CN1540332A

CN1540332A - 金属分散碳氧化酶传感器

Info

Publication number: CN1540332A
Application number: CNA031220142A
Authority: CN
Inventors: 方卢; 卢方; 陆农; 王凯华
Original assignee: Intec Products Inc Xiamen
Current assignee: Intec Products Inc Xiamen
Priority date: 2003-04-22
Filing date: 2003-04-22
Publication date: 2004-10-27

Abstract

本发明涉及改良的金属分散碳氧化酶传感器，以及使用该装置在基本上排除了氧化还原性干扰物质干扰的条件下检测分析物的方法。所说的方法是利用氧化酶催化样品中的分析物产生电化学活性物质，在金属分散碳电极电位约为零伏的条件下对这些活性物质进行电化学检测，并依据电化学反应产生的电信号测得样品中分析物的水平。该方法基本上排除了易氧化还原物质对样品中待测物质的干扰和影响，从而提高了检测的选择性和可再现性。

Description

金属分散碳氧化酶传感器

发明领域

发明背景

电化学生物传感器，特别是氧化酶电流计量(安培)传感器由于具有灵敏度高，响应迅速，以及小型化和成本低等优点，目前已在临床诊断、食物质量控制、环境监测和工艺控制等领域得到十分广泛的应用。

一般说来，生物传感器的信號反映是基于酶催化反应所产生的可氧化还原物质，并且依据这些物质在传感器上引起的氧化还原电流信号得以连续检测样品的中分析物。例如，在分析血中葡萄糖含量的检测系统中，葡萄糖氧化酶在氧的存在下将葡萄糖转化成葡糖酸和过氧化氢。过氧化氢可在电极上氧化，并产生与其浓度成正比的电流，固可借以直接反映样品中的葡萄糖浓度。由于酶所固有的高度选择性质，所以因酶的活性中心和电极表面的电子改变所获得的电流信号具有极高的敏感性和选择性。

目前基本上有四种氧化酶安培传感器，它们分别是基于测定氧的消耗、测定酶促反应的产物、利用多酶反应，和使用介质分子。

其中基于测定酶促反应产物的方法克服了因环境中氧含量波动对检测结果的影响。然而，该方法一般需在较高电极电位下进行，因而常常受到溶液中易氧化物质的干扰。例如使用该方法检测葡萄糖含量时，常常因血液中抗坏血酸等易氧化物质的存在而影响检测结果的准确性。

目前，较为常用的氧化酶安培传感器是使用介质分子。介质分子是一种具有电化学可逆反应和低氧化还原电位的小分子。介质分子能够在电极和酶之间穿梭发挥电子转移作用，因而有益于降低氧化还原电位，减少样品中电活性物质的干扰。然而，由于环境中氧和介质分子间的竞争反应、介质分子的流失，以及介质分子在其氧化还原电位下仍不足以排除某些干扰物质的影响等问题，所以仍有必要对传感器本身特别是其电极系统和相应的检测方法作进一步的改进。

发明目的

本发明的一个目的是提供一种可在低电极电位下工作的氧化酶安培传感器，其基本上由以下部分组成：

(1)一个具有对电活性物质发挥强的电催化作用，并且足以消除样品中混杂的易氧化还原物质的干扰的金属分散碳催化系统；

(2)一个有氧化酶参与生物识别反应的生物识别系统；以及

(3)一个将生物识别反应产生的电流活性物质传递给金属分散碳催化系统，并将金属分散碳催化系统产生的电信号传递到信号接受装置的传递系统；

(4)一个将由信号识别系统获得的电信号转化成分析物浓度或含量数据的信号转化系统。根据本发明的一个优选实施方案，所说的金属分散碳催化系统由金属颗粒或粉末与适当比例的导电材料混合而成。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的金属选自元素周期表中的过渡元素。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的金属选自钌、钇和铑。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的导电材料选自碳和石墨。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的低电极电位是-0.2V至0.1V。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的低电极电位是-0.2V至0.3V。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的生物识别系统由选自下列一组中的能够催化被检测底物产生电化学活性物质的酶组成：葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、氨氧化酶、氨基酸氧化酶、乙醇氧化酶、黄嘌呤氧化酶、胆固醇氧化酶、肌酸氧化酶。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的电化学活性物质选自过氧化氢和过氧化物。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的分析物是能够在氧化酶的催化下产生电化学活性物质的化合物。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的分析物选自葡萄糖、乳酸、氨基酸、乙醇、胆固醇和肌醇。

附图简要说明

图1显示本发明的以金属分散碳糊为电极材料的氧化酶传感器的基本工作原理。

图2显示在使用不同的电极的情况下记录的氧化酶酶促反应中所产生的过氧化氢的流体动力学伏安曲线。(A)钌(Ru)分散碳糊电极；(B)常规碳糊电极。

图3显示在0.05M磷酸盐溶液(pH7.4)中和300转/分钟搅拌条件下，使用不同电极在0.05V电极电位下测得的过氧化氢(2.5mM)电流阶梯响应曲线。(A)钌(Ru)分散碳糊电极；(B)常规碳糊电极。

图4显示在0.05M磷酸盐溶液(pH7.4)中和300转/分钟搅拌条件下，使用不同电极(电极电位-0.15伏)测得的葡萄糖电流阶梯响应曲线。(A)钌(Ru)分散碳糊电极；(B)常规碳糊电极。

图5显示使用本发明的以金属分散碳糊电极作为工作电极的葡萄糖传感器检测样品中的葡萄糖浓度时，在不同电极电位下易氧化还原物质对检测结果的影响。(A)工作电极电位+0.2伏；(B)工作电极电位-0.1伏。分析物中含有葡萄糖(G)5×10^-3M、抗坏血酸(AA)1×10^-4M、Acetaminopher(AC)1×10^-4M和尿酸(UA)1×10^-4M。

图6是本发明氧化酶传感器的金属分散碳印刷电极示意图。(A)和(B)为俯视图；(C)为侧视图。

图7是显示本发明氧化酶传感器的金属分散碳印刷电极各部分组成的示意图。

图8显示过氧化氢在金属分散碳印刷电极上的电流-时间关系曲线。(A)为磷酸盐缓冲溶液(0.05M，pH7.4)空白对照；(B)为过氧化氢溶液(3mg/mL)。

图9显示过氧化氢在铜(Cu)分散碳印刷电极上的电流-时间曲线。(A)为磷酸盐缓冲溶液(0.05M，pH7.4)空白对照；(B)为过氧化氢溶液(3mg/mL)。

图10显示葡萄糖溶液在金属分散碳印刷电极上的电流-时间曲线。(A)是磷酸盐缓冲溶液(50mM，pH7.4)对照；(B)是较低浓度葡萄糖溶液(0.1mM)；(C)是较高浓度葡萄糖溶液(10mM)。

发明的详细描述

一般说来，被检测的样品中除含有一定量的分析物外，还常常含有许多与分析物伴随的其他物质。在基于氧化还原反应的检测方法中，这些物质特别是其中的某些易被氧化还原的化合物，常常也会发生与分析物相似的电子转移反应，干扰针对特定分析物的检测，从而致使检测结果准确性降低。为了解决这些问题，研究者们试图以在碳糊或石墨电极中掺入或表面涂布电催化介质(例如铂等金属或有机金属盐)、改变电极的排布方式等(例如参见Zhao at et.，Biosensors &Bioelectronics 8：583-491，1993；Atanasov et al.，Biosensors &Bioelectronics 7：361-365，1992；美国专利5,227,042)手段加速电子流动，以期减低电极间氧化还原电位差。然而由于前面提到原因，这些方法均不能获得令人满意的效果。

本发明人在长期的研究和生产实践中令人惊奇地发现，某些金属特别是元素周期表中过渡周期的某些金属元素或他们的化合物，可作为一种良好的电催化剂强有力地加速氧化还原反应中的电子流动，使反应能够在很低的电极电位例如零电位下进行，从而可基本上排除易氧化还原物质对检测的影响，提高检测的选择性和敏感性。

因此，本发明的一个首要目的是提供对溶于液体溶液中的底物进行电流计量检测的生物传感系统和使用所说的传感系统检测分析物的方法。所说的传感系统或传感器基本上包括以下几个部分：

一个具有对电化学活性物质发挥强的电催化作用并且足以消除样品中混杂的易氧化还原物质的干扰的金属分散碳催化系统；

一个有氧化酶参与生物识别反应的生物识别系统；以及

一个将生物识别反应产生的电流活性物质传递给金属分散碳催化系统，并将金属分散碳催化系统产生的电信号传递到信号接受装置的传递系统；

一个将由信号识别系统获得的电信号转化成分析物的浓度或含量数据的转化系统。

本发明生物传感器的特征在于，在工作(检测)电极的碳糊材料中和/或电极表面分散有选自元素周期表第五周期的金属元素，特别是选自钌、钇和铑的金属元素，或这些金属的有机或无机化合物。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的金属分散碳催化系统基本上是由表面涂布或内部分散有选自元素周期表第五周期的金属元素或其有机或无机化合物的碳材料电极组成的。

根据本发明的一个特别优选的实施方案，所说的金属分散碳催化系统基本上是由表面涂布或内部分散有选自钌、钇和铑的金属元素，或这些金属的有机或无机化合物的碳材料电极组成的。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的生物识别系统基本上是涂敷于碳电极上的氧化酶和相关试剂。其中氧化酶催化分析物的氧化反应并释放出作为氧化产物的过氧化氢。然后，散布于碳电极中的电催化金属在很低的电极电位例如零电位下将过氧化氢转化(还原)成水，并释放出自由电子，从而在电极之间形成有固定电位差的电流。在本发明的一个优选实施中，传感系统中电极电位一般是在-0.2和+0.3伏之间。在这样一个电极电位范围内即在电极电位约为零时进行检测，基本上可以消除与分析物共存的各种易氧化还原物质和环境中的氧的相似电化学行为对检测结果的干扰，从而提高传感器的选择性。其中所说的氧化酶包括但不只限于葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、氨氧化酶、氨基酸氧化酶、乙醇氧化酶、黄嘌呤氧化酶、胆固醇氧化酶、肌酸氧化酶。

根据本发明的一个特别优选的实施方案，其中所说的分析物是葡萄糖。

在本发明的一个优选实施方案中，所说的检测系统包括一个由其中分散有电催化金属并且能特异地还原过氧化氢的碳电极构成的工作(检测)电极，和对分析物特异的氧化酶。在本发明的另一个优选实施方案中，工作电极包括掺入了电催化金属钌颗粒的碳材料和葡萄糖氧化酶。

因此，本发明的传感装置可以是双电极体系或多电极体系的。其中优选的是由一个工作电极和一个参比电极组成双电极体系。但在有些情况下，也可加入第三个对(辅助)电极。工作电极由其中分散有电催化金属和氧化酶的碳材料构成，并且所说的金属可以是选自钌、钇、铑的过渡金属。所说的氧化酶包括但不只限于葡萄糖氧化酶，乳酸氧化酶、单氨氧化酶、L-氨基氧化酶、乙醇氧化酶、黄嘌呤氧化酶、胆固醇氧化酶和肌酸氧化酶。对电极一般由碳、金属或电导体材料构成。参比电极是具有恒定电极电位的常规银/氢化银电极。本发明的金属分散氧化酶安培传感装置可以是试剂条式，微碳针式或矩阵式的。

可使用电路印刷技术制作本发明的基于所谓金属分散碳电极和氧化酶的传感器。例如可以首先使用丝网印刷方法将导电油墨印在绝缘的载体(电极基片)上制成导电电极。用于生产工作电极的导电油墨配方中包括平均直径小于约1微米的碳微粒。在本发明的优选实施方案中，油墨配方中混有足够量对过氧化氢有高还原活性的金属催化剂，并可在混合过程中适当地加入氧化酶，或者将上述金属分散碳材料(油墨)印刷在电极基片上之后，可使用本领域技术人员已知的物理或化学方法将氧化酶固定在电极上，从而得到所需的工作电极。本发明制得的工作电极的本底电流极低、电信号响应迅速、对电化学活性物质(样品中固有的或酶促反应中产生的)具有强电催化能力。另外，由于生产成本很低，所以本发明的电极系统可以作为一次性消耗材料使用。

本发明涉及改良的金属分散氧化酶传感器，以及使用该装置在排除了氧化还原性干扰物质干扰的条件下检测分析物。如上所述，在工作电极上直接涂敷过氧化物特异性金属催化剂和分析物(作为酶放应底物)特异性酶，可有效地改善检测系统的选择性和敏感性。我们的研究发现，在使用本发明的系统进行的检测中，电极表面电化学反应的本底信号明显降低，而且对电极环境中电化学改变的电极反应明显提高。虽然不拘泥于理论，但据信这些改善可能是由于金属催化剂对释放过氧化氢的酶促反应的电催化活性所致。

以下，以用于选择性电化学定量检测葡萄糖含量的模式系统为例，结合附图详细描述本发明氧化酶传感器的结构特征、制作方法及其优点。

图1显示本发明的系统或方法中所涉及的生物化学和电化学级联反应。其中包括分析物特异性酶与实验样品接触后，酶对分析物的起始酶促氧化反应和过氧化氢的释放。依据本发明的系统，样品中的分析物在氧化酶的作用下氧化分解产生过氧化氢，后者可在-0.2至+0.2伏的极低电极电位下还原，所以即使有抗坏血酸等易氧化还原物质的存在，也不会干扰对分析物的准确检测。

图2显示上述酶促电化学反应产物过氧化氢的流体动力学伏安曲线。在不同的电极电位下，记录过氧化氢在金属分散碳糊(A)和常规碳糊(B)电极下的氧化还原电流。使用常规碳糊(B)电极时，当电极电位在-0.2至0.3伏之间时，过氧化氢不会在电极上产生任何氧化还原反应。相反，在使用本发明的金属分散碳糊电极的情况下，如果电极电位大于约0.3伏(相对于银/氢化银电极)，过氧化氢即在电极上发生氧化反应；当电极电位低于约0.3伏时，过氧化氢则在电极上发生还原反应。相对的，某些易氧化还原物质在电极电位大于-0.2伏(相对于银/氢化银电极)时即可发生氧化还原反应。因此，就金属分散碳糊电极而言，检测过氧化氢的最佳电极电位是在-0.2至+0.1伏之间。正是在这个由本发明的金属分散碳糊电极提供的电极电位范围内，样品中易氧化还原物质的存在才不会对过氧化氢检测造成明显影响。

图3给出了在-0.05V电极电位下，分别使用金属分散碳糊电极(A)和常规碳糊电极(B)检测时，过氧化氢的阶梯电流响应曲线(每阶间过氧化氢浓度相差2.5mM)。B显示为一条直线，说明在此条件下，过氧化氢在常规碳糊电极上不发生电化学反应。相反，在金属分散碳糊电极下过氧化氢则被还原。并且随着过氧化氢浓度的增加，还原电流信号也相应增强。

从上述的检测结果得知，当金属分散碳糊电极电位约为零伏时，过氧化氢即可被还原。由于在氧化酶催化下的反应产物之一是过氧化氢，所以这一令人惊奇的发现促使我们设计一种当电极电位约为零时，即可在几乎排除了外来或伴生的易氧化还原物质干扰的情况下，以高选择性和敏感性检测任何可被氧化酶分解同时释放出过氧化氢的分析物。本发明的金属分散碳糊电极和相应的检测系统就是基于这一发现设计的。

图4显示在-0.15伏电极电位条件下，葡萄糖(5mM)氧化产物H₂O₂在金属Ru分散碳糊葡萄糖电极(A)和常规碳糊葡萄糖电极(B)上还原所发生的阶梯响应电流。由图中可以看出，在给定的电位下，常规碳糊葡萄糖电极上几乎没有葡萄糖的电流响应，而在金属分散碳糊葡萄糖电极上则随着葡萄糖浓度的增加而产生渐增的响应电流。其线性范围可达到30mM葡萄糖浓度水平。另外，可见葡萄糖在电极上的电流响应很快，电流信号于20～30秒内即达到稳态。理想的工作电极电位为响应电流提供了好的信号/噪音比。

安培生物传感器应用中一个急待解决的问题是如何消除溶液中易氧化还原物质的干扰，为此人们曾使用介质分子、多酶体系等方法，但这些方法都存在着一定的局限性，难以完全排除所说的干扰和影响。金属分散碳氧化酶电极提供了理想的解决方法。从这些易氧化还原干扰物质在金属分散碳电极上的循环伏安图(未示出)可以看出，抗坏血酸、Acetoninopher和尿酸等常见易氧化还原物质的起始氧化电极电位约为+0.2V至+0.3V(相对于As/AsCL电极)。所以选择电极电位在+0.20伏以下，特别是在+0.10伏至-0.20伏之间的金属分散碳电极，就有可能避免这些易氧化干扰物质对检测的干扰。在用于制作电极的碳材料确定后，如何选择金属催化剂将是十分关键的。本发明人在长期实践中发现，包括钌、钇、铑在内的元素周期表第五周期过渡元素金属具有极好的氧化还原催化活性。

图5显示在给定的工作电极电位条件下，几种干扰物质对使用金属Ru分散碳糊葡萄糖传感器和常规碳糊葡萄糖传感器进行的检测的干扰。符号G、AA、AC和UA分别代表葡萄糖(5X10^-3M)、抗坏血酸(1X10^-4M)、Acetominopher(1X10^-4M)和尿酸(1X10^-4M)溶液。从图5A所示曲线可见，在+0.2伏电极电位下，葡萄糖溶液的加入产生了一个还原电流，而抗坏血酸的加入产生了一个氧化电流。Acetominopher和尿酸的加入对电流响应无影响。因此，在这一电极电位条件下，Acetominopher和尿酸不干扰样品中葡萄糖的测定，而维生素C将降低葡萄糖的检测电流信号。如选择工作电极电位为-0.10伏，由图5B中可见，抗坏血酸、Acetominopher和尿酸在此电位下均不在电极上产生电化学行为，而只表现有葡萄糖的响应电流。这些结果清楚地表明，金属分散碳氧化酶传感器可在电极电位零伏附近即可测出酶反应产生的电化学活性物质，从而避免了溶液中易氧化还原物质和溶解氧的干扰。

图6A和6B分别是本发明金属分散碳氧化酶安培传感器的双电极体系和三电极体系的俯视图。图C是所说的传感器的侧视图。为了制作本发明的传感器，首先在不导电、不吸水的支持介质(10)上印刷工作电极(30)和参比电极(40)，并且有或没有对(辅助)电极(70)。电极间的距离要尽可能地短，以便消除溶液电阻降及其他因素导致的干扰。在电化学检测区(50)内，电极通过印刷在支持介质上的导电材料(可以是与电极相同的或不同的导电材料)与仪器的主体联接(见图中的标记符(35)，(45)和(75))。除了暴露电化学检测区(50)和与仪器主体联接的部分外，电极的其他部分则被喷涂一层电绝缘并且不透水的绝缘材料(60)。然后，在检测区(50)覆盖一层过滤材料(80)，以阻止干扰物质及分子达到电极表面影响检测结果。检测区(50)的电绝缘材料上留有一个样品收集口(95)，分析物样品溶液可由该样品收集口加入。

图7显示本发明金属分散碳氧化酶安培传感器的各个组成部件。支持介质(10)是由不吸水并且有一定厚度及硬度的绝缘材料例如高聚物材料构成的。工作电极(30)由其中按一定组成比例分散有金属(例如钌)颗粒和氧化酶的碳糊制成。参比电极(40)通常是标准的银/氯化银(Ag/AgCl)或甘汞电极。对电极(70)通常也是由金属、碳等电导体所制成的。绝缘层(60)材料可以是塑料、高分子聚合物、防水纸或油漆等。过滤膜(80)材料可以是尼龙、纤维素等不与样品中的分析物相互作用并且能够过滤干扰物质的材料。样品收集区(90)可以由高分子材料、聚合物、防水纸类或油漆等材料构成。

由其中分散有金属粉末或颗粒的碳材料(例如碳糊)制成的印刷电极对过氧化氢具有很强的电催化能力，它可使过氧化氢在电极电位约为零伏时被还原。图8显示金属Ru分散碳印刷电极在不同溶液中的电流-时间曲线。曲线A显示的是对照样品磷酸盐缓冲溶液(0.05M，pH7.4)。曲线B显示的是被检样品过氧化氢溶液(3.0mg/ml)。

图9是使用金属铜(Cu)分散碳电极，在电极电位零伏条件下测得的电流响应曲线(A)。实验样品为过氧化氢溶液(浓度为3.0mg/ml)(A)；对照样品为磷酸盐缓冲溶液(0.05M，PH7.4)(B)。由图9所示的结果同样可以看出，在电极电位约为零的条件下，金属分散碳电极材料催化过氧化氢还原，从而记录到相应的电流曲线。

由以上结合附图和所列数据对本发明所作的详细描述可以看出，本发明的金属分散碳氧化酶安培传感器，例如金属分散碳葡萄糖传感器，可在基本上消除了易氧化还原物质干扰的情况下，以提高了的选择性和敏感性用于溶液中相应分析物的检测。

下文是使用本发明的金属钌分散碳葡萄糖传感器检测样品中葡萄糖含量的实施例。该实施例只是举例说明而不是限制本发明。

实施例

按“详细描述”部分所述的方法制作印刷电极并按常规方法装配葡萄糖传感器。使用磷酸盐缓冲溶液(50mM，pH7.4)配制不同浓度(0.1mM和10mM)的葡萄糖溶液，并以其作为分析样品。使用不含葡萄糖的磷酸盐缓冲溶液作为空白对照。后在金属分散碳葡萄糖电极电位0.15mV下测定溶液中葡萄糖的浓度。所测得的电流-时间曲线(电流响应曲线)如图10所示。图10中，曲线(A)是空白对照溶液，(B)是0.1mM葡萄糖溶液，(C)是10mM葡萄糖溶液。从图10所示上午结果可以看出，本发明的金属分散碳葡萄糖电极(传感器)对葡萄糖有很快的电流响应速度(＜30秒)，并且很快达到稳态。特别是，由于本发明的金属分散碳葡萄糖电极可在约0.15mV的低电极电位下工作，所以也避免了分析物溶液中易氧化还原物质对检测的干扰和影响。

Claims

1，一种可在低电极电位下工作的氧化酶安培传感器，其基本上由以下部分组成：

(1)一个具有对电流活性物质发挥强的电催化作用并且足以消除样品中混杂的易氧化还原物质的干扰的催化系统；

(2)一个有氧化酶参与生物识别反应的生物识别系统；以及

(3)一个将生物识别反应产生的电流活性物质传递给催化系统，并将催化系统产生的电信号传递到信号接受装置的传递系统；

(4)一个将由信号识别系统获得的电信号转化成分析物浓度或含量数据的信号转化系统。

2，根据权利要求1的传感器，其中所说的催化系统由金属颗粒或粉末与适当比例的导电材料混合而成的金属分散碳。

3，根据权利要求1的传感器，其中所说的催化系统是由合金颗粒或粉末与适当比例的导电材料混合而成的合金分散碳。

4，根据权利要求1的传感器，其中所说的金属选自元素周期表的过渡元素。

5，根据权利要求1的传感器，其中所说的金属选自元素周期表第五周期过渡元素。

6，根据权利要求1的传感器，其中所说的金属选自钌、钇和铑。

7，根据权利要求1的传感器，其中所说的导电材料选自碳和石墨。

8，根据权利要求1的传感器，其中所说的低电极电位是-0.2V至0.2V。

9，根据权利要求1的传感器，所说的生物识别系统由选自下列一组中的能够催化被检测底物产生电化学活性物质的酶组成：葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、氨氧化酶、氨基酸氧化酶、乙醇氧化酶、黄嘌呤氧化酶、胆固醇氧化酶、肌酸氧化酶。

10，根据权利要求1的传感器，所说的电化学活性物质选自过氧化氢和过氧化物。

11，根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的分析物是能够在氧化酶的催化下产生电化学活性物质的化合物。

12，根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的分析物选自葡萄糖、乳酸、氨基酸、乙醇、胆固醇和肌醇。