上述的氧化损伤，维护线粒体的功能，改善细胞的能量供给，延长细胞的寿命。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种能够维护保养线粒体功能、延缓细胞衰老的组合物。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
提供一种维护保养线粒体功能的组合物，其中含有辅酶Q10、硒元素和自由基清除剂；所述自由基清除剂可以是各种用于减少自由基损伤的化合物、中药提取物或它们的组合；所述组分的重量比为：辅酶Q10∶硒元素∶自由基清除剂＝0.5～2∶0.001∶1～3。
所述自由基清除剂选自维生素E、维生素C、硫辛酸、丹参素或β-胡萝卜素中的一种或两种以上的混合物。
所述硒元素可以来自无机硒微量元素或有机硒制品，如纳米硒、亚硒酸钠、依布硒啉等富硒制品。
本发明还提供所述组合物在制备维护线粒体功能的药物或保健品中的应用。
所述应用是以所述组合物为药效成分，结合制药生产上可接受的常规辅料，按照常规方法制备成药物片剂，胶丸，或胶囊；或以所述组合物为活性成分，按照常规方法制备成保健品片剂，胶丸，或胶囊。
所述药物或保健品可以用于延缓衰老和预防老年退行性疾病的发生，也可用于改善神经肌肉病理症状，以及用于心血管疾病的治疗。
“呼吸链”传递电子是制造ATP的过程，受损伤的“呼吸链”则因传递电子不通畅而导致漏电增多，其结果是O2 -.和H2O2这些有害活泼氧副产物的增加和ATP合成效率的下降，这正是本发明提出保养线粒体功能的出发点。本发明设计的辅酶Q10、硒和自由基清除剂的组合物是在全面分析呼吸链电子漏特性和线粒体自由基代谢原理的基础上提出的一种维护保养线粒体功能的综合措施。
辅酶Q10是“呼吸链”的一种成份，它在“呼吸链”的中段行使转移电子的功能，辅酶Q10从两个脱氢酶(FMN)和(FPS)接受电子转移给细胞色素链，电子再经细胞色素链的(Cytbc1)(Cytc)(Cytaa3)顺序传递最终把O2还原成H2O完成生物氧化过程。资料表明衰老和心肌缺血患者都有辅酶Q10含量偏低的表现，缺少辅酶Q10导致“呼吸链”传递电子的效率下降，类似汽车油门堵塞变小的效果。添加辅酶Q10可以增强“呼吸链”传递电子的活性，是改善细胞能量供给功能的一种措施。然而呼吸链电子漏旁路的发现揭示出辅酶Q10也是呼吸链漏电产生O2 -.和H2O2的一个部位，这一发现也揭示出O2 -.和H2O2的产生正是辅酶Q10药物副作用的原因。本发明人基于这一分析提出了辅酶Q10与清除O2 -.和H2O2的化合物联合使用的措施，既达到发挥辅酶Q10增强“呼吸链”传递电子的活性的效果，又可以避免单独使用辅酶Q10引起的副作用。
硒的使用涉及到线粒体内基质中的谷胱甘肽过氧化物酶，硒是该酶的必须元素，缺硒使谷胱甘肽过氧化物酶活性降低，其结果会使线粒体基质中的遗传质mDNA受到未被及时清除的O2 -.和H2O2的氧化损伤，这种氧化损伤不仅引起衰老，而且mDNA的缺陷导致一系列的母系遗传疾病，这些病大多是以神经肌肉病变为特征的神经内科疑难症，目前尚无治疗手段。
因此，本发明提出的辅酶Q10、硒和自由基清除剂的组合物能够有效地维护保养线粒体功能，它能提高“呼吸链”传递电子的活性，保护线粒体DNA免受损伤。
线粒体功能的完好是健康长寿的基础，线粒体受损主要引起神经和肌肉病变为特征的病症，这些病症也是衰老和老年退行性疾病的主要特征，保护线粒体免受或少受损伤就是延缓衰老预防老年退行性疾病的分子基础。因此本发明的组合物对老年退行性疾病的预防和治疗均有显著效果，以下以帕金森氏病为例来证明本发明组合物的效果。
帕金森氏病是一种常见的老年退行性疾病，MPP+是一种神精毒剂，MPP+中毒导致神经细胞凋亡是诱发帕金森氏症的病因。通过下面的实验证明，根据本发明实施例1制备的辅酶Q10、硒和维生素E的组合物(M)能有效的降低神经毒剂MPP+对神经细胞SH-SY5Y的毒性，使MPP+-诱导SH-SY5Y细胞调亡率减少，使MPP+-导致的SH-SY5Y细胞生存能力下降的程度降低，这种保护作用是通过维护保养线粒体的功能实现的，表现在组合物(M)有效的保护MPP+-诱导的线粒体膜电位坍塌，和有效的降低MPP+-诱导的细胞内活性氧自由基的生成。
1.实验方法：
SH-SY5Y细胞培养：
在含10％热失活小牛血清和每毫升100单位青链霉素的DMEM(购自GibcoBRL)培养基中接种SH-SY5Y细胞，在摄氏37度，5％CO2和95％空气的细胞培养箱中培养24小时。
MPP+毒性实验：
在培养SH-SY5Y细胞时于上述培养基中加入500μM的MPP+处理引起毒性效应。
组合物M对抗MPP+毒性的实验：
在培养SH-SY5Y细胞时于上述培养基中加入500μM的MPP+结合不同浓度的组合物M处理，观察组合物M降低MPP+毒性的效果，其中组合物M的浓度分别为0、1、10、50、100μg/ml。
实验观察皆用流式细胞仪计数10000次做统计计算。
2.实验结果：
实验1：组合物M降低MPP+-诱导的SH-SY5Y细胞凋亡率(图2)
培养结束后收集细胞经V-FITC细胞凋亡试剂盒(购自Biosea BCL)，和Propidium Iodide(PI)细胞坏死指示剂避光处理15分钟后，用流式细胞仪计数10000次。图2(A)为正常培养的SH-SY5Y细胞；图2(B)为神经毒剂MPP+(500μM)处理24小时致使部分SH-SY5Y细胞凋亡；图2(C)为在MPP+(500μM)处理SH-SY5Y细胞基础上加入不同浓度组合物M保护，可见随M浓度的增加细胞凋亡率下降。
实验2：组合物M对MPP+-导致的SH-SY5Y细胞生存能力降低的保护作用(图3)
细胞生存能力(cell viability)是用细胞对染料(trypan blue)的排斥能力测定的，收集培养的细胞经缓冲盐水清洗后用0.4％的染料溶液染色，在显微镜下计数。空白柱表示对照组，即没有用MPP+处理的正常SH-SY5Y细胞为100％，斜线填充柱表示用500μM MPP+和不同剂量组合物M处理的SH-SY5Y细胞。从图3中看出MPP+处理24小时致SH-SY5Y细胞生存能力下降为对照的65％(左1组)，组合物M的加入(左2-5组)对抗了MPP+的毒性使细胞生存能力随M浓度增加而从70％增至90％。
实验3：组合物M降低MPP+-导致的线粒体膜电位坍塌(图4)
线粒体跨膜电位是用rhodamine123标记的。SH-SY5Y细胞在不同MPP+浓度下培养6小时，收集细胞经消化和清洗后悬于500μL(1×106细胞/毫升)转移至5毫升培养管中，加rhodamine123至1μM于37℃保温半小时后用流式细胞仪计数10000次计算作图。图4(A)中的峰左移程度表示线粒体膜电位坍塌程度增高；图4(B)中可见随组合物M浓度的增高线粒体膜电位坍塌程度下降。
实验4：组合物M降低MPP+-诱导的细胞内活性氧自由基的积累(图5)
细胞内活性氧自由基是用荧光剂DCFH-DA检测的，活性氧自由基把DCFH-DA氧化成荧光强度较高的DCF，通过检测DCF荧光强度(激发光485nm，发射光538nm)可以判断活性氧自由基的浓度。由图5可见，MPP+处理SH-SY5Y细胞24小时后，用DCF荧光检测活性氧自由基浓度，随MPP+浓度增加活性氧自由基增高(左侧MPP+从100增至500μM)，组合物M的存在使活性氧自由基生成的程度随组合物M浓度增高而减少(右侧500μM MPP+处理下组合物M从1增至100μg/ml时自由基生成量逐渐减少)。
附图说明
图1：呼吸链电子漏旁路和线粒体自由基代谢概念的示意图。
图中间的椭圆形代表呼吸链的组成成份，(CoQ)代表辅酶Q10，(FMN)和(FPS)代表复合物I和II两个脱氢酶，(Cytbc1)(Cytc)(Cytaa3)代表细胞色素链，粗箭头表示呼吸链传递电子的方向。下面的椭圆形(F0F1ATPase)代表“ATP酶”，它与呼吸链电子传递偶联制造ATP。上半部分是本发明人发现的呼吸链电子漏旁路，它们是产生O2 -.和H2O2的自由基代谢过程。全图下半部分代表线粒体作为“分子发动机”通过呼吸链电子传递做“有用功”的过程，全图上半部分代表“分子发动机”通过呼吸链漏电子做“无用功”的过程。
图2：组合物M降低MPP+-诱导的SH-SY5Y细胞凋亡率。
图中(A)是正常培养的SH-SY5Y细胞；(B)是500μM MPP+-诱导的SH-SY5Y细胞凋亡；(C)是不同浓度的组合物M对MPP+-诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用。
图3：组合物M对MPP+-导致的SH-SY5Y细胞生存能力降低的保护作用。
图中空白柱表示正常培养SH-SY5Y细胞的生存能力设定为100％，填充斜线柱表示MPP+-单独或与不同浓度组合物M共同处理SH-SY5Y细胞的生存能力，可见随组合物M浓度增高使MPP+-处理后SH-SY5Y细胞生存能力的丢失逐渐减少。
图4：组合物M降低MPP+-导致的线粒体膜电位坍塌。
图中(A)是不同浓度MPP+-处理后SH-SY5Y细胞线粒体膜电位坍塌情况；(B)是不同浓度的组合物M对500μM MPP+-导致SH-SY5Y细胞线粒体膜电位坍塌的保护作用。
图5：组合物M降低MPP+-诱导的细胞内活性氧自由基的积累。
左侧表示不同浓度的MPP+-诱导细胞内活性氧自由基的增加，右侧表示不同浓度组合物M降低500μM MPP+-诱导SH-SY5Y细胞内活性氧自由基积累的保护性作用。
具体实施方式
实施例1
配方：辅酶Q101g、纳米硒1mg、维生素E 1g。
将上述原料在常温常压下混合后，按照常规方法制成2000粒片剂，胶丸或胶囊。
实施例2
配方：辅酶Q100.5g、提供1mg硒元素的亚硒酸钠、维生素C 0.5g。
将上述原料在常温常压下混合后，按照常规方法制成片剂2000粒片剂，胶丸或胶囊。
实施例3
配方：辅酶Q102g、提供1mg硒元素的依布硒啉、β-胡萝卜素0.25g、硫辛酸0.75g。
将上述原料在常温常压下混合后，按照常规方法制成2000粒片剂，胶丸或胶囊。
实施例4
配方：辅酶Q101g、纳米硒1mg、β-胡萝卜素0.25g、硫辛酸0.25g、维生素E 0.5g。
将上述原料在常温常压下混合后，结合制药可接受的辅料，按照常规方法制成2000粒片剂，胶丸或胶囊。
实施例5
配方：辅酶Q102g、纳米硒1mg、β-胡萝卜素1.25g、丹参素0.25g、维生素C 1.25g。
将上述原料在常温常压下混合后，结合制药可接受的辅料，按照常规方法制成2000粒粒片剂，胶丸或胶囊。
Claims (9)
1.一种维护线粒体功能的组合物，其特征在于：由辅酶Q10、硒元素和自由基清除剂组成；所述组分的重量比为：辅酶Q10∶硒元素∶自由基清除剂＝0.5～2∶0.001∶1～3；所述自由基清除剂是各种用于减少自由基损伤的化合物、中药提取物或它们的组合。
2.权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述自由基清除剂选自维生素E、维生素C、硫辛酸、β-胡萝卜素或丹参素中的一种或两种以上的混合物。
3.权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述硒元素来自纳米硒、亚硒酸钠或依布硒啉。
4.权利要求1所述的组合物，其特征在于：它由以下重量份的组分组成：辅酶Q10 1、纳米硒0.001和维生素E1。
5.权利要求1所述的组合物，其特征在于：它由以下重量份的组分组成：辅酶Q10 1、纳米硒0.001、硫辛酸0.25、维生素E1、维生素C1。
6.权利要求1所述的组合物，其特征在于，它由以下重量份的组分组成：辅酶Q10 1、纳米硒0.001、β-胡萝卜素0.25、丹参素0.25、
7.权利要求1所述的组合物在制备维护保养线粒体功能的药物或保健品中的应用。
8.权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的药物或保健品为延缓衰老、预防老年退行性疾病或心脑血管疾病的药物或保健品。
9.权利要求7所述的应用，其特征在于：以所述组合物为药效成分或活性成分，结合制药生产上可接受的常规辅料，按照常规方法制备成片剂、胶丸或胶囊。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009100850185A CN101579355B (zh) | 2009-05-27 | 2009-05-27 | 一种维护线粒体功能的营养组合物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009100850185A CN101579355B (zh) | 2009-05-27 | 2009-05-27 | 一种维护线粒体功能的营养组合物及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101579355A true CN101579355A (zh) | 2009-11-18 |
| CN101579355B CN101579355B (zh) | 2010-12-08 |
Family
ID=41361760
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2009100850185A Active CN101579355B (zh) | 2009-05-27 | 2009-05-27 | 一种维护线粒体功能的营养组合物及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101579355B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105377271A (zh) * | 2013-03-15 | 2016-03-02 | 全技术公司 | 含硒组合物及其治疗和预防与线粒体功能障碍有关的疾病或病症的应用 |
| CN109527556A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-03-29 | 厦门金达威生物科技有限公司 | 一种辅酶q10加硒软胶囊和内容物及其制备方法 |
| CN111250072A (zh) * | 2020-01-16 | 2020-06-09 | 中国地质大学（北京） | 一种天然凹凸棒石作为天然纳米矿物酶的应用 |
| CN113615833A (zh) * | 2021-07-01 | 2021-11-09 | 泓博元生命科技（深圳）有限公司 | 一种用于改善心血管的线粒体营养素组合物及应用 |
-
2009
- 2009-05-27 CN CN2009100850185A patent/CN101579355B/zh active Active
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105377271A (zh) * | 2013-03-15 | 2016-03-02 | 全技术公司 | 含硒组合物及其治疗和预防与线粒体功能障碍有关的疾病或病症的应用 |
| CN109527556A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-03-29 | 厦门金达威生物科技有限公司 | 一种辅酶q10加硒软胶囊和内容物及其制备方法 |
| CN109527556B (zh) * | 2018-12-29 | 2022-04-22 | 厦门金达威生物科技有限公司 | 一种辅酶q10加硒软胶囊和内容物及其制备方法 |
| CN111250072A (zh) * | 2020-01-16 | 2020-06-09 | 中国地质大学（北京） | 一种天然凹凸棒石作为天然纳米矿物酶的应用 |
| CN111250072B (zh) * | 2020-01-16 | 2021-02-26 | 中国地质大学（北京） | 一种天然凹凸棒石作为天然纳米矿物酶的应用 |
| WO2021143849A1 (zh) * | 2020-01-16 | 2021-07-22 | 中国地质大学（北京） | 一种天然凹凸棒石作为天然纳米矿物酶的应用 |
| CN113615833A (zh) * | 2021-07-01 | 2021-11-09 | 泓博元生命科技（深圳）有限公司 | 一种用于改善心血管的线粒体营养素组合物及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101579355B (zh) | 2010-12-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gandía-Herrero et al. | Biological activities of plant pigments betalains | |
| Prakash et al. | Role of coenzyme Q10 as an antioxidant and bioenergizer in periodontal diseases | |
| Lei et al. | Effects of nanoanatase TiO 2 on photosynthesis of spinach chloroplasts under different light illumination | |
| Ness et al. | Vitamin C status and blood pressure | |
| CN101579355B (zh) | 一种维护线粒体功能的营养组合物及其应用 | |
| KR101902911B1 (ko) | 산수국 추출물을 함유하는 자외선에 의한 인간 피부세포 손상 개선용 조성물 | |
| CN106265846A (zh) | 一种提高红景天抗氧化能力的发酵方法 | |
| CN105188722A (zh) | 抗氧化活性的组合物和其应用 | |
| CN104140948A (zh) | 卵子与胚胎处理液及其制备方法 | |
| CN104983915A (zh) | 一种黑果枸杞天然复合抗氧化剂的制备方法 | |
| Loo et al. | Evaluation of ellagic acid on the activities of oral bacteria with the use of adenosine triphosphate (ATP) bioluminescence assay | |
| CN101307338A (zh) | 还原型辅酶q10的制备方法 | |
| CN101579115A (zh) | 一种纳米硒茶诺丽保健食品及其生产方法 | |
| EP1968620B1 (en) | Compositions comprising powdered garlic (Allium sativum linn.) and a concentrate of organic selenium compounds for nutritional supplementation | |
| CN101773488A (zh) | 一种基于迷迭香酸的药物及其在治疗帕金森病中的应用 | |
| CN102178292A (zh) | 对化学肝损伤有保护作用的籽瓜汁系列制品 | |
| KR20120089882A (ko) | 모노아민산화효소 저해활성을 갖는 참나무겨우살이 추출물을 함유한 조성물 | |
| CN106562934A (zh) | 猪流行性腹泻病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法 | |
| US7014874B1 (en) | Compositions and methods containing Allium sativum Linn. (garlic) naturally enriched with organic selenium compounds for nutritional supplementation | |
| Shim et al. | Safety evaluation of Elsholtzia splendens extracts: assessment of acute toxicity and mutagenicity | |
| Bola et al. | Antimicrobial Capacity, Antioxidant and Free Radical Scavenging Activity of Extract from the Leaf of Erigeron floribundus | |
| Mciteka | A Synthesis Review of Vitamins Involved in the Fight against Covid‐19 | |
| CN112481201A (zh) | 促进干细胞增生的方法 | |
| CN107308038A (zh) | 一种具有改善肤质功效的面膜 | |
| Hentschke | Cyanobacteria for Cardiomyocyte Protection against miocardial ischemia injury: a systematic review of animal and in vitro studies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20170714 Address after: 102206, room 9, building 8, block 1, 201 Garden Road, Changping District science and Technology Park, Beijing, China Patentee after: BEIJING ZHONGKE WEIXIN BIOMEDICAL RESEARCH INSTITUTE CO., LTD. Address before: 100101 Beijing city Chaoyang District Datun Road No. 15 Patentee before: Xu Jianxing |
|
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Xu Jianxing Inventor after: Wang Tianze Inventor after: Hao Shujing Inventor before: Xu Jianxing |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20171115 Address after: 102206, room 9, building 8, block 1, 201 Garden Road, Changping District science and Technology Park, Beijing, China Co-patentee after: Beijing Weixin precision Medical Research Center Co., Ltd. Patentee after: BEIJING ZHONGKE WEIXIN BIOMEDICAL RESEARCH INSTITUTE CO., LTD. Address before: 102206, room 9, building 8, block 1, 201 Garden Road, Changping District science and Technology Park, Beijing, China Patentee before: BEIJING ZHONGKE WEIXIN BIOMEDICAL RESEARCH INSTITUTE CO., LTD. |