CN105985379A - 一种线粒体靶向超氧阴离子探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种线粒体靶向超氧阴离子探针及其制备方法。该线粒体靶向超氧阴离子探针的结构式可为式Ⅰ或式Ⅰ′所示化合物，也可以为式Ⅱ或式Ⅱ′所示化合物。本发明设计和合成了一系列线粒体靶向超氧阴离子探针，本发明探针能够定向靶向性的到达细胞的线粒体，对细胞线粒体具有高度的选择性；本发明探针能实时和高选择性地检测出线粒体内超氧阴离子的产生，对线粒体中其他活性氧则没有反应，对超氧阴离子的检测具有专一性。
Description
技术领域
本发明涉及一种线粒体靶向超氧阴离子探针及其制备方法，属于分子检测和分子成像领域。
背景技术
线粒体是一种广泛存在于大多数真核细胞中的由两层膜包被的细胞器，直径在0.5到10微米左右。线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要场所，为细胞的活动提供了能量，所以有“细胞动力工厂”之称。除了为细胞供能外，线粒体还参与诸如调节膜电位并控制细胞程序性死亡；细胞分化、细胞增殖与细胞代谢的调控；合成胆固醇及某些血红素；负责细胞信息传递并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。
自由基是一些能够独立存在的，具有一个或多个未成对电子的原子或分子。当两个电子自旋方向相反，成对在同一个轨道上，那么它们就更加稳定。生物体内自由基是来自机体正常生理代谢过程和生存环境诱导产生的不稳定中间产物，它是细胞信号转导的重要信使分子，与生物体内各种生理作用及病理现象密切相关。大量研究表明，动物细胞内的自由基有99％来自线粒体的电子传递链上。体内重要的一类自由基是活性氧自由基，也称为活性氧，一般包括O-2·、·OH、ROO·、RO·等。
活性氧，顾名思义，就是比起普通的氧分子，它们有着更高的氧化还原活性。活性氧不仅包括一些自由基，如羟自由基(·OH)，超氧阴离子(O-2·)，过氧羟自由(·HO2)，过氧自由基(ROO·)和烷氧基自由基(RO·)，也包括了一些非自由基，即过氧化氢(H2O2)，单线态氧(1O2)和次氯酸(HOCl)。活性氧是指在生物体内与氧代谢有关的含氧自由基和易形成自由基的过氧化物的总称，机体内氧化代谢可不断形成活性氧，在一定的空间、时间和一定的限度内活性氧有积极的生理作用。
自由基分为氧化性和还原性自由基，在体内处于平衡状态，调控体内的氧化-还原平衡，一旦一方过量失去平衡就会对细胞造成损伤，带来一系列疾病。自由基可攻击生命大分子物质及细胞壁，造成机体的多种损伤和病变，加速机体的衰老；自由基摧毁细胞膜，导致细胞膜发生变性，使得细胞不能从外部吸收营养，也排泄不出细胞体内的代谢废物，并丧失了对细菌和病毒的抵御能力。从而使人体免疫力低下、疲劳和器官病变。如果导致细胞死亡或细胞内杂质无法代谢就会形成色素沉积，产生黄褐斑、蝴蝶斑、老年斑等；自由基攻击正在复制中的基因，造成基因突变，诱发癌症发生；自由基氧化血液中的脂蛋白造成胆固醇向血管壁的沉积，引起心脏病、中风、动脉硬化、脑血栓、脑溢血、偏瘫或高血压等心脑血管病症。侵蚀脑细胞使人易患老年性痴呆；自由基作用于人体内分泌系统，导致胶原蛋白酶和硬弹性蛋白酶的释放，这些酶作用于皮肤中的胶原蛋白酶和硬弹性蛋白并使这两种蛋白产生过度交联并降解，结果使皮肤失去弹性，出现皱纹及囊泡，使体内毛细血管脆性增加，使血管容易破裂，这可导致静脉曲张，水肿等与血管通透性升高有关的疾病的发生；自由基引起关节膜及关节滑液的降解，从而导致关节炎；侵蚀胰脏细胞引起糖尿病；损伤肝脏器官导致肝炎。
人体内自发产生的适量的活性氧是相当重要的，它们涵盖了不同的生命活动，诸如在信号转换，神经传递，肌肉舒展放松及蠕动，血小板凝集，血压调节，免疫系统控制，学习和记忆，能量产生，细胞常规生长，重要的生命化合物的合成和机体的新陈代谢中，都发挥了重要的作用。然而，当活性氧产生过量或机体自身的抗氧化剂的量大量减少时，活性氧就变得相当有害了。它们通过氧化生物分子，使得细胞脂质膜、蛋白质组织、酶、碳水化合物或DNA等氧化损伤，造成细胞损坏或死亡。总之，在一般细胞环境中，活性氧对于生命体是必不可少的，但过量的活性氧就会造成危害。
自由基的种类很多，用来说明衰老发生机制的自由基，主要是超氧自由基、羟自由基和类脂质过氧化自由基。在线粒体内膜，分子氧(O2)首先接受一个电子被还原成超氧自由基(O2-)，生成的超氧再进一步转变成HO·、ONOO－、ROO·和RO·等活性更高的氧自由基(ROS)。超氧自由基作用的产物，都是强氧化剂，可使类脂质中的不饱和脂肪酸氧化为类脂过氧化物。它们都是引发脂质过氧化自由基反应的氧化剂，在正常情况下，由于生物体内存在自由基清除剂，如性激素、SOD、过氧化氢酶等使生物体内自由基的产生与清除保持相对平衡，并参与许多正常的生理生化反应。若自由基清除剂的合成恶性化或自由基反应发生紊乱，则会导致机体一系列的病理改变。超氧自由基能引发体内脂质过氧化，加快肌体的衰老过程，并可诱发癌症、心血管疾病等，严重危害人体健康，人体通过超氧化物歧化酶(SOD)将其转化成过氧化氢和氧气除去。由此可见，超氧自由基是诱导自由基反应链启动的首要自由基，它与众多疾病的发生发展密切相关。而线粒体是超氧阴离子产生的主要场所，能够定向靶向性地在超氧阴离子产生地线粒体中实现对超氧的检测对研究自由基以及超氧引起的相关疾病的预防、诊断和治疗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种线粒体靶向超氧阴离子探针及其制备方法，本发明线粒体靶向超氧阴离子探针能够实现定向靶向性检测线粒体内超氧阴离子检测。
本发明提供的化合物，其结构式为式Ⅰ或式Ⅰ′，
式Ⅰ和式Ⅰ′中：X-M+-L-D和X-M+均为线粒体靶向分子基团；
M+为R3P+、R3N+，R为碳原子数为2～6的链状烷基或苯基；
X-为Cl-、Br-或I-；
L为碳原子数2～10的链状烷基、-(OCH2CH2)n-或2～10个氨基酸基团组成的直链，其中n为2～5的整数，所述氨基酸基团为2～10个氨基酸脱水缩合；
D为-CONH-、-CH2-NH-或-CO-O-；或D与L中的端位基团共同形成下述基团中的任意一中：-CONH-、-CH2-NH-和-CO-O-。
本发明中氨基酸指的是广义上的氨基酸，即含有氨基和羧基的化合物。
本发明上述式Ⅰ所示化合物中，M+为R3P+，R为苯基；X-为Br-；L为碳原子数为4的链状烷基；D为-CO-O-；即式Ⅰ所示化合物的结构式具体可如下：
本发明进一步提供了上述式Ⅰ或式Ⅰ′所示化合物的制备方法，该制备方法以荧光素为原料，利用带正电基团可靶向跨过线粒体膜导入线粒体的特点，将带正电荷的官能团结合到荧光素上，得到上述式Ⅰ或式Ⅰ′线粒体靶向超氧阴离子探针；
式Ⅰ的制备方法包括如下步骤：
(1)在有机溶剂Ⅰ中，荧光素与二苯基次磷酰氯进行反应Ⅰ，得到中间产物Ⅰ；
所述有机溶剂Ⅰ为DMSO、DMF、THF、甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
(2)在有机溶剂Ⅱ中，所述中间产物Ⅰ与X-L-D-Y进行反应Ⅱ，得到中间产物Ⅱ；
X-L-D-Y和中间产物Ⅱ中，X为-Cl、-Br、-I或-H；L为碳原子数2～10的链状烷基、-(OCH2CH2)n-或2～10个氨基酸基团组成的直链，其中n为2～5的整数，所述氨基酸基团为2～10个氨基酸脱水缩合；D为-CONH-、-CH2-NH-或-CO-O-；或D与L中的端位基团共同形成下述基团中的任意一中：-CONH-、-CH2-NH-和-CO-O-；Y为-OH、-Cl、-Br或-I；
所述有机溶剂Ⅱ为DMSO、DMF、THF、甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
(3)在有机溶剂Ⅲ中，所述中间产物Ⅱ与M进行反应Ⅲ，得到式Ⅰ所示化合物；
所述M中，M为R3P、R3N，R为碳原子数为2-6的链状烷基或苯基；
所述有机溶剂Ⅲ为DMSO、DMF、THF、甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
式Ⅰ′的制备方法包括如下步骤：
(1)在有机溶剂Ⅰ中，荧光素与二苯基次磷酰氯进行反应Ⅰ，得到中间产物Ⅰ；
所述有机溶剂Ⅰ为DMSO、DMF、THF、甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
(2)在有机溶剂Ⅲ中，所述中间产物Ⅰ与MX进行反应Ⅲ′，得到式Ⅰ′所示化合物；
所述MX中，M为R3P、R3N，R为碳原子数2-6的链状烷基或苯基；X为-Cl、-Br或-I；
所述有机溶剂Ⅲ为DMSO、DMF、THF、甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
上述的制备方法，式Ⅰ的制备方法步骤(1)中，所述荧光素与所述二苯基次磷酰氯的摩尔比可为5～1：1，具体可为2：1；所述反应Ⅰ的温度为40～120℃，时间为8～40h；
步骤(2)中，所述中间产物Ⅰ与所述X-L-D-Y的摩尔比可为1：1～5，具体可为1：1；所述反应Ⅱ的温度为0～50℃，时间为8～20h；
步骤(3)中，所述中间产物Ⅱ与所述M的摩尔比可为1：1～5，具体可为1：3；所述反应Ⅲ的温度均为30～120℃，时间均为10～40h；
式Ⅰ′的制备方法步骤(1)中，所述荧光素与所述二苯基次磷酰氯的摩尔比可为5～1：1；所述反应Ⅰ的温度可为40～120℃，时间可为8～40h；
步骤(2)中，所述中间产物Ⅰ与MX的摩尔比可为1：1～5；所述反应Ⅲ′的温度可为30～120℃，时间均可为10～40h。
上述的制备方法，所述反应Ⅰ、所述反应Ⅱ、所述反应Ⅲ和所述反应Ⅲ′结束后均包括冷却至0～20℃的步骤。
本发明提供的化合物，其结构式为式Ⅱ或式Ⅱ′，
式Ⅱ和式Ⅱ′中，X-M+-L-D、X-M+、X-M′+-L′-D′和X-M′+均为线粒体靶向分子基团；
M+和M′+均为R3P+、R3N+，R为碳原子数2-6的链状烷基或苯基；
X-为Cl-、Br-、I-；
L和L′均为碳原子数为2～10的链状烷基、-(OCH2CH2)n-或2～10个氨基酸基团组成的直链，其中n为2～5的整数，所述氨基酸基团为2～10个氨基酸脱水缩合；
D和D′均为-CONH-、-CH2-NH-或-CO-O-；或D与L中的端位基团共同形成下述基团中的任意一中：-CONH-、-CH2-NH-和-CO-O-，或D′与L′中的端位基团共同形成下述基团中的任意一中：-CONH-、-CH2-NH-和-CO-O-。
本发明上述式Ⅱ所示化合物，M+为R3P+，R为甲基；X-为Br-；L为-CH2CH2CONHCH2CH2CONHCH(CH(CH3)2)-；D为-CO-O-；M′+为R3P+，R为苯基；X′-为Br-；L′为碳原子数3的链状烷基；D′为-CONH-；即式Ⅰ所示化合物的结构式具体可如下：
本发明还提供了上述化合物式Ⅱ或式Ⅱ′的制备方法，式Ⅱ的制备方法包括如下步骤：
(1)在有机溶剂Ⅳ中，在缩合剂的作用下4-硝基荧光素与X-L-D-Y进行反应Ⅳ，得到中间产物Ⅲ，
X-L-D-Y和中间产物Ⅲ中，X为-Cl、-Br或-I；L为碳原子数2～10的链状烷基、-(OCH2CH2)n-或2～10个氨基酸基团组成的直链，其中n为2～5的整数，所述氨基酸基团为2～10个氨基酸脱水缩合；D为-CONH-、-CH2-NH-或-CO-O-；或D与L中的端位基团共同形成下述基团中的任意一中：-CONH-、-CH2-NH-和-CO-O-；Y为-OH、-Cl、-Br或-I；
所述有机溶剂Ⅳ为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
所述缩合剂为二环己基碳二亚胺(EDC)、可溶于水的碳二亚胺(DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)或O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)；
(2)在有机溶剂Ⅴ中，所述中间产物Ⅲ与二苯基次磷酰氯进行反应Ⅴ，得到中间产物Ⅳ，
中间产物Ⅳ中，X为-Cl、-Br或-I；L为碳原子数为2～10的链状烷基、-(OCH2CH2)n-或2～10个氨基酸基团组成的直链，其中n为2～5的整数，所述氨基酸基团为2～10个氨基酸脱水缩合；D为-CONH-、-CH2-NH-或-CO-O-；或D与L中的端位基团共同形成下述基团中的任意一中：-CONH-、-CH2-NH-和-CO-O-；
所述有机溶剂Ⅴ为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
(3)在有机溶剂Ⅵ中，所述中间产物Ⅳ与R-X′进行反应Ⅵ，得到中间产物Ⅴ，
R-X′和中间产物Ⅴ中，M+为R3P+、R3N+，R为碳原子数为2～6的链状烷基或苯基；X-为Cl-、Br-或I-；X′为-Cl、-Br或-I；L为碳原子数为2～10的链状烷基、-(OCH2CH2)n-或2～10个氨基酸基团组成的直链，其中n为2～5的整数，所述氨基酸基团为2～10个氨基酸脱水缩合；D为-CONH-、-CH2-NH-或-CO-O-；或D与L中的端位基团共同形成下述基团中的任意一中：-CONH-、-CH2-NH-和-CO-O-；
所述有机溶剂Ⅵ为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
(4)在有机溶剂Ⅶ中，所述中间产物Ⅴ进行反应Ⅶ，还原剂将硝基还原为氨基，得到中间产物Ⅵ，
中间产物Ⅵ中，M+为R3P+、R3N+，R为碳原子数为2～6的链状烷基或苯基；X-为Cl-、Br-或I-；L为碳原子数为2～10的链状烷基、-(OCH2CH2)n-或2～10个氨基酸基团组成的直链，其中n为2～5的整数，所述氨基酸基团为2～10个氨基酸脱水缩合；D为-CONH-、-CH2-NH-或-CO-O-；或D与L中的端位基团共同形成下述基团中的任意一中：-CONH-、-CH2-NH-和-CO-O-；
所述有机溶剂Ⅶ为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
所述还原剂为LiAlH4；
(5)在有机溶剂Ⅷ中，所述中间产物Ⅵ与M′-L′-D′-Y进行反应Ⅷ，得到式Ⅱ，
M′-L′-D′-Y中，M′为-PR3、-NR3，R为碳原子数为2～6的链状烷基或苯基；L′为碳原子数为2～10的链状烷基、-(OCH2CH2)n-或2～10个氨基酸基团组成的直链，其中n为2～5的整数，所述氨基酸基团为2～10个氨基酸脱水缩合；D′为-CONH-、-CH2-NH-或-CO-O-；或D′与L′中的端位基团共同形成下述基团中的任意一中：-CONH-、-CH2-NH-和-CO-O-；Y为-OH、-Cl、-Br或-I；
所述有机溶剂Ⅷ为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种。
式Ⅱ′的制备方法包括如下步骤：
(1)在有机溶剂Ⅴ中，所述4-硝基荧光素与二苯基次磷酰氯进行反应Ⅴ′，得到中间产物Ⅳ′，
所述有机溶剂Ⅴ′为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
(2)在有机溶剂Ⅵ中，所述中间产物Ⅳ与M-X′进行反应Ⅵ′，得到中间产物Ⅴ′，
M-X′和中间产物Ⅴ′中，M+为R3P、R3N+，R为碳原子数为2-6的链状烷基或苯基3；M为R3P、R3N+，R为碳原子数为2-6的链状烷基或苯基3；X-为Cl-、Br-或I-；X′为-Cl、-Br或-I；
所述有机溶剂Ⅵ为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
(3)在有机溶剂Ⅶ中，所述中间产物Ⅴ进行反应Ⅶ′，还原剂将硝基还原为氨基，得到中间产物Ⅵ′，
中间产物Ⅵ′中，M+为R3P+、R3N+，R为碳原子数为2-6的链状烷基或苯基；X-为Cl-、Br-或I-；
所述有机溶剂Ⅶ为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
所述还原剂为LiAlH4；
(4)在有机溶剂Ⅷ中，所述中间产物Ⅵ′与M′X′进行反应Ⅷ′，得到式Ⅱ′，
M′X′中，M′为R3P、R3N，R为碳原子数为2-6的链状烷基或苯基，X′为-Cl、-Br或-I；X-为Cl-、Br-或I-；
所述有机溶剂Ⅷ为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种。
上述的制备方法，式Ⅱ的制备方法步骤(1)中，所述4-硝基荧光素、所述X-L-D-Y与所述缩合剂的摩尔比为1～3：1：1～6，具体可为3：1：3.6；所述反应Ⅳ的温度为0～40℃，时间为5～40h，具体可为10h；
步骤(2)中，所述中间产物Ⅲ与所述二苯基次磷酰氯的摩尔比为1～3：1，具体可为1：1.5；所述反应Ⅴ的温度为40～120℃，具体可40～100℃，时间为8～40h，具体可为20h；
步骤(3)中，所述中间产物Ⅳ与所述R-X′的摩尔比为1：3～10，具体可为1：5；所述反应Ⅵ的温度为40～120℃，时间为8～40h，具体可为15h；
步骤(4)中，所述中间产物Ⅴ与所述还原剂的摩尔比为1：1～3，具体可为1：2；所述反应Ⅶ的温度为-40～0℃，具体可为-20℃，时间为8～40h，具体可为15h；
步骤(5)中，所述中间产物Ⅵ与所述M′-L′-D′-Y的摩尔比为1：1～5，具体可为1：1.5；所述反应Ⅷ的温度为10～50℃，时间为15～40h；
式Ⅱ′的制备方法步骤(1)中，所述4-硝基荧光素与所述二苯基次磷酰氯的摩尔比为1～3：1；所述反应Ⅴ′的温度为40～120℃，时间为8～40h；
步骤(2)中，所述中间产物Ⅳ′与所述M-X′的摩尔比为1：3～10；所述反应Ⅵ′的温度为80～120℃，时间为20～40h；
步骤(3)中，所述中间产物Ⅴ′与所述还原剂的摩尔比为1：1～3；所述反应Ⅶ′的温度为-40～0℃，时间为8～40h；
步骤(4)中，所述中间产物Ⅵ′与所述M′X′的摩尔比为1：1～5；所述反应Ⅷ′的温度为10～40℃，时间为15～40h。
上述的制备方法，所述反应Ⅳ结束后还包括冷却至0～10℃的步骤；
所述反应Ⅵ、所述反应Ⅵ′、所述反应Ⅶ和所述反应Ⅶ′结束后均包括冷却至0～20℃的步骤；
所述反应Ⅴ、所述反应Ⅴ′、所述反应Ⅷ和所述反应Ⅷ′结束后均包括冷却至0～30℃的步骤。
本发明还提供了上述式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物在制备线粒体靶向超氧自由基探针中的应用。
本发明还提供了上述式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物在线粒体靶向超氧自由基检测和线粒体靶向成像中的应用。
本发明具有如下优点：
(1)本发明设计和合成了一系列线粒体靶向超氧阴离子探针。
(2)本发明探针能够定向靶向性的到达细胞的线粒体，对细胞线粒体具有高度的选择性。
(3)本发明探针能实时和高选择性地检测出线粒体内超氧阴离子的产生，对线粒体中其他活性氧则没有反应，对超氧阴离子的检测具有专一性。
(4)本发明制备方法简单可靠，能得到一系列线粒体靶向超氧阴离子探针的化合物。
附图说明
图1为本发明实施例1中制备线粒体靶向超氧自由基探针的合成路线图。
图2为本发明实施例1制备的线粒体靶向超氧自由基探针的核磁氢谱图。
图3为本发明实施例1制备的线粒体靶向超氧自由基探针的核磁碳谱图。
图4为本发明实施例1制备的线粒体靶向超氧自由基探针的高分辨质谱图。
图5为本发明实施例1制备的线粒体靶向超氧自由基探针与超氧化钾的检测试验中，荧光探针的荧光强度随超氧化钾浓度的变化图。
图6为本发明实施例1制备的线粒体靶向超氧自由基探针的活性氧选择性实验中，探针与不同活性氧作用的柱状图。
图7为本发明实施例1制备的线粒体靶向超氧自由基探针对H9C2的细胞毒性中，不同浓度探针对H9C2的细胞毒性的柱形图。
图8为本发明实施例1制备的线粒体靶向超氧自由基探针在细胞内超氧检测和线粒体靶向定位试验成像照片，其中图a为无刺激的线粒体探针Hochest成像的照片，图b为无刺激的本发明线粒体探针Mito-Superoxide-tracker 1成像的照片，图c为无刺激的线粒体探针MitoTracker-Red成像的照片，图d为无刺激的Mito-Superoxide-tracker1和没有刺激的MitoTracker-Red叠加后的照片，图e为加百草枯刺激的线粒体探针Hochest成像的照片，图f为加百草枯刺激的加百草枯刺激的线粒体探针Mito-Superoxide-tracker 1成像的照片，图g为加百草枯刺激的线粒体探针MitoTracker-Red成像的照片，图h为加百草枯刺激的线粒体探针Mito-Superoxide-tracker 1和MitoTracker-Red叠加后的照片。
图9为本发明实施例1制备的线粒体靶向超氧自由基探针在细胞内多柔比星刺激产生超氧检测试验，其中图a为无刺激的线粒体探针Hochest成像的照片，图b为无刺激的线粒体探针Mito-Superoxide-tracker 1成像的照片，图c为无刺激的线粒体探针Mito-SOX成像的照片，图d为无刺激的Mito-Superoxide-tracker 1和Mito-SOX叠加成像的照片，图e为多柔比星刺激的线粒体探针Hochest成像的照片，图f为线粒体探针Mito-Superoxide-tracker 1受多柔比星刺激成像的照片，图g为线粒体探针Mito-SOX受多柔比星刺激成像的照片，图h为受多柔比星刺激的Mito-Superoxide-tracker 1和Mito-SOX加后的照片。
图10为本发明实施例2中制备线粒体靶向超氧自由基探针的合成路线图。
图11为本发明实施例2制备的线粒体靶向超氧自由基探针与超氧化钾的检测试验中，荧光探针的荧光强度随超氧化钾浓度的变化图。
图12为本发明实施例2制备的线粒体靶向超氧自由基探针对H9C2的细胞毒性中，不同浓度探针对H9C2的细胞毒性的柱形图。
图13为本发明实施例2制备的线粒体靶向超氧自由基探针在细胞内超氧检测和线粒体靶向定位试验成像照片，其中图a为没有刺激的线粒体探针Hochest成像的照片，图b为没有刺激的本发明线粒体探针Mito-Superoxide-tracker 2成像的照片，图c为没有刺激的线粒体探针Mito-SOX成像的照片，图d为没有刺激的Mito-Superoxide-tracker2和Mito-SOX叠加后的照片，图e为加DOX刺激的线粒体探针Hochest成像的照片，图f为加DOX刺激的线粒体探针Mito-Superoxide-tracker 2成像的照片，图g为加DOX刺激的线粒体探针Mito-SOX成像的照片，图h为加DOX刺激后的Mito-Superoxide-tracker 2和Mito-SOX叠加后的照片。
图14为本发明实施例2制备的线粒体靶向超氧自由基探针在细胞内多柔比星刺激产生超氧检测试验，其中图a为线粒体探针Hochest成像的照片，图b为线粒体探针Mito-Superoxide-tracker 2成像的照片，图c为线粒体探针Mito-SOX成像的照片，图d为线粒体探针没有刺激的Mito-Superoxide-tracker 2和Mito-SOX叠加后成像的照片，图e为线粒体探针Hochest成像的照片，图f为线粒体探针Mito-Superoxide-tracker 2成像的照片，图g为线粒体探针Mito-SOX成像的照片，图h为线粒体探针在多柔比星刺激后Mito-Superoxide-tracker 2和Mito-SOX叠加后的照片。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、线粒体靶向超氧自由基探针Mito-Superoxide-tracker 1的制备和应用
(一)、线粒体靶向超氧自由基探针Mito-Superoxide-tracker 1的制备
按照如图1所示的合成路线制备线粒体靶向超氧自由基探针Mito-Superoxide-tracker 1。
(1)将荧光素溶解在THF中，在20～80℃下慢慢滴加二苯磷酰氯到反应液中，荧光素与二苯磷酰氯的摩尔比为2：1，在30～80℃搅拌反应8h，反应结束冷却到20℃，蒸干有机溶剂，经柱层析和重结晶分离纯化得中间产物Ⅰ。
结构确证结果如下：1H-NMR(400MHz,DMSO，TMS):δ8.00-7.98(d,J＝7.2Hz，1H),7.95-7.90(m,4H),7.78-7.75(t,J＝7.2Hz,1H),7.73-7.69(t,J＝7.2Hz,1H)，7.65-7.62(t,J＝7.2Hz，2H),7.60-7.55(m,J＝7.2Hz,4H),7.33-7.31(m,1H),7.27-7.25(d,J＝7.6Hz,1H)，7.06-7.04(d,J＝7.2Hz,1H),6.77-6.75(d,J＝8.8Hz,1H),6.69-6.67(m,1H),6.56-6.54(t,J＝7.6Hz,2H)；13C NMR(400MHz,DMSO,TMS):δ169.0,160.1,152.7,151.9,151.6,136.2,133.5,132.0,131.9,131.5,130.8,130.2,129.6,129.5,126.3,125.3,124.5,116.0,113.6,109.6,102.7,82.4；m/z(HRMS):Calcd.M-1for C32H20O6P 531.10030,found 531.09995。
经结构鉴定所合成的化合物确为中间产物Ⅰ。
(2)将中间产物Ⅰ溶解在THF中，在-10～10℃下慢慢滴加5-溴戊酰氯到反应液中，中间产物Ⅰ与5-溴戊酰氯的投料摩尔比为1：1，在-10～10℃搅拌反应15h，反应结束冷却到20℃，蒸干反应溶剂，经柱层析和重结晶分离纯化得中间产物Ⅱ。
结构确证结果如下：1H NMR(400MHz,MeOH,TMS):δ8.02-8.01(d,J＝7.2Hz,1H),7.94-7.89(m,J＝8.4Hz,4H),7.77-7.69(m,2H),7.65-7.62(m,2H),7.58-7.53(m,4H),7.26-7.25(m,1H),7.19-7.17(d,J＝7.6Hz,1H),7.15-7.14(m,1H),7.01-6.99(dt,J＝8.8Hz,1H),6.88-6.86(dd,J＝8.8Hz,1H),6.82-6.76(dd,J＝8.8Hz,2H),3.51-3.48(t,J＝6.4Hz,2H),2.66-2.62(t,J＝7.61Hz,2H),2.00-1.93(m,2H),1.90-1.82(m,2H)；13C NMR(400MHz,DMSO,TMS):δ171.4,169.4,152.7,152.4,152.2,151.6,151.3,135.4,133.0,131.4,130.1,129.2,128.6,125.9,124.6,123.7,117.9,116.9,116.2,115.7,110.1,108.9,81.6,32.5,32.3,31.6,22.9；m/z(HRMS):Calcd.M+Na,for C37H28BrNaO7P 717.06482,found717.06484。
(3)将中间产物Ⅱ溶解在CH3CN中，在80℃下慢慢加三苯基磷到反应液中，中间产物Ⅱ与三苯基磷的投料摩尔比为1：3，在80℃搅拌反应20h，反应结束冷却到20℃，蒸干反应溶剂，经柱层析和重结晶分离纯化得产物Mito-Superoxide-tracker 1。
如图2(核磁氢谱)、图3(核磁碳谱)中和图4(高分辨质谱)所示，结构确证结果如下：1H NMR(400MHz,MeOH,TMS):δ8.03-8.01(d,J＝7.6Hz,1H),7.94-7.92(m,1H),7.92-7.91(d,J＝4.8Hz,2H),7.89-7.87(d,J＝9.2Hz,2H),7.86-7.85(d,J＝6.0Hz,2H),7.85-7.84(m,1H),7.83-7.81(m,3H),7.79-7.78(m,2H),7.76-7.74(m,7H),7.72-7.70(m,2H),7.66-7.62(m,2H),7.57-7.53(m,4H),7.28-7.27(m,1H),7.19-7.17(d,J＝7.6Hz,1H),7.04-7.03(m,1H),7.01-6.99(dd,J＝8.8Hz,1H),6.79-6.78(m,2H),3.51-3.44(m,2H),2.69-2.66(t,J＝7.2Hz,2H),1.97-1.92(t,J＝7.2Hz,2H),1.85-1.75(m,2H)；13C NMR(400MHz,DMSO,TMS):171.5,171.1,169.3,152.6,152.2,151.5,151.2,135.6,134.9,133.4,133.3,133.1,131.4,130.2,129.2,128.8,128.7,128.6,125.8,124.7,123.7,118.8,117.9,117.0,116.6,116.3,110.0,108.8,81.6,32.4,25.2,21.4,19.4；m/z(HRMS):Calcd.M-Br，for C55H43O7P2877.24785,found 877.24737。
由图2(核磁氢谱)、图3(核磁碳谱)中和图4(高分辨质谱)，可确认本实施例制备得到的化合物的结构如下：
(二)应用
(1)线粒体靶向超氧自由基探针与超氧化钾的检测试验
将(一)中制备的探针Mito-Superoxide-Tracker 1溶解在DMSO中，配成1mM溶液待用；超氧化钾溶解在DMSO中，配成1mM溶液待用，再用DMSO稀释成1μM溶液；取8份10μL的1mM的Mito-Superoxide-Tracker 1的DMSO溶液，各溶解在500μL磷酸盐缓冲溶液(PBS，磷酸根离子的浓度0.1M，pH＝7.4)中，然后分别加入0、10、20、40、80、200、400和800μL体积1μM超氧化钾溶液，最后均用PBS(磷酸根离子的浓度0.1M，pH＝7.4)定容至1ml溶液，分别得到浓度为0、10、20、40、80、200、400和800nM的超氧化钾溶液，反应5min，检测。检测结果如图5所示，由图5可知，线粒体靶向超氧自由基探针Mito-Superoxide-Tracker 1的荧光强度随超氧化钾浓度的增加而增强，荧光强度增强，说明Mito-Superoxide-Tracker 1的量减少与超氧的加入量成正比，证明Mito-Superoxide-Tracker 1能与超氧化钾反应，与超氧化钾的量减少成正比。
(2)线粒体靶向超氧自由基探针的活性氧选择性实验
将(一)中制备的探针Mito-Superoxide-Tracker 1溶解在DMSO中，配成1mM溶液待用；将活性氧O2·、甘肽谷胱(GSH)、次氯酸钠(NaClO)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(·OH)和叔丁基过氧化氢(t-BuOOH)配成1mM PBS，用1mM PBS溶液作为对照组(control)；取7份10μL的1mM的Mito-Superoxide-Tracker 1的DMSO溶液溶解在500μL PBS(浓度0.1M，pH＝7.4)中，分别加入5μL上述不同活性氧溶液，用PBS定容至1000μL，避光孵育5min；然后将孵育好的上述反应液在荧光检测器下，用490nm的光激发，收集530nm处荧光强度。检测结果如图6所示，由图6可知，Mito-Superoxide-Tracker 1能选择性地与超氧阴离子反应，而与其他活性氧则不反应。
(3)细胞毒性测试
1)接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200μL。
2)培养细胞：同一般培养条件，培养24h。
3)加药：将本实施例制备的探针溶解在培养基中，加入96孔板，每孔体积200μL，探针的浓度分别为12.5nM、25nM、50nM、100nM、300nM、500nM、1000nM和5000nM，不加探针的为对照组(con)，培养24h。
4)呈色：培养24天后，每孔加MTT溶液(5mg/mL用pH为7.4的PBS配制)20μL，继续孵育4小时，终止培养；小心吸取孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150μL DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。
5)比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，如图7所示，以探针的浓度为横坐标，490nm处荧光吸收值为纵坐标绘制曲线，由图7可知，证明本发明探针在10μM时几乎没有显示出细胞毒性。
(4)细胞超氧检测共聚焦成像
1)按标准操作法培养好H9C2小鼠心肌细胞待用。
2)分别按每孔1万个的密度将细胞种在confocal皿内，加2ml 1640培养基贴壁培养24h，取三份放置于三个培养皿中，分别按照3)-5)进行三种培养。
3)取细胞核靶向探针Hochest溶解在PBS中，稀释成2ug/ml于培养基中，加入到细胞中培养30min，移走药液，用PBS洗涤一遍。
4)取制备的探针Mito-Superoxide-Tracker 1溶解在PBS中，配置成10μM溶液，稀释成800nM的培养基中，加入到细胞中培养30min，移走药液，用PBS洗涤一遍。
5)线粒体超氧探针MitoTracker-Red配成10nM培养液，加入到细胞中培养30min。移走药液，用PBS洗涤一遍。
6)在上述三个皿中分别加培养基稀释好的10μM的百草枯、10μM的DOX、30mM的高浓度葡萄糖，孵育30min，移走药液，PBS洗涤一遍。
7)加药的细胞在激光共聚焦下用405nm、488nm和559nm同时激发，结果如图8所示，由图8可知，本发明制备的探针的绿色荧光与线粒体成像探针MitoTracker-Red的红色荧光能够很好的重合叠加，证明本发明的探针能选择性地在线粒体成像。
(5)线虫成像测试
1)按标准条件培养好线虫待用，待线虫长到成年且生长状态良好，用M9溶液洗出部分线虫待用。
2)取本实施例制备得到的探针溶解在M9溶液中，配置成800nM溶液，加入到线虫中培养30min。
3)线粒体成像探针Mito‐SOX配成1μM培养液，加入到线虫中培养30min。
4)在加有线虫的同时进行步骤2)和3)培养皿各个3个中分别加药，即加入培养基稀释好的50μM的百草枯，孵育30min，移走药液，PBS洗涤一遍。
5)将加药的线虫在激光共聚焦下用488nm和559nm同时激发，结果如图9所示，由图9可知，本发明的探针的绿色荧光与线粒体成像探针Mito‐SOX的红色荧光能够很好的重合叠加，证明我们发明的探针能选择性地在线粒体成像。
实施例2、线粒体靶向超氧自由基探针Mito-Superoxide-tracker 2的制备和应用
按照如图10所示的合成路线制备线粒体靶向超氧自由基探针Mito-Superoxide-tracker 2。
(一)线粒体靶向超氧自由基探针Mito-Superoxide-tracker 2的制备
(1)将4-硝基荧光素溶解在THF中，在20℃下慢慢滴加三肽到反应液中，按4-硝基荧光素与三肽的摩尔比为3：1投料，加入EDC缩合剂，4-硝基荧光素与缩合剂按1：1.2投料，在0～40℃搅拌反应10h，反应结束冷却到0～10℃，蒸干反应溶剂，经柱层析和重结晶分离纯化得中间产物Ⅲ。
结构确证结果如下：1H NMR(300MHz,DMSO,TMS):δ8.65(s,2H),8.51(m,J＝7.5Hz,1H),8.41(m,J＝7.5Hz,1H),8.32(s,1H),8.18(s,1H),7.65-7.60(d,J＝7.5Hz,1H),7.25-7.21(d,J＝6.5Hz,1H),7.22-7.10(t,J＝6.8Hz,1H),7.18-7.13(m,J＝7.5Hz,1H),7.03-6.98(d,J＝6.0Hz,1H),6.92-6.87(d,J＝7.5Hz,1H),6.83-6.71(1,J＝7.5Hz,1H),3.68-3.58(t,J＝7.5Hz,2H),3.52-3.42(t,J＝7.5Hz,2H),3.45-3.35(t,J＝7.5Hz,2H),3.33-3.23(t,J＝7.5Hz,2H),2.62-2.51(t,J＝7.0Hz,1H),0.98-0.82(d,J＝7.5Hz,6H)；13CNMR(300MHz,DMSO,TMS):δ173.3,169.8,152.4,151.7,151.4,150.3,147.4,134.5,133.5,130.8,129.5,129.2,128.8,127.2,126.1,125.8,124.1,113.9,111.9,107.7,105.7,84.8,64.9,59.2,39.2,37.9,30.5,27.1,18.9；m/z(HRMS):Calcd.M，For C31H30N4O10618.24,found 618.6478。
(2)将中间产物Ⅲ溶解在THF中，在40～60℃下慢慢滴加二苯磷酰氯到反应液中，中间产物Ⅲ与二苯磷酰氯的投料摩尔比为1：1.5，在40～100℃搅拌反应20h，反应结束搅拌冷却到25℃，蒸干反应溶剂，经柱层析和重结晶分离纯化得中间产物Ⅳ。
结构确证结果如下：1H NMR(300MHz,DMSO，TMS):δ8.65(s,2H),8.51(m,J＝7.5Hz,1H),8.41(m，J＝7.5Hz,1H),8.32(s,1H),8.18(s,1H),7.86-7.79(d,J＝7.5Hz,4H),7.65-7.60(d,J＝7.5Hz,1H),7.56-7.48(d,J＝7.5Hz,4H),7.45-7.37(d,J＝7.5Hz,2H),7.25-7.21(d,J＝6.5Hz,1H),7.22-7.10(t,J＝6.8Hz,1H),7.18-7.13(m,J＝7.5Hz,1H),7.03-6.98(d,J＝6.0Hz,1H),6.92-6.87(d,J＝7.5Hz,1H),6.83-6.71(1,J＝7.5Hz,1H),3.68-3.58(t,J＝7.5Hz,2H),3.52-3.42(t,J＝7.5Hz,2H),3.45-3.35(t,J＝7.5Hz,2H),3.33-3.23(t,J＝7.5Hz,2H),2.62-2.51(t,J＝7.0Hz,1H),0.98-0.82(d,J＝7.5Hz,6H)；13CNMR(300MHz,DMSO,TMS):δ173.3,169.8,152.4,151.7,151.4,150.3,147.4,134.5,134.2,133.5,130.8,130.2,129.8,129.5,129.2,128.8,128.1,127.2,126.1,125.8,124.1,113.9,111.9,107.7,105.7,84.8,64.9,59.2,39.2,37.9,30.5,27.1,18.9；m/z(HRMS):Calcd.M，for C43H39N4O11P 818.20,found 818.7653。
(3)将中间产物Ⅳ溶解在THF中，在60℃下慢慢滴加溴甲烷到反应液中，中间产物Ⅳ与溴甲烷的投料摩尔比为1：5，在40～80℃搅拌反应15h，反应结束冷却到10～20℃，蒸干反应溶剂，经柱层析和重结晶分离纯化得中间产物Ⅴ。
结构确证结果如下：1H NMR(300MHz,DMSO，TMS):δ8.65(s,2H),8.51(m,J＝7.5Hz,1H),8.41(m，J＝7.5Hz,1H),8.32(s,1H),8.18(s,1H),7.86-7.79(d,J＝7.5Hz,4H),7.65-7.60(d,J＝7.5Hz,1H),7.56-7.48(d,J＝7.5Hz,4H),7.45-7.37(d,J＝7.5Hz,2H),7.25-7.21(d,J＝6.5Hz,1H),7.22-7.10(t,J＝6.8Hz,1H),7.18-7.13(m,J＝7.5Hz,1H),7.03-6.9(d,J＝6.0Hz,1H),6.92-6.87(d,J＝7.5Hz,1H),6.83-6.71(1,J＝7.5Hz,1H),3.68-3.58(t,J＝7.5Hz,2H),3.52-3.42(t,J＝7.5Hz,2H),3.45-3.35(t,J＝7.5Hz,2H),3.33-3.23(t,J＝7.5Hz,2H),3.30-3.28(s，9H),2.62-2.51(t,J＝7.0Hz,1H),0.98-0.82(d,J＝7.5Hz,6H)；13C NMR(300MHz,DMSO,TMS):δ173.3,169.8,152.4,151.7,151.4,150.3,147.4,134.5,134.2,133.5,130.8,130.2,129.8,129.5,129.2,128.8,128.1,127.2,126.1,125.8,124.1,113.9,111.9,107.7,105.7,84.8,64.9,59.2,54.1,39.2,37.9,30.5,27.1,18.9；m/z(HRMS):Calcd.M,for C46H46BrN4O11P 940.21,found 941.7756。
(4)将中间产物Ⅴ溶解在THF，在-40～0℃下将LiAlH4慢慢加入到反应液中，中间产物Ⅴ与LiAlH4的投料摩尔比为1：2，在-20℃搅拌反应15h，反应结束冷却到10～20℃，蒸干反应溶剂，经柱层析和重结晶分离纯化得中间产物Ⅵ。
结构确证结果如下：1H NMR(300MHz,DMSO,TMS):δ8.65(s,2H),8.51(m,J＝7.5Hz,1H),8.41(m，J＝7.5Hz,1H),8.32(s,1H),8.18(s,1H),7.86-7.79(d,J＝7.5Hz,4H),7.65-7.60(d,J＝7.5Hz,1H),7.56-7.48(d,J＝7.5Hz,4H),7.45-7.37(d,J＝7.5Hz,2H),7.25-7.21(d,J＝6.5Hz,1H),7.22-7.10(t,J＝6.8Hz,1H),7.18-7.13(m,J＝7.5Hz,1H),7.03-6.98(d,J＝6.0Hz,1H),6.92-6.87(d,J＝7.5Hz,1H),6.83-6.71(1,J＝7.5Hz,1H),5.28(s,2H),3.68-3.58(t,J＝7.5Hz,2H),3.52-3.42(t,J＝7.5Hz,2H),3.45-3.35(t,J＝7.5Hz,2H),3.33-3.23(t,J＝7.5Hz,2H),3.30-3.28(s，9H),2.62-2.51(t,J＝7.0Hz,1H),0.98-0.82(d,J＝7.5Hz,6H)；13C NMR(300MHz,DMSO,TMS):δ173.3,169.8,152.4,151.7,151.4,150.3,147.4,134.5,134.2,133.5,130.8,130.2,129.8,129.5,129.2,128.8,128.1,127.2,126.1,125.8,124.1,113.9,111.9,107.7,105.7,84.8,64.9,59.2,54.1,39.2,37.9,30.5,27.1,18.9；m/z(HRMS):Calcd.M,for C46H48BrN4O9P 910.23,found 911.7936。
(5)将中间产物Ⅵ溶解在THF中，在10～40℃下将三苯基磷丁羧酸慢慢加入到反应液中，中间产物Ⅵ与三苯基磷丁羧酸的投料摩尔比为1：1.5，加入DCC缩合剂，中间产物Ⅵ与缩合剂投料摩尔比为1：1.5，在10～50℃搅拌反应15h，反应结束冷却到25℃，蒸干反应溶剂，经柱层析和重结晶分离纯化得目标探针Mito-Superoxide-tracker 2。
结构确证结果如下：1H NMR(300MHz,DMSO,TMS):δ8.65(s,2H),8.51(m,J＝7.5Hz,1H),8.41(m,J＝7.5Hz,1H),8.32(s,1H),8.18(s,1H),7.86-7.79(d,J＝7.5Hz,4H),7.65-7.60(d,J＝7.5Hz,1H),7.56-7.48(d,J＝7.5Hz,4H),7.45-7.37(d,J＝7.5Hz,2H),7.36-7.29(d,J＝7.5Hz,3H),7.30-7.24(d,J＝7.5Hz,6H),7.25-7.21(d,J＝6.5Hz,1H),7.22-7.10(t,J＝6.8Hz,1H),7.18-7.13(m,J＝7.5Hz,1H),7.12-7.03(d,J＝7.5Hz,6H),7.03-6.98(d,J＝6.0Hz,1H),6.92-6.87(d,J＝7.5Hz,1H),6.83-6.71(1,J＝7.5Hz,1H),5.28(s,2H),3.68-3.58(t,J＝7.5Hz,2H),3.52-3.42(t,J＝7.5Hz,2H),3.45-3.35(t,J＝7.5Hz,2H),3.33-3.23(t,J＝7.5Hz,2H),3.30-3.28(s,9H),2.62-2.51(t,J＝7.0Hz,1H),2.46-2.38(t,J＝7.0Hz,2H),2.39-2.30(t,J＝7.0Hz,2H),1.70-1.59(m,J＝7.0Hz,2H),0.98-0.82(d,J＝7.5Hz,6H)；13C NMR(300MHz,DMSO,TMS):δ173.3,169.8,152.4,151.7,151.4,150.3,147.4,134.5,134.2,133.5,130.8,130.2,129.8,129.5,129.2,128.8,128.1,127.2,126.1,125.8,124.1,113.9,111.9,107.7,105.7,84.8,64.9,59.2,54.1,39.2,37.9,30.5,27.1,18.9；m/z(HRMS):Calcd.M，for C68H68Br2N4O10P21320.36,found 1321.6839。
由上述谱图数据，可确认本实施例制备得到的化合物的结构如下：
(二)应用
(1)线粒体靶向超氧自由基探针与超氧化钾的检测试验
与实施例1中测定方法相同，实验结果如图11所示，由图11可知，线粒体靶向超氧自由基探针Mito-Superoxide-Tracker 2的荧光强度随超氧化钾浓度的增加而增强，荧光强度增强说明Mito-Superoxide-Tracker 2的量减少与超氧的加入量成正比，证明Mito-Superoxide-Tracker 2能与超氧化钾反应，与超氧化钾的量减少成正比。
(2)细胞毒性测试
与实施例1中测定方法相同，实验结果如图12所示，5000nM时Mito-Superoxide-Tracker 2的细胞毒性很小，适合生物学应用。
(3)细胞超氧检测共聚焦成像
与实施例1中测定方法相同，实验结果如图13所示，Mito-Superoxide-Tracker 2能高度选择性地聚集在细胞线粒体中，并对不同刺激条件下产生的超氧具有灵敏地响应。
(4)线虫成像测试
与实施例1中测定方法相同，实验结果如图14所示，Mito-Superoxide-Tracker 2也能监测到线虫细胞受刺激产生的超氧阴离子。
Claims (10)
1.一种化合物，其结构式为式Ⅰ或式Ⅰ′，
式Ⅰ和式Ⅰ′中：X-M+-L-D和X-M+均为线粒体靶向分子基团；
M+为R3P+、R3N+，R为碳原子数为2～6的链状烷基或苯基；
X-为Cl-、Br-或I-；
L为碳原子数为2～10的链状烷基、-(OCH2CH2)n-或2～10个氨基酸基团组成的直链，其中n为2～5的整数，所述氨基酸基团为2～10个氨基酸脱水缩合；
D为-CONH-、-CH2-NH-或-CO-O-；或D与L中的端位基团共同形成下述基团中的任意一种：-CONH-、-CH2-NH-和-CO-O-。
2.权利要求1所述化合物式Ⅰ或式Ⅰ′的制备方法，式Ⅰ的制备方法包括如下步骤：
(1)在有机溶剂Ⅰ中，荧光素与二苯基次磷酰氯进行反应Ⅰ，得到中间产物Ⅰ；
所述有机溶剂Ⅰ为DMSO、DMF、THF、甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
(2)在有机溶剂Ⅱ中，所述中间产物Ⅰ与X-L-D-Y进行反应Ⅱ，得到中间产物Ⅱ；
X-L-D-Y和中间产物Ⅱ中，X为-Cl、-Br或-I；L为碳原子数为2～10的链状烷基、-(OCH2CH2)n-或2～10个氨基酸基团组成的直链，其中n为2～5的整数，所述氨基酸基团为2～10个氨基酸脱水缩合；D为-CONH-、-CH2-NH-或-CO-O-；或D与L中的端位基团共同形成下述基团中的任意一种：-CONH-、-CH2-NH-和-CO-O-；Y为-OH、-Cl、-Br或-I；
所述有机溶剂Ⅱ为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
(3)在有机溶剂Ⅲ中，所述中间产物Ⅱ与M进行反应Ⅲ，得到式Ⅰ所示化合物；
所述M中，M为R3P、R3N，R为碳原子数为2-6的链状烷基或苯基；
所述有机溶剂Ⅲ为DMSO、DMF、THF、甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
式Ⅰ′的制备方法包括如下步骤：
(1)在有机溶剂Ⅰ中，荧光素与二苯基次磷酰氯进行反应Ⅰ，得到中间产物Ⅰ；
所述有机溶剂Ⅰ为DMSO、DMF、THF、甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
(2)在有机溶剂Ⅲ中，所述中间产物Ⅰ与MX进行反应Ⅲ′，得到式Ⅰ′所示化合物；
所述MX中，M为R3P、R3N，R为碳原子数2～6的链状烷基或苯基；X为-Cl、-Br或-I；
所述有机溶剂Ⅲ为DMSO、DMF、THF、甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：式Ⅰ的制备方法步骤(1)中，所述荧光素与所述二苯基次磷酰氯的摩尔比为5～1：1；所述反应Ⅰ的温度为40～120℃，时间为8～40h；
步骤(2)中，所述中间产物Ⅰ与所述X-L-D-Y的摩尔比为1：1～5；所述反应Ⅱ的温度为0～50℃，时间为8～20h；
步骤(3)中，所述中间产物Ⅱ与所述M的摩尔比为1：1～5；所述反应Ⅲ的温度均为30～120℃，时间均为10～40h；
式Ⅰ′的制备方法步骤(1)中，所述荧光素与所述二苯基次磷酰氯的摩尔比为5～1：1；所述反应Ⅰ的温度为40～120℃，时间为8～40h；
步骤(2)中，所述中间产物Ⅰ与MX的摩尔比为1：1～5；所述反应Ⅲ′的温度为30～120℃，时间均为10～40h。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：所述反应Ⅰ、所述反应Ⅱ、所述反应Ⅲ和所述反应Ⅲ′结束后均包括冷却至0～20℃的步骤。
5.一种化合物，其结构式为式Ⅱ或式Ⅱ′，
式Ⅱ和式Ⅱ′中，X-M+-L-D、X-M+、X-M′+-L′-D′和X-M′+均为线粒体靶向分子基团；
M+和M′+均为R3P+、R3N+，R为碳原子数为2～6的链状烷基或苯基；
X-为Cl-、Br-或I-；
L和L′均为碳原子数为2～10的链状烷基、-(OCH2CH2)n-或2～10个氨基酸基团组成的直链，其中n为2～5的整数，所述氨基酸基团为2～10个氨基酸脱水缩合；
D和D′均为-CONH-、-CH2-NH-或-CO-O-；或D与L中的端位基团共同形成下述基团中的任意一种：-CONH-、-CH2-NH-和-CO-O-，或D′与L′中的端位基团共同形成下述基团中的任意一种：-CONH-、-CH2-NH-和-CO-O-。
6.权利要求5所述化合物式Ⅱ或式Ⅱ′的制备方法，式Ⅱ的制备方法包括如下步骤：
(1)在有机溶剂Ⅳ中，在缩合剂的作用下4-硝基荧光素与X-L-D-Y进行反应Ⅳ，得到中间产物Ⅲ，
X-L-D-Y和中间产物Ⅲ中，X为-Cl、-Br或-I；L为碳原子数为2～10的链状烷基、-(OCH2CH2)n-或2～10个氨基酸基团组成的直链，其中n为2～5的整数，所述氨基酸基团为2～10个氨基酸脱水缩合；D为-CONH-、-CH2-NH-或-CO-O-；或D与L中的端位基团共同形成下述基团中的任意一种：-CONH-、-CH2-NH-和-CO-O-；Y为-OH、-Cl、-Br或-I；
所述有机溶剂Ⅳ为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
所述缩合剂为二环己基碳二亚胺、可溶于水的碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶或O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸；
(2)在有机溶剂Ⅴ中，所述中间产物Ⅲ与二苯基次磷酰氯进行反应Ⅴ，得到中间产物Ⅳ，
中间产物Ⅳ中，X为-Cl、-Br或-I；L为碳原子数2～10的链状烷基、-(OCH2CH2)n-或2～10个氨基酸基团组成的直链，其中n为2～5的整数，所述氨基酸基团为2～10个氨基酸脱水缩合；D为-CONH-、-CH2-NH-或-CO-O-；或D与L中的端位基团共同形成下述基团中的任意一种：-CONH-、-CH2-NH-和-CO-O-；
所述有机溶剂Ⅴ为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
(3)在有机溶剂Ⅵ中，所述中间产物Ⅳ与R-X′进行反应Ⅵ，得到中间产物Ⅴ，
R-X′和中间产物Ⅴ中，M+为R3P+、R3N+，R为碳原子数2～6的链状烷基或苯基；X-为Cl-、Br-或I-；X′为-Cl、-Br或-I；L为碳原子数2～10的链状烷基、-(OCH2CH2)n-或2～10个氨基酸基团组成的直链，其中n为2～5的整数，所述氨基酸基团为2～10个氨基酸脱水缩合；D为-CONH-、-CH2-NH-或-CO-O-；或D与L中的端位基团共同形成下述基团中的任意一种：-CONH-、-CH2-NH-和-CO-O-；
所述有机溶剂Ⅵ为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
(4)在有机溶剂Ⅶ中，所述中间产物Ⅴ进行反应Ⅶ，还原剂将硝基还原为氨基，得到中间产物Ⅵ，
中间产物Ⅵ中，M+为R3P+、R3N+，R为碳原子数2～6的链状烷基或苯基；X-为Cl-、Br-或I-；L为碳原子数2～10的链状烷基、-(OCH2CH2)n-或2～10个氨基酸基团组成的直链，其中n为2～5的整数，所述氨基酸基团为2～10个氨基酸脱水缩合；D为-CONH-、-CH2-NH-或-CO-O-；或D与L中的端位基团共同形成下述基团中的任意一种：-CONH-、-CH2-NH-和-CO-O-；
所述有机溶剂Ⅶ为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
所述还原剂为LiAlH4；
(5)在有机溶剂Ⅷ中，所述中间产物Ⅵ与M′-L′-D′-Y进行反应Ⅷ，得到式Ⅱ，
M′-L′-D′-Y中，M′为-PR3、-NR3，R为碳原子数2～6的链状烷基或苯基；L′为碳原子数2～10的链状烷基、-(OCH2CH2)n-或2～10个氨基酸基团组成的直链，其中n为2～5的整数，所述氨基酸基团为2～10个氨基酸脱水缩合；D′为-CONH-、-CH2-NH-或 -CO-O-；或D′与L′中的端位基团共同形成下述基团中的任意一种：-CONH-、-CH2-NH-和-CO-O-；Y为-OH、-Cl、-Br或-I；
所述有机溶剂Ⅷ为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种。
式Ⅱ′的制备方法包括如下步骤：
(1)在有机溶剂Ⅴ中，所述4-硝基荧光素与二苯基次磷酰氯进行反应Ⅴ′，得到中间产物Ⅳ′，
所述有机溶剂Ⅴ′为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
(2)在有机溶剂Ⅵ中，所述中间产物Ⅳ与M-X′进行反应Ⅵ′，得到中间产物Ⅴ′，
M-X′和中间产物Ⅴ′中，M+为R3P、R3N+，R为碳原子数为2-6的链状烷基或苯基3；M为R3P、R3N+，R为碳原子数为2-6的链状烷基或苯基3；X-为Cl-、Br-或I-；X′为-Cl、-Br或-I；
所述有机溶剂Ⅵ为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
(3)在有机溶剂Ⅶ中，所述中间产物Ⅴ进行反应Ⅶ′，还原剂将硝基还原为氨基，得到中间产物Ⅵ′，
中间产物Ⅵ′中，M为R3P、R3N，R为碳原子数为2～6的链状烷基或苯基；X-为Cl-、Br-或I-；
所述有机溶剂Ⅶ为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
所述还原剂为LiAlH4；
(4)在有机溶剂Ⅷ中，所述中间产物Ⅵ′与M′X′进行反应Ⅷ′，得到式Ⅱ′，
M′X′中，M′为R3P、R3N，R为碳原子数为2～6的链状烷基或苯基，X′为-Cl、-Br或-I；X-为Cl-、Br-或I-；
所述有机溶剂Ⅷ为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：式Ⅱ的制备方法步骤(1)中，所述4-硝基荧光素、所述X-L-D-Y与所述缩合剂的摩尔比为1～3：1：1～6；所述反应Ⅳ的温度为0～40℃，时间为5～40h；
步骤(2)中，所述中间产物Ⅲ与所述二苯基次磷酰氯的摩尔比为1～3：1；所述反应Ⅴ的温度为40～120℃，时间为8～40h；
步骤(3)中，所述中间产物Ⅳ与所述R-X′的摩尔比为1：3～10；所述反应Ⅵ的温度为80～120℃，时间为20～40h；
步骤(4)中，所述中间产物Ⅴ与所述还原剂的摩尔比为1：1～3；所述反应Ⅶ的温度为-40～0℃，时间为8～40h；
步骤(5)中，所述中间产物Ⅵ与所述M′-L′-D′-Y的摩尔比为1：1～5；所述反应Ⅷ的温度为10～50℃，时间为15～40h；
式Ⅱ′的制备方法步骤(1)中，所述4-硝基荧光素与所述二苯基次磷酰氯的摩尔比为1～3：1；所述反应Ⅴ′的温度为40～120℃，时间为8～40h；
步骤(2)中，所述中间产物Ⅳ′与所述M-X′的摩尔比为1：3～10；所述反应Ⅵ′的温度为80～120℃，时间为20～40h；
步骤(3)中，所述中间产物Ⅴ′与所述还原剂的摩尔比为1：1～3；所述反应Ⅶ′的温度为-40～0℃，时间为8～40h；
步骤(4)中，所述中间产物Ⅵ′与所述M′X′的摩尔比为1：1～5；所述反应Ⅷ′的温度为10～40℃，时间为15～40h。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于：所述反应Ⅳ结束后还包括冷却至0～10℃的步骤；
所述反应Ⅵ、所述反应Ⅵ′、所述反应Ⅶ和所述反应Ⅶ′结束后均包括冷却至0～20℃的步骤；
所述反应Ⅴ、所述反应Ⅴ′、所述反应Ⅷ和所述反应Ⅷ′结束后均包括冷却至0～30℃的步骤。
9.权利要求1所述化合物或权利要求5所述化合物在制备线粒体靶向超氧自由基探针中的应用。
10.权利要求1所述化合物或权利要求5所述化合物在线粒体靶向超氧自由基检测和线粒体靶向成像中的应用。
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