CN108441406B - 分选富集循环肿瘤细胞及细胞团微栓子的装置和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分选富集循环肿瘤细胞及细胞团微栓子的装置和方法，包括多组内部设置有微通道腔体的分选富集装置，微通道腔体内设置有滤膜并将微通道腔体分为滤膜上微通道腔体和滤膜下微通道腔体，腔体两端设置有与导管连接的液体入口与出口；液体动力装置控制液体由入口进入微通道并沿腔道经出口流出；机械力发生装置通过传动单元驱动分选富集装置往复运动，运动方向与滤膜平面平行，同时与液体动力装置驱动的液流方向垂直。本发明通过液体动力装置与机械力发生装置控制微通道腔体内的液体波形流动状态的周期和振幅，使液体携带的大小不同的细胞或粒子由混合状态逐渐分层，使小直径细胞处于低层并靠近过滤膜，并从膜孔中漏过达到滤膜下微通道腔体中。

Description

分选富集循环肿瘤细胞及细胞团微栓子的装置和方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种分选富集循环肿瘤细胞及细胞团微栓子的装置和方法。

背景技术

肿瘤液体活检无需手术或穿刺且能反复进行，可有效延长患者生存期，是未来肿瘤防治关键之一。从实体肿瘤脱落后进入外周血的循环肿瘤细胞（Circulating tumorcell，CTC）可以单个细胞（即CTC）或与其它细胞或成分组成循环肿瘤微栓子（circulatingtumor microemboli，CTM）细胞团的形式存在于血液循环系统中(Hou, J. M.,et al.(2012).J Clin Oncol, 30(5), 525-532.)。

循环肿瘤细胞被认为是真正“完整”的肿瘤液体活检标记物（Hampton, T.(2016).JAMA,316(9),917；Killock,D.(2017).Nat Rev Clin Oncol,14(1),2；Pantel,K.,& Alix-Panabieres,C.(2012).Cancer Discov,2(11),974-975.），对早期发现肿瘤微转移和预后评估具有重要临床意义。研究表明，结直肠癌(Iinuma,H.,et al.(2011). JClin Oncol, 29(12), 1547-1555.)、乳腺癌(Ciriello,G.,et al.(2015).Cell,163(2),506-519.)、胃癌(Kruijtzer,C.M.,et al.(2003).Ann Oncol,14(2),197-204.)、胰腺癌(Yu,M.,Ting,et al. (2012).Nature,487(7408),510-513.)、卵巢癌(Pecot,C.V.,et al.(2011).Cancer Discov, 1(7),580-586.)和前列腺癌(Miyamoto, D.T.,et al.(2015).Science,349(6254),1351-1356.)等绝多数肿瘤均存在循环肿瘤细胞。

循环肿瘤微栓子（CTM）是肿瘤细胞团集体迁移行为，能抵御失巢凋亡、保持增殖能力和逃避免疫清除（(2014).Cancer Discov, 4(11),1246-1247.）。首先，CTM可经上皮细胞-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)使肿瘤细胞失去黏附更易转移，又能保持CTM细胞团内部连接抵御失巢凋亡。另外，CTM还可以包含纤维母细胞或内皮细胞，逃避NK细胞等免疫清除。更为重要的，CTM还可以在血液循环中黏附白细胞、内皮细胞、壁细胞、血小板等细胞或成分。因此，尽管CTM比CTC数量少，但其转移成瘤能力却是CTC的数十倍甚至更高，与预后的相关性也更强（Aceto,N.,et al.(2014).Cell,158(5),1110-1122.）。

绝大多数循环肿瘤细胞入血后受免疫系统攻击及血液剪切发生凋亡，仅有极少量特殊类型肿瘤细胞能在脉管中存活，并最终成为远端转移种子。通常约10⁹亿个白细胞和5×10¹²亿个红细胞中仅有数个CTC（Zieglschmid, V.,et al.(2005).Crit Rev Clin LabSci, 42(2), 155-196.）。而循环肿瘤微栓子（CTM）含量更少，通常不到CTC数量十分之一。

因血液等体液样本中环肿瘤细胞含量极为稀少，对血液样本分选富集尤为重要。因此， CTC和CTM分选富集技术一直是循环肿瘤细胞临床应用的重点和难点（Shen,Z.,etal.(2017).Chem Soc Rev,46(8),2038-2056；Micalizzi,D.S.,Maheswaran,S.,& Haber,D.A. (2017).Genes Dev,31(18),1827-1840. Gulbahce,N.,et al.(2017).Cancer Res,77(16), 4530-4541.）。

目前循环肿瘤细胞分选富集按原理可大体分为细胞表面特异抗原-抗体亲和反应和基于肿瘤细胞与血细胞物理性质差异分离技术。

免疫亲和分选富集主要根据细胞表面特异蛋白筛选循环肿瘤细胞（中国专利：201410325174.5，201410108435.8，201310547812.3，201310546026.1，200710307414.9），但因受限于CTC细胞表面分子表达和CTM细胞组成类型的影响，只能捕获到特定亚型CTC或CTM类群，而那些真正的肿瘤转移元凶则有可能脱落掉此类表面标记分子或含有相关类型细胞，成为“漏网之鱼”。例如，美国强生公司基于纳米磁粒-抗EpCAM（上皮细胞粘附因子）特异性抗体来富集上皮细胞的CellSearch分析系统是全球第一个经过FDA（2004年获批）和CFDA（2012年获批）认证的循环肿瘤细胞分析系统。一项使用CellSerach 分析系统对 836例（包括转移性肺癌、结直肠癌和前列腺癌）患者体内循环肿瘤细胞数量研究中，高达42%的患者为阴性（Coumans,F.A.,et al.(2012).Clin Cancer Res,18(20),5711-5718.）。对于CTM而言，免疫亲和分离富集的技术缺陷更为明显，因为CTM细胞团内存在的红细胞或免疫细胞等血细胞成份会在进行红细胞裂解时破坏CTM结构组成。在使用免疫细胞共抗原CD45去除其它细胞时造成CTM漏检（Carlsson,A.,et al.(2014).J Thorac Oncol,9(8),1111-1119.）。因此，基于细胞表面特异抗原-抗体亲和反应原理进行CTC和CTM分选富集，无论是基于单一或多种肿瘤细胞特异表面抗原的阳性富集还是基于免疫细胞共同抗原的阴性富集极有可能造成部分类型的CTC和CTM漏检。

物理富集技术主要根据循环肿瘤细密度（Wang,D.,et al.(2017).Zhonghua WaiKe Za Zhi（中华外科杂志）,55(10),765-769；He,W.,et al.(2008).Int J Cancer,123(8),1968-1973；Reinholz, M.M.,et al.(2005).Clin Cancer Res,11(10),3722-3732.）、大小等特征筛选（中国专利：200910137289.0，201310600744.2，201410818225.8，201280018756.8）。密度梯度离心法是目前实验室常用的一种富集肿瘤细胞的方法，该方法设备要求不高，方法较简单，但该方法缺乏特异性，易导致缺乏相应密度的肿瘤细胞丢失。另外，由于循环肿瘤细胞具有较一般血液细胞和正常组织细胞体积大且不易发生变形等形态特征。因此，可以经过滤分离(isolation by size of epithelial tumor cells，ISET)分选富集CTC和CTM（Hao, S. J., et al.(2018). Adv Drug Deliv Rev；中国专利：201410325174.5）。此方法分离的细胞形态保存完整，表面标记均无破坏，为后续分析检测提供了良好的条件。但现有许多过滤技术在CTC/CTM俘获效率和得率方面存在局限（Au,S.H.,et al.(2016).Proc Natl Acad Sci U S A, 113(18),4947-4952.）。这是因为，常规过滤中液体流动方向垂直于膜表面，小颗粒如小直径细胞等随之经透膜滤走，而大颗粒如大直径细胞等则被截留在膜上如中国专利CN 103599574）。因此常规过滤也被称为“死端过滤”。为克服常规过滤技术缺点，切向流过滤 (Tangential Flow Filtration，TFF) 或交叉流过滤（Cross Flow Filtration）被用于稀有细胞分选富集（如中国专利CN102321573B，03817779.X）。切向流过滤依靠与滤膜表面平行的液体交叉流或“切向”流运动，可保证液体和小颗粒通过膜孔同时，又可防止大颗粒在滤膜表面积结造成堵膜。

然而，受血液样本背景细胞密度过大（每毫升血包含9×10⁶亿个白细胞和5×10⁹亿个红细胞），总数量过多等因素影响，导致进行循环肿瘤细胞（包括CTC和CTM）切向流富集时需往复多次或长程流动过滤，且最终富集纯度不高，过滤时间较长等缺点，而且随着缓冲液的不断稀释，过滤分离效果越来越低。

发明内容

本发明的目的是提供一种分选富集循环肿瘤细胞及细胞团微栓子的装置和方法，从癌症患者血液、腹水等体液样本中分选富集循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，以下简称为“CTC”)及循环肿瘤微栓子（Circulating tumor microemboli，以下简称为“CTM”），利用一种可通过机械力使血液等液体在微通道腔体内与内置滤膜表面平行的方向上发生具有一定周期和振幅的波形流动的装置制备富含CTC和CTM的细胞群体，使用本发明的装置和方法获得的富含CTC和CTM的细胞群体可用于例如体外培养、细胞荧光免疫和核酸检测等等目的。

本发明所采用的技术方案为：

分选富集循环肿瘤细胞及细胞团微栓子的装置，其特征在于：

包括多组分选富集装置，分选富集装置内设置有微通道腔体，微通道腔体内设置有滤膜并将微通道腔体分为滤膜上微通道腔体和滤膜下微通道腔体；

滤膜上微通道腔体两端分别为滤膜上微通道腔体入口和滤膜上微通道腔体出口，均连接有导管；滤膜下微通道腔体两端分别为滤膜下微通道腔体入口和滤膜下微通道腔体出口，均连接有导管；

装置内设置有液体动力装置和导入速度控制单元，各个导入用导管由液体动力装置提供导入动力，并通过各自独立的导入速度控制单元控制导入速度；

滤膜上微通道腔体入口和滤膜下微通道腔体入口连接的导管分别与液体动力装置上的各自的导入速度控制单元相连；液体动力装置驱动液体由滤膜上微通道腔体入口和滤膜下微通道腔体入口进入微通道腔体并由滤膜上微通道腔体出口和滤膜下微通道腔体出口流出，液体样本在滤膜上微通道腔体内以滤膜表面切向方向流经滤膜表面；速度控制单元控制微通道腔体内液体流动速度；

分选富集装置设置于拖槽内，拖槽底部设置有固定板，固定板底部安装有传动单元和机械力发生装置；

机械力发生装置通过传动单元驱动分选富集装置发生往复运动，运动方向与滤膜表面方向平行，并与液体动力装置驱动的微通道腔体内液体液流方向垂直；

通过控制液体动力装置与机械力发生装置，使滤膜上微通道腔体内的液体呈现不同周期和振幅的波形流动状态。

微通道腔体呈S形或直线形设置。

滤膜孔径为5至12微米孔径，材质为聚对二甲苯、聚碳酸酯、硅或氧化铝。

各个导出用导管上设置有渗余液导出速度控制单元，各个滤液导管上设置有滤液导出速度控制单元。

多组分选富集装置并联设置或串联设置。

分选富集循环肿瘤细胞及细胞团微栓子的方法，其特征在于：

包括以下步骤：

第一阶段，分选富集：

i、将样本通过分选富集装置的滤膜上微通道腔体入口引入滤膜上微通道腔体；

ii、样本引入滤膜上微通道腔体的同时，缓冲液通过分选富集装置的滤膜下微通道腔体入口引入滤膜下微通道腔体；

iii、样本及缓冲液分别进入滤膜上微通道腔体和滤膜下微通道腔体后，机械力发生装置通过传动单元驱使分选富集装置发生往复运动，运动方向与滤膜表面方向平行，并与液体动力装置驱动的微通道腔体内液体液流方向垂直，通过控制液体动力装置与机械力发生装置，使滤膜上微通道腔体内的液体在与滤膜表面平行方向呈现一定周期和振幅的波形流动状态；

iv、样本引入滤膜上微通道腔体后，经受滤膜上方的相对切向流动经滤膜上微通道腔体出口导出；

v、样本经受滤膜上方进行切向流动时，样本中循环肿瘤细胞、及循环肿瘤细胞与少量部分其它细胞或成份形成的细胞团微栓子经滤膜上微通道腔体出口导出；

vi、样本经受滤膜上方进行切向流动时，样本中大多数血细胞及其它成分穿过滤膜进入滤膜下微通道腔体，与缓冲液混合；

vii、样本经在滤膜上方经受切向流动由出口导出微通道腔体的同时，缓冲液混合了样本中穿过滤膜的细胞及其它成分形成混合液导出；

第二阶段，收集富含循环肿瘤细胞和细胞团微栓子的细胞群体：

viii、缓冲液通过分选富集装置的滤膜上微通道腔体入口引入滤膜上微通道腔体；

ix、同时，缓冲液以不小于步骤viii的速度通过分选富集装置的滤膜下微通道腔体入口引入滤膜下微通道腔体；

x、机械力发生装置处于关闭，分选富集装置微通道腔体内的滤膜处于静置状态；

xi、富含循环肿瘤细胞和细胞团微栓子的细胞群体随缓冲液在滤膜上方经滤膜上微通道腔体出口导出。

样本来自受试肿瘤患者的血液、腹水或腹腔清洗液；

血液样本体积不小于0.2毫升；

腹水或腹腔清洗液样本体积不小于5毫升。

样本包含循环肿瘤细胞、循环肿瘤细胞与血细胞或其它血液成份形成的细胞团微栓子、以及血细胞和其它血液成分；

循环肿瘤细胞为上皮型细胞或间充质型细胞，或同是上皮型和间充质型细胞；

样本中的血细胞或其它血液成份包括免疫细胞、红细胞、血浆和血小板中的一种或多种；

缓冲液为PBS液或生理盐水。

本发明具有以下优点：

本发明提及的分选富集循环肿瘤细胞及细胞团微栓子的装置和方法，涉及了一种可通过机械力使血液等液体在微通道腔体内与内置滤膜表面平行的方向上发生具有一定周期和振幅的波形流动的装置及利用一种可通过机械力使血液等液体在微通道腔体内与内置滤膜表面平行的方向上发生具有一定周期和振幅的波形流动的装置进行血液等体液样本中循环肿瘤细胞及循环肿瘤微栓子分选富集方法，实现了血液等体液中的循环肿瘤细胞及循环肿瘤微栓子高效率、高纯度的分选富集。本发明提及的分选富集循环肿瘤细胞及细胞团微栓子的装置和方法不仅能有效避免基于细胞表面特异抗原-抗体亲和反应的CTC及CTM分选富集中因肿瘤细胞异质性（阳性富集法）以及去除CD45⁺免疫细胞（阴性富集法）造成的漏检，同时还极好的改善了垂直过滤中的都堵膜及细胞受压变形渗漏，以及常规切向流分离流程长、效率低、背景红细胞去除率差等不足。因此，本发明提及的分选富集循环肿瘤细胞及细胞团微栓子的装置和方法不仅能够用于循环肿瘤细胞及循环肿瘤微栓子数量的评价，而且能够用于循环肿瘤细胞基因分析和循环肿瘤微栓子中细胞构成类型分析。能够有效地用于转移性复发的早期诊断、治疗效果的监测、体液活检等。

附图说明

图 1描绘了本发明的装置用于分选血液等体液样本中分选富集循环肿瘤细胞和循环肿瘤微栓子的细胞群体的第一种实施方案：4个血液等体液样本经导管进入固定于传动单元上的4个分选富集装置分别用于进行独立分选富集循环肿瘤细胞和循环肿瘤微栓子的细胞群体。

图2 是图 1中描绘的装置的俯视图。

图3描绘了本发明提供的装置用于分选血液等体液样本中分选富集循环肿瘤细胞和循环肿瘤微栓子的细胞群体的第二种实施方案：1个血液等体液样本经4根导管平行导入固定于传动单元上的4个平行分布的分选富集装置共同分选富集循环肿瘤细胞和循环肿瘤微栓子的细胞群体。

图4描绘了本发明提供的装置用于分选血液等体液样本中分选富集循环肿瘤细胞和循环肿瘤微栓子的细胞群体的第三种实施方案：1个血液等体液样本经导管依次导入固定于传动单元上的4个串连分布分选富集装置共同分选富集循环肿瘤细胞和循环肿瘤微栓子的细胞群体。

图5描绘了用于本发明提及的装置用于分选富集血液等体液样本中循环肿瘤细胞和循环肿瘤微栓子的细胞群体的开发实施例中的绿色荧光示踪剂标记胃癌SGC7901单个细胞及细胞团形态及尺寸的典型实例。图a-d为绿色荧光示踪剂标记胃癌SGC7901单个细胞形态。其中，图a-d为绿色荧光示踪剂标记胃癌SGC7901单个细胞形态。图e为由2个细胞组成的细胞团。图f为由3个细胞组成的细胞团。图g为由5个细胞组成的细胞团。图h为由10个以上细胞组成的细胞团。

图6描绘了用于本发明提及的装置用于分选富集血液等体液样本中循环肿瘤细胞和循环肿瘤微栓子的细胞群体的开发实施例中的分选富集正常人上肢浅静脉血与绿色荧光示踪剂标记胃癌SGC7901单个细胞及细胞团混合液对分选富集过程中血液样本稀释度、血液样本进样速度、PBS缓冲液进样速度与血液样本进样速度的相对大小、机械力发生装置通过传动单元使分选富集装置的微通道腔体内置过滤膜与细胞液的相对切向往复运动的频率、一定体积血液样本中肿瘤细胞数量对分选富集效果的影响。进而对除胃癌SGC7901细胞以外的乳腺癌细胞MDA-MB-231和SKBR-3、前列腺细胞PC3-9、肝癌细胞HepG2、卵巢癌细胞Hela、肾癌细胞Kaki2和结肠癌细胞HT29等进行分选富集效率评价。

图7描绘了用于本发明提及的装置用于分选富集血液等体液样本中循环肿瘤细胞和循环肿瘤微栓子的细胞群体的开发实施例中的分选富集正常人上肢浅静脉血与绿色荧光示踪剂标记胃癌SGC7901单个细胞及细胞团混合液的结果。图a-c为混合液经分选富集装置在机械力发生装置连接转动单元以振幅为5毫米，频率为5-300次/分钟情况下进行的绿色荧光示踪剂标记胃癌SGC7901单个细胞及细胞团分选富集，其中附图a为分选富集前的荧光标记肿瘤细胞与背景血液细胞的含量比。附图b为第一次分选后荧光标记肿瘤细胞与背景血液细胞的含量比。附图c为第四次分选富集后荧光标记肿瘤细胞与背景血液细胞的含量比。图d-f为混合液经分选富集装置在机械力发生装置未开启情况下进行的绿色荧光示踪剂标记胃癌SGC7901单个细胞及细胞团分选富集，其中附图d为分选富集前的荧光标记肿瘤细胞与背景血液细胞的含量比。附图e为第一次分选后荧光标记肿瘤细胞与背景血液细胞的含量比。附图f为第四次分选富集后荧光标记肿瘤细胞与背景血液细胞的含量比。

图8描绘了基于本发明提及的装置对源自临床一名胃癌患者4毫升外周血内循环肿瘤细胞及微栓子分选富集后进行免疫荧光鉴定的典型实例。

图9描绘了基于本发明提及的装置对源自临床一名结肠癌患者4毫升外周血内循环肿瘤细胞及微栓子分选富集后进行免疫荧光鉴定的典型实例。

图10描绘了基于本发明提及的装置对源自临床一名肾癌患者4毫升外周血内循环肿瘤细胞及微栓子分选富集后进行免疫荧光鉴定的典型实例。

图11描绘了基于本发明提及的装置对源自一名健康正常人4毫升外周血内循环肿瘤细胞及微栓子分选富集后进行免疫荧光鉴定的典型实例。

图12描绘了微通道腔体（俯视）内液体流动示意图，机械力发生装置通过传动单元驱动分选富集装置发生与液体动力装置驱动的液流方向垂直的切向往复运动，并与动力装置驱动液体在滤膜上微通道腔体内以滤膜表面切向方向流动共同使得液体在滤膜上微通道腔体内以波形流动方式在滤膜表面流动。

图13描绘了通过控制液体动力装置和机械力发生装置可控制液体在滤膜表面的波形流动方式特征，由左至右分别为：仅有动力装置驱动液体流动状态，液体动力装置驱动液体流动结合机械力发生装置驱动的低频率的切向往复运动的液体流动状态，液体动力装置驱动液体流动结合机械力发生装置驱动的高频率的切向往复运动的液体流动状态，仅有机械力发生装置驱动的高频率切向往复运动的液体流动的状态。

图14描绘了通过控制液体在滤膜表面的波形流动，可使得随液体流动的大小不同的细胞或粒子开始逐渐分层，大直径细胞处于最上层，中间直径大小细胞处于中间层，小直径细胞处于低层并靠近过滤膜，并从膜孔中漏过达到滤膜下微通道腔体中。

图中，1-液体动力装置，2-导入速度控制单元，3-渗余液出口，4-滤液出口，5-滤膜上微通道腔体，6-滤膜，7-滤膜下微通道腔体，8-分选富集装置，9-拖槽，10-样本入口，11-缓冲液入口，12-固定板，13-传动单元，14-渗余液导出速度控制单元，15-滤液导出速度控制单元，16-机械力发生装置。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

本发明涉及一种通过机械力使使血液等液体在微通道腔体内与内置滤膜表面平行的方向上发生具有一定周期和振幅的波形流动的装置从癌症患者液体样本中富集循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，以下简称为“CTC”)及细胞团微栓子（Circulatingtumor microemboli，以下简称为“CTM”）的装置。

提供下列实施例仅仅作为本发明各个方面的例证且不应被看作是以任何方式限制本发明。在本文中给出的实施例中，样品包括从肿瘤患者的上肢浅静脉采集到ACD抗凝管的血液样本，以及从正常人上肢浅静脉采集到ACD抗凝管中的血液样本与标记有荧光示踪剂的体外培养肿瘤细胞及细胞团的混合液。为避免针头穿刺时混入皮肤上皮细胞，上肢浅静脉采血时弃去前1毫升血液，采血后立即上下轻柔颠倒混匀约6至8次。将样本室温放置（约25℃），宜24小时内进行细胞富集步骤，最长不超过48小时。

本发明涉及的分选富集循环肿瘤细胞及细胞团微栓子的装置，包括多组分选富集装置8，分选富集装置8内设置有微通道腔体。微通道腔体内设置有滤膜6并将微通道腔体分为滤膜上微通道腔体5和滤膜下微通道腔体7。

滤膜孔径为5至12微米孔径大小滤膜，择优为5-8微米，最佳为8um；滤膜材质可为聚对二甲苯、聚碳酸酯等聚合物、硅、氧化铝金属等，首选为商业化生产的聚碳酸酯聚合物膜；滤膜孔洞分布可为无规则排列、规则阵列等，首选为规则阵列排布微孔滤膜。

微通道腔体呈S形设置，滤膜上微通道腔体5横截面高100微米到500微米，横截面宽3毫米到5毫米；滤膜上微通道腔体5和滤膜下微通道腔体7横截面和体积相同，且内置的滤膜6为上下微通道腔体的对称面。

滤膜上微通道腔体5两端分别为滤膜上微通道腔体入口10和滤膜上微通道腔体出口3，均连接有导管；滤膜下微通道腔体7两端分别为滤膜下微通道腔体入口11和滤膜下微通道腔体出口4，均连接有导管。微通道腔体上部分两端入口和出口方向与滤膜6平行，且位置靠近滤膜；微通道腔体下部分两端入口和出口方向与滤膜平行，且位置靠近微通道腔体底部。

装置内设置有液体动力装置1和导入速度控制单元2，各个导入用导管由液体动力装置1提供导入动力，并通过各自独立的导入速度控制单元2控制导入速度。各个导出用导管上设置有渗余液导出速度控制单元14，各个滤液导管上设置有滤液导出速度控制单元15。

分选富集装置8设置于拖槽9内，拖槽9底部设置有固定板12，固定板12底部安装有传动单元13和机械力发生装置16；机械力发生装置16通过传动单元13驱动分选富集装置8发生切向往复运动。机械力发生装置16可以是步进电机，也可以是直流电机，交流电机等可产生旋转运动的机械运动发生装置，优选步进电机。传动单元13可以是偏心力旋转装置，亦可是曲柄连杆装置，以及其它可以将机械力发生装置16产生的旋转运动转换为往复运动的装置，优选偏心力旋转装置。传动单元13可以用于同时并行固定1至4个分选富集装置，优选固定4个分选富集装置。

多组分选富集装置8并联设置或串联设置。并联设置时，1个样本经多根导管平行导入并列分布的分选富集装置8共同分选富集循环肿瘤细胞和循环肿瘤微栓子的细胞群体。串联设置时，1个样本经导管依次导入多个串连分布分选富集装置8共同分选富集循环肿瘤细胞和循环肿瘤微栓子的细胞群体。

基于上述设备进行分选富集循环肿瘤细胞及细胞团微栓子的方法，包括以下步骤：

第一阶段，分选富集：

i、将样本通过分选富集装置8的滤膜上微通道腔体入口10引入滤膜上微通道腔体5；

ii、样本引入滤膜上微通道腔体5的同时，缓冲液通过分选富集装置8的滤膜下微通道腔体入口11引入滤膜下微通道腔体7；

iii、样本及缓冲液分别进入滤膜上微通道腔体5和滤膜下微通道腔体7后，机械力发生装置16通过传动单元13驱使分选富集装置8上的微通道腔体按内置的滤膜6切向方向产生振幅动为5mm，周期为5-300次/分钟往复运动；

iv、样本引入滤膜上微通道腔体5后，经受滤膜6上方的相对切向流动经滤膜上微通道腔体出口3导出；

v、样本经受滤膜6上方进行切向流动时，样本中循环肿瘤细胞、及循环肿瘤细胞与其它细胞或成份形成的细胞团微栓子经滤膜上微通道腔体出口3导出；

vi、样本经受滤膜6上方进行切向流动时，样本中血细胞及其它成分穿过滤膜6进入滤膜下微通道腔体7，与缓冲液混合；

vii、样本经在滤膜6上方经受切向流动由出口导出微通道腔体的同时，缓冲液混合了样本中穿过滤膜6的细胞及其它成分形成混合液导出；

第二阶段，收集富含循环肿瘤细胞和细胞团微栓子的细胞群体：

viii、缓冲液通过分选富集装置8的滤膜上微通道腔体入口10引入滤膜上微通道腔体5；

ix、同时，缓冲液以不小于步骤viii的速度通过分选富集装置8的滤膜下微通道腔体入口11引入滤膜下微通道腔体7；

x、机械力发生装置16处于关闭，分选富集装置8微通道腔体内的滤膜6处于静置状态；

xi、富含循环肿瘤细胞和细胞团微栓子的细胞群体随缓冲液在滤膜6上方经滤膜上微通道腔体出口3导出。

对同一样本可以进一步包括依次重复步骤i至xi至少两次以形成循环肿瘤细胞及循环肿瘤细胞团微栓子的富集液。对同一样本还可以包括同时使用两个以上分选富集装置8依次进行步骤i至xi一次或以上操作，以形成循环肿瘤细胞及循环肿瘤细胞团微栓子的富集液。

样本来自受试肿瘤患者的血液、腹水或腹腔清洗液。血液样本体积不小于0.2毫升，血液样本可以是1至10倍及以上倍数稀释，最佳为4倍稀释。腹水或腹腔清洗液样本体积不小于5毫升，腹水或腹腔清洗液可以不做稀释。

样本包含循环肿瘤细胞、循环肿瘤细胞与血细胞或其它血液成份形成的细胞团微栓子、以及血细胞和其它血液成分；循环肿瘤细胞为上皮型细胞或间充质型细胞，或同是上皮型和间充质型细胞；样本中的血细胞或其它血液成份包括免疫细胞、红细胞、血浆和血小板中的一种或多种；免疫细胞为CD45⁺细胞；缓冲液为PBS液或生理盐水，可选用缓冲液稀释样本，用于引入富集装置。

导入速度控制单元2控制在每分钟0.1毫升至4毫升，最佳为每分钟1毫升；并且渗余液导出速度控制单元14和滤液导出速度控制单元15保持相同速度。第一阶段，分选富集时，滤液导出速度控制单元15保持0到与导入速度控制单元2相同；第二阶段，收集富含CTC和CTM的细胞群体时，渗余液导出速度控制单元14保持0到导入速度控制单元2相同。

实施例1：通过机械力使微通道腔体内置滤膜与细胞液发生相对切向往复运动的装置，用于分选富集血液样本中循环肿瘤细胞和循环肿瘤微栓子的细胞群体的开发。

肿瘤细胞培养：乳腺癌细胞MDA-MB-231和SKBR-3、前列腺细胞PC3-9、胃癌细胞SGC7901、肝癌细胞HepG2、卵巢癌细胞Hela、肾癌细胞Kaki2和结肠癌细胞HT29等在包含有15％胎牛血的RPMI-1640细胞培养基的培养瓶中于含5% 二氧化碳（CO2）的37℃细胞培养箱中培养。待细胞接近长满培养瓶低时用PBS缓冲液（磷酸二氢钾(KH2PO4)0.27g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.42g，氯化钠(NaCl)8g，氯化钾(KCl)0.2g，加去离子水至约1升，pH至7.4）将细胞洗3次，再加入0.25%胰酶，覆盖细胞约30s后吸去胰酶，37℃放置约2至约5分钟，加入PBS缓冲液后用吸管进行不同程度的吹打，显微镜下可观察细胞消化适度，直至形成单个细胞和多细胞团。

肿瘤细胞荧光示踪标记：离心收集细胞，并吸除上清。用放置室温平衡的绿色荧光活细胞示踪剂Cell Tracker Green(CMFDA，Thermo Fisher Scientific，C2925)工作液轻柔地重悬细胞。于5% 二氧化碳（CO2）的37摄氏度培养箱中孵育30分钟。于800转每分钟离心5分钟，除去工作液。换用新鲜培养基继续培养30分钟，清洗细胞。

荧光细胞计数：收获后的细胞通过台盘蓝染料排除试验评价细胞悬液的细胞存活力超过 90％时才使用所述细胞悬液。加入PBS缓冲液将细胞或细胞团稀释至适当浓度后利用血细胞计数板在奥林巴斯倒置荧光显微镜（IX73）下于488nm波长激光下进行绿色荧光细胞和细胞团计数计。

正常人血液样本与标记有荧光示踪剂的肿瘤细胞及细胞团混合液样本（以下简称混合液样本）制备：将4毫升正常人上肢浅静脉血液与不同数量（50个、500个细胞、5000个细胞）的绿色荧光细胞或细胞团混合液与PBS缓冲液进行0、2、4和8倍稀释制备待分选富集样本。

混合液样本中荧光标记肿瘤细胞及细胞团的分选富集：按附图1所示实施方案采取单个分选富集装置进行单样本操作。首先，分选富集阶段，待分选富集的混合液样本转移至装置中用于放置样本的容器中。混合液样本进入富集装置入口的速度控制在约0.1、0.5、1.0、2.0和4.0毫升每分钟；并且控制缓冲液进入富集装置入口的速度与混合液样本进入富集装置入口的速度保持相同或略小。同时，富集了荧光标记肿瘤细胞及细胞团导出富集装置出口的速度控制在约0、0.4、0.9、1.9和3.9毫升每分钟。混合了样本中穿过滤膜的细胞及其它成分的缓冲液导出富集装置出口完全开放。与此同时，机械力发生装置通过传动单元使富集装置上的微通道腔体按内置的滤膜切向方向产生振幅为5毫米，周期为5、50、100、200和300次/分钟往复运动。富集装置具有的微通道腔体内置滤膜孔径为8微米的聚碳酸酯聚合物膜。收集富含CTC和CTM的细胞群阶段，将PBS缓冲液以约1毫升每分钟经样本入口进入和缓冲液入口同时进入富集装置，持续1分钟。荧光标记肿瘤细胞和细胞团富集液出口处于完全打开状态，且同时保持混合了样本中穿过滤膜的细胞及其它成分的缓冲液导出富集装置出口完全关闭。确保微通道腔体内所有液体均由富集了循环肿瘤细胞和循环肿瘤微栓子的细胞群体导出富集装置出口导出富集装置。荧光标记肿瘤细胞和细胞团富集液在奥林巴斯倒置荧光显微镜下于488nm波长激发光下及明场下进行绿色荧光细胞和细胞团计数计及背景血液细胞浓度观察。

资料显示，人血液中红细胞占到血细胞总体的绝大多数，是免疫细胞的1000倍以上，而红细胞占平均直径约为7.2微米（7至8.5微米），完全可以通过本专利涉及的过滤膜。人血液中诸多类型免疫细胞中，中性粒细胞和淋巴细胞数量占到血细胞数量的全部，其它类型细胞数量极其微量。尽管部分细胞中性粒细胞（直径约10至12微米）和淋巴细胞（大淋巴细胞直径约11至18微米）、中淋巴细胞直径约7至11微米以及小淋巴细胞直径约4至7微米，其中小淋巴细胞和中淋巴细胞占多数）直径大于8微米，但受免疫细胞易变形性特征影响，绝大多数依然可穿过8微米滤膜。相关资料（CN201310600775等等）显示，本专利实施例中所使用肿瘤细胞平均直径均达到10微米以，略大于本专利中所涉及的过滤膜孔径5-8微米，但不排除个别肿瘤类型存在少量的尺寸小于8微米的细胞个体。例如，本实施例中，制备的绿色荧光示踪剂标记胃癌SGC7901单个细胞及细胞团形态及尺寸的典型实例如附图5所示。其中图a-d为绿色荧光示踪剂标记胃癌SGC7901单个细胞形态。其中，附图a-d为绿色荧光示踪剂标记胃癌SGC7901单个细胞形态。附图e为由2个细胞组成的细胞团。附图f为由3个细胞组成的细胞团。附图g为由5个细胞组成的细胞团。附图h为由10个以上细胞组成的细胞团。说明可通过本实施的方案可制备得到不同形态和细胞数量的模拟肿瘤细胞微栓子用于本专利所述装置及方法开发。

附图6展示了本实施中对一种通过机械力使微通道腔体内置滤膜与细胞液发生相对切向往复运动的装置用于分选富集血液样本中循环肿瘤细胞和循环肿瘤微栓子的细胞群体的开发中对混合进入4毫升正常人上肢浅静脉血中的绿色荧光示踪剂标记胃癌SGC7901肿瘤细胞及细胞团分选富集的参数优化。附图a展示了本实施案例中利用PBS缓冲液对混合液进行不同程度的稀释后对荧光肿瘤细胞的回收率和背景血细胞的去除率的影响。结果表明适度程度的血液样本稀释，如倍PBS稀释时能达到较理想的回收率和去除率，但随着稀释倍数的上升，总样体积也增大，实施时间也随之增加。结合考虑，本实施例优选对血液样本进行约3至约5倍PBS稀释，优选4倍PBS稀释。附图b展示了本实施案中，PBS缓冲液进样速度相对血液样本进样速度大小对荧光肿瘤细胞的回收率和背景血细胞的去除率的影响。结果表明当血液样本进样速度为1毫升时，PBS缓冲液进校速度为0.9毫升，即较血液样本略小时可同时实现较的荧光肿瘤细胞回收率和背景血细胞去除率。附图c展示了本实施案例中血液样本进样速度对荧光肿瘤细胞的回收率和背景血细胞的去除率的影响。结果表明血液样本进样速度对背景血细胞去除率影响较小，但自0.1毫升增加至4毫升每分钟过程中，荧光肿瘤细胞的回收率呈现出明显的减少趋势。当速度达到1.0毫升每分钟时，可保持较好荧光肿瘤细胞的回收率和背景血细胞的去除率。附图d展示了本实施案例中机械发生装置通过传动单元产生的分选富集装置的微通道腔本发生内置过滤膜与细胞液切向往复运动的强弱，即频率对分选富集的影响。结果表明，适当频率的相对切向往复运动能极大的增加荧光肿瘤细胞的回收率和降低背景血细胞的干扰。附图e展示了一定血液样本中荧光肿瘤细胞绝对含量对分选富集效果的影响。结果表明，4毫升血液样本中肿瘤细胞数量自几十个到几千个的回收率相关不大，甚至表现出较少数量的肿瘤细胞的回收略高。附图f展示了本实施中对一种通过机械力使微通道腔体内置滤膜与细胞液发生相对切向往复运动的装置进行7类肿瘤8种细胞系进行的分选富集效率结果。结果表明，本实施例中涉及的乳腺癌细胞MDA-MB-231和SKBR-3、前列腺细胞PC3-9、胃癌细胞SGC7901、肝癌细胞HepG2、卵巢癌细胞Hela、肾癌细胞Kaki2和结肠癌细胞HT29的分选富集回收率均达到93%以上，背景血细胞清除率达到95%以上。

为进一步验证本专利所述的一种通过机械力使微通道腔体内置滤膜与细胞液发生相对切向往复运动的装置用于分选富集血液样本中循环肿瘤细胞和循环肿瘤微栓子的细胞群体的特征，表1中展示了本实施例中所用500个细胞的荧光标记的乳腺癌细胞MDA-MB-231和SKBR-3、前列腺细胞PC3-9、胃癌细胞SGC7901、肝癌细胞HepG2、卵巢癌细胞Hela、肾癌细胞Kaki2和结肠癌细胞HT29肿瘤细胞和细胞团分别与4毫升正常人上肢浅静脉血进行机械力装置未经开启和进行频率为200次每分钟的过滤膜相对切向往复运动条件进行分选富集，每个条件下进行三次重复，以优化分选富集各个参数。结果表明，当机械力开启时，即分选富集装置的微通道腔体内置过滤膜进行细胞液相对切向往复运动条件下比静置（常规切向流过滤）的分选富集效果具有明显优势。荧光肿瘤细胞回收率和背景免疫细胞的清除率都有所提高。

附图7描绘了用于本发明提及的一种可通过机械力使微通道腔体内置滤膜与细胞液发生相对切向往复运动的装置用于分选富集血液等体液样本中循环肿瘤细胞和循环肿瘤微栓子的细胞群体的开发实施例中的分选富集经12毫升的PBS缓冲液（（磷酸二氢钾(KH2PO4)0.27g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.42g，氯化钠(NaCl)8g，氯化钾(KCl)0.2g，加去离子水至约1升，pH至7.4）4倍稀释后的4毫升正常人上肢浅静脉血并混入约500个绿色荧光示踪剂标记胃癌SGC7901单个细胞及细胞团混合液的分选富集结果。图a-c为混合液经分选富集装置在机械力发生装置转动单元以振幅为5毫米，频率为200次每分钟情况下，样本进校速度为1毫升每分钟，PBS缓冲液0.9毫升每分钟速度进行的绿色荧光示踪剂标记胃癌SGC7901单个细胞及细胞团分选富集，其中附图a为混合液分选富集前绿色荧光示踪剂标记胃癌SGC7901单个细胞及细胞团与血液细胞的含量比例，未经分选富集前的混合液中荧光标记肿瘤细胞及细胞微团所占的总细胞浓度比例极低，仅为血细胞的百万分之一。附图b为第一次分选后荧光标记肿瘤细胞与背景血液细胞的含量比。分选富集时，富集液出口完全关闭情况下，经一次分选富集后，富集液当中的荧光标记肿瘤细胞及细胞团数量比例明显上升，背景血细胞浓度极大的减少，表明本发明装置及方法的分选富集具有效好的效果。附图c为第四次分选富集后荧光标记肿瘤细胞与背景血液细胞的含量比。经四次分选富集后，富集液当中的荧光标记胃癌SGC7901肿瘤细胞及细胞团含量进一步提高，背景血细胞浓度降低，即肿瘤细胞得到了有效的富集。图6d-f为混合液经分选富集装置在机械力发生装置未开启情况下进行的绿色荧光示踪剂标记胃癌SGC7901单个细胞及细胞团分选富集，其中附图d为分选富集前的荧光标记肿瘤细胞与背景血液细胞的含量比。附图e为第一次分选后荧光标记肿瘤细胞与背景血液细胞的含量比。附图f为第四次分选富集后荧光标记肿瘤细胞与背景血液细胞的含量比。图d-f结果可知通过使微通道腔内置过滤膜发生与细胞液流动方向形成切向往复运动能有效提高分选富集混合液当中的荧光标记胃癌SGC7901肿瘤细胞及细胞团的回收率并降低血细胞背景。

实施例2：通过机械力使微通道腔体内置滤膜与细胞液发生相对切向往复运动的装置，用于分选富集临床肿瘤患者血液样本中循环肿瘤细胞和循环肿瘤微栓子的细胞群体。

外周血采集：临床肿瘤患者空腹1天采集，健康志愿者空腹1天采集；经上肢浅静脉穿刺采集血液样本后收至ACD抗凝管内；为避免针头穿刺时混入皮肤上皮细胞，采血时弃去前1毫升血液，采血后立即上下轻柔颠倒混匀约6至8次。将样本室温放置（约25℃），宜24小时内进行细胞富集步骤，最长不超过48小时。

血液样本前处理：根据样本登记表的信息对血液样本进行确认，并确认血液样本是否在内、有无血液凝块、有无溶血现象。将4毫升合格血液样本转移至样本容器内，12毫升PBS缓冲液分3次清洗样本ACD抗凝管内，轻揉颠倒清洗管内壁，并依次转移至样本容器中混合均匀，共得16毫升经PBS稀释4倍稀释血液样本。

临床肿瘤患者血液样本中循环肿瘤细胞及肿瘤微栓子的分选富集：按附图1所示实施方案采取单个分选富集装置进行单样本操作。首先，分选富集阶段，待分选富集的临床肿瘤患者血液样本稀释液转移至装置中用于放置样本的容器中。临床肿瘤患者血液稀释液进入富集装置入口的速度控制在约1.0毫升每分钟；并且控制缓冲液进入富集装置入口的速度与混合液样本进入富集装置入口的速度约0.9毫升每分钟。同时，富集循环肿瘤细胞及肿瘤微栓子导出富集装置出口完全关闭。混合了样本中穿过滤膜的细胞及其它成分的缓冲液导出富集装置出口完全开放。与此同时，机械力发生装置通过传动单元使富集装置上的微通道腔体按内置的滤膜切向方向产生振幅为5毫米，周期为200次每分钟往复运动。富集装置具有的微通道腔体内置滤膜孔径为8微米的聚碳酸酯聚合物膜。收集富含CTC和CTM的细胞群阶段，将PBS缓冲液以约1毫升每分钟经样本入口进入富集装置，PBS缓冲液以约2毫升每分钟经缓冲液入口进入富集装置，持续1分钟。循环肿瘤细胞和细胞微栓子富集液出口处于完全打开状态，且同时保持混合了样本中穿过滤膜的细胞及其它成分的缓冲液导出富集装置出口完全关闭。确保微通道腔体内所有液体均由富集了循环肿瘤细胞和循环肿瘤微栓子的细胞群体导出富集装置出口导出富集装置。

富集液细胞群中循环肿瘤细胞和循环肿瘤微栓子分子鉴定：转移富集液至离心管中，1200转每分钟，常温离心5分钟；弃上清后将全部约50微升细胞沉淀均匀涂片于载玻片上；30摄氏度干燥后用3%多聚甲醛固定10分钟；经PBS浸泡洗涤3分钟，重复洗涤一次；加入含0.4% Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）常温放置10分钟；经PBS浸泡洗涤3分钟，重复洗涤一次；以5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS液在37°C孵育30分钟；滴加1∶200稀释的绿色荧光染料FITC（异硫氰酸荧光素）标记的人细胞角蛋白Cytokeratin（CK）8/18/19、人上皮细胞粘附分子（Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM），人类波形蛋白（Vimentin）及Twist蛋白抗体，红色荧光染料PE标记的人白细胞共同抗原CD45（cluster of differentiation45，CD45）混合共50微升，于湿盒内，4摄氏度避光孵育过渡，PBS浸泡洗涤5min×2次；滴加1微克每毫升的二氨基苯茚酮(4’,6’-diamidino-2-phenylindole, DAPI)10微升，室温孵育5分钟，PBS洗涤2分钟；滴加含溴化乙碇（ethidium bromide, EB）的50%甘油封片。荧光显微镜下观察。以正常单核细胞和 Hep G2 细胞各涂片1张分别作为阴、阳性对照，荧光抗体染色过程同上。在波长为488nm的激发光源照射下，FITC发绿色荧光；PE在波长为531nm的激发光源照射下发红色荧光，DAPI在波长为365nm的激发光源照射下发蓝色荧光。先在365nm的激发光源下观察DAPI的发光情况，确定载玻片上有细胞存在。然后换用激发波长为488nm的滤光片观察。其中，肿瘤细胞为有核的绿色荧光细胞，阴性细胞即血细胞为有核或无核的红色荧光细胞。

结果判读：图8描绘了基于本发明提及的一种可通过机械力使微通道腔体内置滤膜与细胞液发生相对切向往复运动的装置对源自临床的001号胃癌患者4毫升外周血内循环肿瘤细胞及微栓子分选富集后进行免疫荧光鉴定的典型实例。其中检测出包括红色圆圈内的肿瘤细胞（EpCAM/ck8/ ck18/ck19/vimentin/Twist-FITC）与免疫细胞（CD45-PE）组成循环肿瘤微栓子共10个，白色圆内由多个肿瘤细胞构成的循环肿瘤微栓子1个，以及白色方圈内的单个循环肿瘤细胞10个。图9描绘了基于本发明提及的一种可通过机械力使微通道腔体内置滤膜与细胞液发生相对切向往复运动的装置对源自临床的002号胃癌患者4毫升外周血内循环肿瘤细胞及微栓子分选富集后进行免疫荧光鉴定的典型实例。其中检测出包括红色圆圈内的肿瘤细胞（EpCAM/ck8/ ck18/ck19/vimentin/Twist-FITC）与免疫细胞（CD45-PE）组成循环肿瘤微栓子共3个，白色圆内由多个肿瘤细胞构成的循环肿瘤微栓子1个，以及白色方圈内的单个循环肿瘤细胞4个。图10 描绘了基于本发明提及的一种可通过机械力使微通道腔体内置滤膜与细胞液发生相对切向往复运动的装置对源自003号临床胃癌患者4毫升外周血内循环肿瘤细胞及微栓子分选富集后进行免疫荧光鉴定的典型实例。其中检测出包括红色圆圈内的肿瘤细胞（EpCAM/ck8/ ck18/ck19/vimentin/Twist-FITC）与免疫细胞（CD45-PE）组成循环肿瘤微栓子共4个，白色圆内由多个肿瘤细胞构成的循环肿瘤微栓子6个，以及白色方圈内的单个循环肿瘤细胞23个。图11描绘了基于本发明提及的一种可通过机械力使微通道腔体内置滤膜与细胞液发生相对切向往复运动的装置对源自一名健康正常人4毫升外周血内循环肿瘤细胞及微栓子分选富集后进行免疫荧光鉴定的典型实例。结果表明，正常血液当中无肿瘤细胞（EpCAM/ck8/ ck18/ck19/vimentin/Twist-FITC）阳性细胞存在。

本发明的提及的一种可通过机械力使微通道腔体内置滤膜与细胞液发生相对切向往复运动的装置及利用一种可通过机械力使微通道腔体内置滤膜与细胞液发生相对切向往复运动的装置进行血液等体液样本中循环肿瘤细胞及循环肿瘤微栓子分选富集方法，实现了血液等体液中的 循环肿瘤细胞及循环肿瘤微栓子高效率、高纯度的分离富集。不仅能够用于循环肿瘤细胞及循环肿瘤微栓子数量的评价，而且能够用于循环肿瘤细胞基因分析和循环肿瘤微栓子中细胞构成类型分析。能够有效地用于转移性复发的早期诊断、治疗效果的监测、体液活检 (Liquid biopsy) 等。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

Claims (8)

1.分选富集循环肿瘤细胞及细胞团微栓子的装置，其特征在于：

包括多组分选富集装置（8），分选富集装置（8）内设置有微通道腔体，微通道腔体内设置有滤膜（6）并将微通道腔体分为滤膜上微通道腔体（5）和滤膜下微通道腔体（7）；

滤膜上微通道腔体（5）两端分别为滤膜上微通道腔体入口（10）和滤膜上 微通道腔体出口（3），均连接有导管；滤膜下微通道腔体（7）两端分别为滤膜 下微通道腔体入口（11）和滤膜下微通道腔体出口（4），均连接有导管；将样 本通过滤膜上微通道腔体入口（10）引入滤膜上微通道腔体（5），将缓冲液通 过滤膜下微通道腔体入口（11）引入滤膜下微通道腔体（7），样本经受滤膜（6） 上方进行切向流动时，样本中循环肿瘤细胞、及循环肿瘤细胞与少量部分其它 细胞或成份形成的细胞团微栓子经滤膜上微通道腔体出口（3）导出，样本中大多数血细胞及其它成分穿过滤膜（6）进入滤膜下微通道腔体（7）与缓冲液混 合并经滤膜下微通道腔体出口（4）导出；

装置内设置有液体动力装置（1）和导入速度控制单元（2），各个导入用导 管由液体动力装置（1）提供导入动力，并通过各自独立的导入速度控制单元（2） 控制导入速度；

滤膜上微通道腔体入口（10）和滤膜下微通道腔体入口（11）连接的导管 分别与液体动力装置（1）上的各自的导入速度控制单元（2）相连；液体动力 装置（1）驱动液体由滤膜上微通道腔体入口（10）和滤膜下微通道腔体入口（11） 进入微通道腔体并由滤膜上微通道腔体出口（3）和滤膜下微通道腔体出口（4） 流出，液体样本在滤膜上微通道腔体（5）内以滤膜（6）表面切向方向流经滤 膜（6）表面；导入速度控制单元（2）控制微通道腔体内液体流动速度；

分选富集装置（8）设置于拖槽（9）内，拖槽（9）底部设置有固定板（12）， 固定板（12）底部安装有传动单元（13）和机械力发生装置（16）；

机械力发生装置（16）通过传动单元（13）驱动分选富集装置（8）发生往 复运动，运动方向与滤膜（6）表面方向平行，并与液体动力装置（1）驱动的 微通道腔体内液体液流方向垂直；

通过控制液体动力装置（1）与机械力发生装置（16），使滤膜上微通道腔 体（5）内的液体呈现不同周期和振幅的波形流动状态；

所述分选富集循环肿瘤细胞及细胞团微栓子的装置的使用方法，包括以下 步骤：

第一阶段，分选富集：

i、将样本通过分选富集装置（8）的滤膜上微通道腔体入口（10）引入滤膜上微通道腔体（5）；

ii、样本引入滤膜上微通道腔体（5）的同时，缓冲液通过分选富集装置（8）的滤膜下微通道腔体入口（11）引入滤膜下微通道腔体（7）；

iii、样本及缓冲液分别进入滤膜上微通道腔体（5）和滤膜下微通道腔体（7）后，机械力发生装置（16）通过传动单元（13）驱使分选富集装置（8） 发生往复运动，运动方向与滤膜（6）表面方向平行，并与液体动力装置（1） 驱动的微通道腔体内液体液流方向垂直，通过控制液体动力装置（1）与机械 力发生装置（16），使滤膜上微通道腔体内的液体在与滤膜（6）表面平行方向 呈现一定周期和振幅的波形流动状态；

iv、样本引入滤膜上微通道腔体（5）后，经受滤膜（6）上方的相对切向 流动经滤膜上微通道腔体出口（3）导出；

v、样本经受滤膜（6）上方进行切向流动时，样本中循环肿瘤细胞、及循 环肿瘤细胞与少量部分其它细胞或成份形成的细胞团微栓子经滤膜上微通道腔 体出口（3）导出；

vi、样本经受滤膜（6）上方进行切向流动时，样本中大多数血细胞及其 它成份穿过滤膜（6）进入滤膜下微通道腔体（7），与缓冲液混合；

vii、样本在滤膜（6）上方经受切向流动由出口导出微通道腔体的同 时，缓冲液混合了样本中穿过滤膜（6）的细胞及其它成份形成混合液导出；

第二阶段，收集富含循环肿瘤细胞和细胞团微栓子的细胞群体：

viii、缓冲液通过分选富集装置（8）的滤膜上微通道腔体入口（10）引入滤膜上微通道腔体（5）；

ix、同时，缓冲液以不小于步骤 viii 的速度通过分选富集装置（8）的滤 膜下微通道腔体入口（11）引入滤膜下微通道腔体（7）；

x、机械力发生装置（16）处于关闭，分选富集装置（8）微通道腔体内的 滤膜（6）处于静置状态；

xi、富含循环肿瘤细胞和细胞团微栓子的细胞群体随缓冲液在滤膜（6）上 方经滤膜上微通道腔体出口（3）导出。

2.根据权利要求 1 所述的分选富集循环肿瘤细胞及细胞团微栓子的装置， 其特征在于：微通道腔体呈 S 形或直线形设置。

3.根据权利要求 1 所述的分选富集循环肿瘤细胞及细胞团微栓子的装置，

其特征在于：滤膜（6）孔径为 5 至 12 微米孔径，材质为聚对二甲苯、聚碳酸 酯、硅或氧化铝。

4.根据权利要求 1 所述的分选富集循环肿瘤细胞及细胞团微栓子的装置，其特征在于：各个导出用导管上设置有渗余液导出速度控制单元（14），各个滤 液导管上设置有滤液导出速度控制单元（15）。

5.根据权利要求 1 所述的分选富集循环肿瘤细胞及细胞团微栓子的装置， 其特征在于：多组分选富集装置（8）并联设置或串联设置。

6.分选富集循环肿瘤细胞及细胞团微栓子的方法，其特征在于：所述方法用于非疾病的诊断和诊疗目的，使用权利要求1-5任意一项所述的分选富集循环肿瘤细胞及细胞团微栓子的装置，包括以下步骤：

第一阶段，分选富集：

i、将样本通过分选富集装置（8）的滤膜上微通道腔体入口（10）引入滤膜上微通道腔体（5）；

ii、样本引入滤膜上微通道腔体（5）的同时，缓冲液通过分选富集装置（8）的滤膜下微通道腔体入口（11）引入滤膜下微通道腔体（7）；

iii、样本及缓冲液分别进入滤膜上微通道腔体（5）和滤膜下微通道腔体（7）后，机械力发生装置（16）通过传动单元（13）驱使分选富集装置（8） 发生往复运动，运动方向与滤膜（6）表面方向平行，并与液体动力装置（1） 驱动的微通道腔体内液体液流方向垂直，通过控制液体动力装置（1）与机械 力发生装置（16），使滤膜上微通道腔体内的液体在与滤膜（6）表面平行方向 呈现一定周期和振幅的波形流动状态；

iv、样本引入滤膜上微通道腔体（5）后，经受滤膜（6）上方的相对切向 流动经滤膜上微通道腔体出口（3）导出；

v、样本经受滤膜（6）上方进行切向流动时，样本中循环肿瘤细胞、及循 环肿瘤细胞与少量部分其它细胞或成份形成的细胞团微栓子经滤膜上微通道腔 体出口（3）导出；

vi、样本经受滤膜（6）上方进行切向流动时，样本中大多数血细胞及其 它成份穿过滤膜（6）进入滤膜下微通道腔体（7），与缓冲液混合；

vii、样本在滤膜（6）上方经受切向流动由出口导出微通道腔体的同时， 缓冲液混合了样本中穿过滤膜（6）的细胞及其它成份形成混合液导出；

第二阶段，收集富含循环肿瘤细胞和细胞团微栓子的细胞群体：

viii、缓冲液通过分选富集装置（8）的滤膜上微通道腔体入口（10）引入滤膜上微通道腔体（5）；

ix、同时，缓冲液以不小于步骤 viii 的速度通过分选富集装置（8）的滤 膜下微通道腔体入口（11）引入滤膜下微通道腔体（7）；

x、机械力发生装置（16）处于关闭，分选富集装置（8）微通道腔体内的 滤膜（6）处于静置状态；

xi、富含循环肿瘤细胞和细胞团微栓子的细胞群体随缓冲液在滤膜（6）上 方经滤膜上微通道腔体出口（3）导出。

7.根据权利要求 6 所述的分选富集循环肿瘤细胞及细胞团微栓子的方法， 其特征在于：样本来自受试肿瘤患者的血液、腹水或腹腔清洗液；

血液样本体积不小于 0.2 毫升；

腹水或腹腔清洗液样本体积不小于 5 毫升；

所述方法用于非疾病的诊断和诊疗目的。

8.根据权利要求 7 所述的分选富集循环肿瘤细胞及细胞团微栓子的方法，其特征在于：样本包含循环肿瘤细胞、循环肿瘤细胞与血细胞或其它血液成份形成的细胞团微栓子、以及血细胞和其它血液成分；

循环肿瘤细胞为上皮型细胞或间充质型细胞，或同是上皮型和间充质型细 胞；

样本中的血细胞或其它血液成份包括免疫细胞、红细胞、血浆和血小板中 的一种或多种；

缓冲液为 PBS 液或生理盐水。

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