CN108435266B - 一种微流控检测芯片及基于其的试剂盒、全血多指标检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种微流控检测芯片及基于其的试剂盒、全血多指标检测方法和应用。所述检测芯片包含两层，上层为样本处理层，下层为反应层，所述样本处理层朝向所述反应层的表面设有2个以上的流体通道，两层紧密叠合以在芯片内部形成密闭的流体通道系统。本发明利用微流控芯片技术，在一块小型测试卡中同时检测多个基于比色法测定的生化指标，如肝功能、肾功能、血脂、电解质等。本发明克服了现有微流控技术应用的难点，对检测设备要求低，易于应用于现场即时检测，适用于大中小型医疗机构、急诊科、社区医院、家庭检测和科学研究等。

Description

一种微流控检测芯片及基于其的试剂盒、全血多指标检测方 法和应用

技术领域

本发明属于医疗检测领域，尤其涉及一种全血检测微流控芯片及其应用其的检测系统。

背景技术

众所周知，血液与全身各系统的组织器官具有密切的联系，血液检测是生物医学、临床诊断、卫生检疫诊断中最广泛的样本检测。目前绝大多数医院和实验室使用大型的离心机分离血清和血细胞，之后在自动化生化分析仪设备检测血液多种指标的含量。但是采用该方法需要从患者体内抽取毫升量的血液样本，而真正用于检测的样本仅仅几微升，导致样本的大量浪费，并且离心机体积较大，结构复杂，不能直接连接血液检测设备，使得血液分离和血液检测需要分开独立进行，容易造成样品污染，检测效率低下，不能满足安全、快速的血液检测需求。另外这类自动生化分析仪体积庞大、价格昂贵、操作复杂，所需标本量大，不仅对于基层医疗机构不适用，而且也难以满足现场采样分析、快速检测以及患者自测等需求。

因此，研制操作简便、样本量少、可多指标检测的微型便携的全血检测技术和设备变得极为迫切。

20世纪90年代发展起来的微流控芯片是指利用几十到几百微米的沟道处理和控制10^-9～10^-8升体积的液体的科学与技术系统，与传统的生化分析技术相比，微流控芯片具有体积小、试剂消耗少、分析速度快、分析过程自动化、易于集成化以及高通量等许多优点。但在基于微流控芯片的检测中，为了充分洗脱、准确控制样品及反应试剂的流速和反应时间，通常需要复杂的阀控结构，增加了装置的体积、成本和复杂度，同时降低了检测系统的可靠性。另外，激光诱导荧光法(laser-induced fluorescence，LIF)是当前微流控芯片检测中应用最广、灵敏度最高的检测方法，但是该检测装置存在体积大、结构复杂、通用性差、操作复杂等问题，无法满足微流控芯片检测的家用化和便携化要求。

为了满足微型化和便携化的需求，有研究者对检测方式进行了改变。专利文献1公开一种多功能血液检测芯片，该芯片将不同的酶试剂固化在同一块基片的不同电极上，可以同时测量血液中血糖、胆固醇、乳酸、酮体或其他四种物质的含量。但是该芯片制作工艺复杂，并且采用酶电极法进行检测的应用范围比较窄、在检测稳定性、准确度方面都存在局限性。

专利文献2公开一种检测集成芯片及检测方法，可以一次性自动化完成样品溶液的前处理、定量输送、反应并对溶液中成分含量进行检测，一次检测就可以获得多个检测指标，检测周期短，芯片体积微小，与微型化检测设备集成，可以实现现场采样分析。但是在该方法中血细胞分离采用离心方式，检测过程中需要多次离心，将样品输送至指定位置，设备相对复杂，不利于现场检测。另外，这种芯片在使用过程中，存在稀释液在加样过程中进入到稀释液定量槽中并提前进入到混合槽的风险，这种操作不当将会造成芯片功能失效。

专利文献1：CN1460852A

专利文献2：CN102580797A

发明内容

发明要解决的问题

为了解决现有技术存在的上述问题，在样本量少的情况下提高全血多指标检测的可靠性，本发明设计了一种小体积、低成本和使用便捷的微流控检测芯片，其对设备复杂性要求低，仅需要少量样品就可以实现血液中多指标高精度快速检测。

此外，本发明还提供基于该微流控检测芯片的试剂盒以及全血多指标检测方法和微流控检测芯片的应用。

用于解决问题的方案

本发明人为了解决上述问题经过努力研究，设计出一种用于全血检测的微流控检测芯片，具体而言，本发明包括如下技术方案：

[1]一种微流控检测芯片，所述检测芯片包含两层，上层为样本处理层，下层为反应层，两层紧密叠合以在芯片内部形成密闭的流体通道系统，所述样本处理层包括加样孔和透气孔，所述加样孔位于样本处理层的中部且为阶梯通孔，所述透气孔位于样本处理层的四周且为通孔，所述样本处理层朝向所述反应层的表面设有2个以上的流体通道，各流体通道的一端均与所述加样孔的大孔部即样本加入区相连通，各流体通道的另一端与各检测孔连通，所述样本加入区固定有全血过滤装置，所述反应层有多个与上层检测孔对应的检测区，其内固定检测干试剂。

[2]根据[1]所述的微流控检测芯片，所述流体通道有4个或6个。

[3]根据[1]或[2]所述的微流控检测芯片，在所述流体通道的靠近检测孔的旁侧设置连接通道，其与透气孔相连通。

[4]根据[1]-[3]任一技术方案所述的微流控检测芯片，所述检测区为凹陷的圆形或非圆形，所述干试剂通过冷冻干燥、烘干或者真空抽干形式固定在检测区内。

[5]根据[1]-[4]任一技术方案所述的微流控检测芯片，所述芯片的材料选自玻璃、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)或聚碳酸酯(PC)中的一种；优选的，所述芯片的材料选自聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或聚碳酸酯(PC)。

[6]根据[1]-[5]任一技术方案所述的微流控检测芯片，所述样本处理层和所述反应层通过胶粘贴、超声波焊接或者激光焊接的方式紧密叠合。

[7]根据[1]-[6]任一技术方案所述的微流控检测芯片，所述芯片呈正方形，边长在30～40mm范围内，所述上层和下层的厚度均为1.5～2.5mm，所述流体通道宽度为0.8～1.6mm，深度为1～2mm，长度为7～8mm。

[8]根据[1]-[7]任一技术方案所述的微流控检测芯片，所述透气孔直径可在0.8～1.6mm范围内。

[9]根据[1]-[8]任一技术方案所述的微流控检测芯片，所述加样孔的小孔部的直径在0.5mm～4.0mm之间，所述样本加入区的直径在4.0mm～10.0mm之间。

[10]一种用于全血多指标检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内含有一个或多个根据[1]-[9]任一技术方案所述的微流控检测芯片以及样本稀释缓冲液，所述样本稀释缓冲液包括磷酸盐缓冲液、氯化钠和表面活性剂的组合。

[11]一种基于[1]-[9]任一技术方案所述的微流控检测芯片的全血多指标检测方法，所述检测方法包括如下步骤：(1)取10～50μl的全血样本用含0.5～1.5wt％表面活性剂的样本稀释缓冲液进行稀释得到样本溶液；(2)将步骤(1)得到的样本溶液滴加至[1]-[9]任一技术方案所述的微流控检测芯片的加样孔处；(3)静置3～10分钟后进行检测；优选的，所述检测利用吸收光度变化或者颜色变化实现。

[12]根据[1]-[9]任一技术方案所述的微流控检测芯片在制备用于全血检测的试剂盒中的应用，所述检测芯片可对所述全血的一种或多种生化指标进行快速检测；所述生化指标包括肝功能指标、肾功能指标、血脂指标和/或电解质指标。

发明的效果

本发明的微流控检测芯片利用微流控芯片技术，可以一次性完成全血样品溶液的前处理、反应并对样本中多个成分含量进行检测，可以用于一种或多种临床生化指标检测，如肝功能指标、肾功能指标、血脂指标和/或电解质指标等。

本发明能在一块小型测试卡中同时检测多个基于比色法测定的生化指标，无需样本前处理，仅需要提供1滴末梢全血(10～50ul)，3～10分钟左右即可得到检测结果。

本发明使用方便灵活，定量检测结果稳定可靠。本发明克服了现有微流控技术应用的难点，对检测设备要求低，易于应用于现场即时检测(point-of-care testing，POCT)，适用于大中小型医疗机构、急诊科、社区医院、家庭检测和科学研究等。

附图说明

图1：本发明提供的微流控检测芯片的第一实施例的拆分侧视图。

图2：本发明提供的微流控检测芯片的第一实施例的沿对角线方向的截面示意图。

图3：本发明提供的微流控检测芯片的第一实施例的上层上表面的平面图。

图4：本发明提供的微流控检测芯片的第一实施例的上层下表面即背面平面图。

图5：本发明提供的微流控检测芯片的第一实施例的下层上表面平面图。

图6：利用本发明提供的微流控检测芯片的第一实施例对血脂四项目进行检测的评估结果。

图7：本发明提供的微流控检测芯片的第二实施例的上层下表面即背面平面图。

图8：本发明提供的微流控检测芯片的第二实施例的下层上表面平面图。

图9：利用本发明提供的微流控检测芯片的第二实施例对肝功能六项目的评估结果。

附图标记说明

微流控检测芯片 1

芯片上层 10

芯片下层 20

样本加入区 101

加样孔 102

透气孔 103

流体通道 104

连接通道 105

检测孔 106

检测区 201

具体实施方式

为了更加清楚地阐述本发明的上述目的、特征和优点，在该部分结合附图详细说明本发明的具体实施方式。除了在本部分描述的各个实施方式以外，本发明还能够通过其他不同的方式来实施，在不违背本发明精神的情况下，本领域技术人员可以做相应的改进、变形和替换，因此本发明不受该部分公开的具体实施例的限制。本发明的保护范围应以权利要求为准。

本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含一系列步骤或单元的过程、方法或系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

<微流控检测芯片>

本发明的微流控检测芯片，分为上下两层，芯片上层即样本处理层和芯片下层即反应层，两层紧密叠合以在芯片内部形成密闭的流体通道系统。芯片的形状可以是方形、长方形、多边形或者圆形，优选地，其形状为方形或长方形，长宽在30～40mm范围内。在本发明具体实施方式中，芯片为方形，边长在30～40mm范围，出于便捷化、集成化以及节约成本的考虑，优选30mm。芯片上下层的厚度均为1.5～2.5mm，如果厚度太薄，则芯片加载样本量过小并且容易变形，如果厚度太厚，透光性会受到影响，影响检测结果，同时也不符合芯片小型化的需求。芯片上层和下层之间通过胶粘贴、超声波焊接或者激光焊接的方式紧密叠合。

芯片上下层的材料可选自玻璃、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)或聚碳酸酯(PC)中的一种，从制作成本以及加工性能考虑，芯片上下层的材料优选聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或聚碳酸酯(PC)，更优选透光率高的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或聚碳酸酯(PC)，通过模具注塑方式制作。

芯片上层即样本处理层主要用于对全血样本进行预处理，分离和截留血液中的红细胞以减少红细胞对光谱分析的干扰，并且分配血浆或血清将其引入检测区域。芯片下层即反应层主要是进行样本溶液与干试剂的比色反应。

在本发明中，芯片上层即样本处理层包括加样孔和透气孔。

其中加样孔位于样本处理层的中部，优选靠近中心的位置，用于加入样本和样本稀释缓冲液(以下简称“样本溶液”)，所述加样孔为阶梯通孔，样本溶液通过加样孔的小孔部注入，加样孔的大孔部即样本加入区内固定有全血过滤装置如全血滤膜(如GE MF1、LF1、VF2等)将全血中血细胞和血浆分离，使血浆或血清进入流体通道以进行后续测定。滤膜的材质优选为玻璃纤维材质。阶梯通孔的设计可以实现在少量样本量情况下更好地过滤血细胞且尽量减少不必要的样本损失，有利于提高样本的过滤效果。加样孔的小孔部可设计成可与生物实验中常规实验的标准规格的移液枪枪头严密匹配的圆形，直径可在0.5mm～4.0mm之间，样本加入区的直径可在4mm～10mm之间，该尺寸比例主要是为了配合全血过滤膜的过滤性能和本产品检测所需要的样本量需求，即符合检测需要，又减少了样本的浪费。

所述透气孔位于样本处理层的四周，透气孔为与大气相通的通孔，优选是圆形通孔以改善样本溶液的流动性，直径可在0.8～1.6mm范围内。透气孔可以设置多个，取决于流体通道的个数，优选4个或6个。

在芯片上层的下表面，即所述样本处理层朝向所述反应层的表面上设有2个以上的流体通道，各流体通道的一端均与所述加样孔的大孔部即样本加入区相连通，各流体通道的另一端与各检测孔连通，各检测孔同样位于所述样本处理层朝向所述反应层的表面，起到样本收集的作用。样本溶液经过样本加入区的全血过滤装置后分别流入各流体通道，各流体通道将样本溶液引入到检测孔，检测孔可以为圆形或非圆形，样本溶液在检测孔处靠重力作用进入芯片的下层。

流体通道可以通过热压法等常规方法加工成形。流体通道的宽度为0.8～1.6mm，深度为1～2mm，长度为7～8mm，在本发明的一个具体实施方式中长度为7.4mm，该尺寸是为了配合检测仪的检测需求，实际实施中并不局限于此。为了便于制作加工，流体通道的截面可以为梯形或矩形，各流体通道的尺寸优选相同。在本发明中各流体通道分布在样本加入区四周，优选地流体通道均匀地分布在样本加入区的四周，流体通道的个数为偶数，优选4个或6个，根据所需测定的指标数目进行选择。

流体通道的表面可进行亲水处理，比如采用电晕或者溶胶-凝胶改性等方式。但出于加工成本等考虑，本发明的流体通道无需进行表面亲水处理即可实现血浆在流体通道内具有合适的流动速度，主要在于强的毛细作用以及在样本稀释缓冲液中加入一定量的表面活性剂以改善流体通道的亲水性，另外在流体通道的靠近检测孔的旁侧设置连接通道，其与透气孔相连通，这样的结构可以有效地促进液体的流动，所述连接通道的宽度比流体管道窄以避免样本不必要的损失，连接通道的宽度为0.3～0.6mm，深度为0.8～0.9mm。

芯片下层即反应层的四周设有多个与上层检测孔对应的检测区，其内固定干试剂。检测区为凹陷的圆形或非圆形，如果检测区为圆形，其直径介于2～4mm之间，检测区的深度介于1～2mm，所述干试剂通过冷冻干燥、烘干或者真空抽干形式固定在检测区内。样本溶液到达芯片上层的检测孔处靠重力作用进入下层的检测区，与干试剂进行混合并产生比色反应。干试剂根据检测指标的不同进行分别配制，干燥后，将芯片下层与芯片上层紧密叠合，干燥避光保存。

<用于全血多指标检测的试剂盒>

本发明还提供一种用于全血多指标检测的试剂盒，所述试剂盒内含有一个或多个本发明所述的微流控检测芯片以及样本稀释缓冲液。

样本稀释缓冲液包括磷酸盐缓冲液、氯化钠和表面活性剂的组合。表面活性剂包含但不限于可包括吐温20、吐温80、曲拉通X-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮等。出于改善流体通道亲水性角度考虑，优选吐温20、曲拉通X-100。表面活性剂用量优选含0.5～1.5wt％表面活性剂，表面活性剂用量过多或少均对样本在通道内流动有产生影响，如太少可能导致液体流动不畅或无法流动，过多则可能增加液体粘度影响液体流动，此外过多的表面活性剂影响样本孔内干试剂复溶和部分生化反应进行，进而影响检测效果。

<全血多指标检测方法及微流控芯片的用途>

本发明提供一种基于本发明的微流控检测芯片的全血多指标检测方法。所述检测方法包括如下步骤：

(1)取10～50μl的全血样本用本发明的样本稀释缓冲液进行稀释得到样本溶液；

(2)将步骤(1)得到的样本溶液滴加至本发明的微流控检测芯片的加样孔处；

(3)静置3～10分钟后进行检测；优选地，所述检测利用吸收光度变化或者颜色变化实现。

出于提高检测的精度同时改善样本流动性的角度考虑，全血样本和样本稀释缓冲液的体积比为1：3～5，优选为1:4。

本发明的检测设备可以有多种，如分光光度计，举例包括紫外分光光度计，设定特定波长后从对应检测孔位置照射后读取吸收光；或者用反射分光光度计，固定波长照射后读取反射光强度，结合定标曲线后可以得到全血中不同指标含量。另外还可以采用扫描或拍照方式，读取不同颜色深度鉴别，该方法灵敏度和线性范围不如分光光度计，但是在正常人参考值范围附近可以区分，可以满足一般检测要求，可以用移动手机检测。本发明的微流控检测芯片适合与小型检测设备结合使用，适用于小型诊所和家庭健康监测。

本发明还提供微流控检测芯片在制备用于全血检测的试剂盒中的应用。本发明的微流控检测芯片可以用于生物医学检测领域，对人或动物的全血的多种基于比色法测定的生化指标进行快速检测，如肝功能指标、肾功能指标、血脂指标、电解质指标等，无需样本前处理，仅需要提供1滴末梢全血，3～10分钟左右即可得到检测结果，检测准确度和稳定性好，适用于医疗机构、床旁检测和家庭检测。

由下面的实施例进一步说明本发明，但不构成限制。

实施例

实施例一

本实施例提供一种微流控检测芯片，用于检测全血中血脂含量，包含胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇。

图1为微流控检测芯片的拆分图，如图所示，微流控检测芯片1包括芯片上层10即样本处理层和芯片下层20即反应层。图2为微流控检测芯片沿对角线方向的截面示意图，由图可见，两层紧密叠合以在芯片内部形成密闭的流体通道系统。芯片材质为PMMA。芯片的尺寸为30mm×30mm×5mm。

图3所示的是芯片上层10即样本处理层的上表面，可见在样本处理层包括1个加样孔102和4个透气孔103，所述加样孔102位于样本处理层的中部，用于加入样本和稀释缓冲液，所述透气孔103均匀分布在样本处理层的四周并且为与大气相通的圆形通孔。加样孔102和透气孔103的直径分别为4mm和1.2mm。

图4所示的是芯片上层10的下表面，即所述样本处理层朝向所述反应层的表面，由图4可见在该表面上设有4个流体通道104。结合图2，可知加样孔102为阶梯通孔，各流体通道的一段均与所述加样孔102的大孔部即样本加入区101相连通，流体通道104均匀地分布在样本加入区101的四周，沿芯片的对角线方向，各流体通道的另一端与4个检测孔106连通。样本加入区101内固定一经过裁切的全血过滤膜(GE MF1)。流体通道的长度为7.4mm，宽度为1.2mm，深度为2mm。在流体通道104的靠近检测孔106的旁侧设置连接通道105与透气孔103相连通，连接通道105的宽度为0.5mm，深度为0.85mm。

图5所示的是芯片下层20即反应层的上表面，所述反应层有4个与上层检测孔106对应的检测区201，其内固定干试剂，检测区201为圆形，直径为3.5mm，深度为2mm。

在本实施例中，干试剂的试剂配方分别如下：

胆固醇(CHOL)检测试剂成分包含：磷酸盐缓冲液、4-氨基安替比林、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、色源和牛血清白蛋白。

甘油三酯(TRIG)检测试剂成分包括：磷酸盐缓冲液、4-氨基安替比林、脂蛋白酯酶、甘油激酶、三磷酸腺苷、磷酸甘油氧化酶、色源、曲拉通X-100和牛血清白蛋白。

高密度脂蛋白胆固醇(HDL)检测试剂成分包含：磷酸盐缓冲液、4-氨基安替比林、硫酸葡聚糖、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、色源、聚氧乙烯烷基醚和牛血清白蛋白。

低密度脂蛋白胆固醇(LDL)检测试剂成分包含：磷酸盐缓冲液、4-氨基安替比林、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、色源、聚氧乙烯亚烷基醚、聚甘油醚和牛血清白蛋白。

采用的色源为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，特性为偶联过氧化物酶反应后，在555nm处出现最大吸收峰。

试剂配制后加入到检测区201，冷冻干燥后，将芯片下层20与芯片上层10进行粘合为微流控检测芯片1，干燥避光保存。

可将微流控检测芯片1和样本稀释缓冲液(50mmol/L磷酸盐缓冲液、0.9wt％氯化钠、1wt％吐温20)制备成试剂盒备用。

使用时，取20ul全血，加入80ul样本稀释缓冲液，充分混合。将样本溶液全部加入加样孔102后静止3分钟。反应完成后使用小型紫外分光光度计检测555nm处最大吸收峰。对应标准品校准曲线，即可计算样本中胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇和葡萄糖的含量。

图6显示利用本实施例的微流控检测芯片对血脂四项目进行检测的评估结果。取新鲜血液样本20例进行检测，其中考核试剂为按照本实施例微流控检测芯片，用小型紫外分光光度计进行检测，以英国朗道公司生化复合校准血清校准。参比试剂为某市售生化体外诊断试剂盒在全自动生化分析仪(罗氏C8000-C702模块)进行检测。图6(A-D)是对检测结果进行简单线性回归分析所得的结果，显示两者相关性和一致性较好，R²在0.96以上。

实施例二

本实施例提供一种微流控芯片，用于检测全血中肝功能六项指标含量，具体包括总蛋白、白蛋白、总胆红素、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶和胆碱酯酶。

基本结构与实施例一类似，芯片上层和下层结构见图7和图8。芯片的尺寸为30mm×30mm×5mm。芯片材质为PC。由图7可知，微流控检测芯片具有6个流体通道104，对应有6个透气孔103及6个检测孔106，流体通道104均匀地分布在样本加入区101的四周，样本处理层的样本加入区101处固定一经过裁切的全血过滤膜，同实施例一。流体通道的长度为7.4mm，宽度为1.2mm，深度为2mm。在流体通道104的靠近检测孔106的旁侧设置连接通道105与透气孔103相连通，连接通道105的宽度为0.5mm，深度为0.85mm。

样本从检测孔106流入检测区201，与干试剂混合并产生反应，引起吸光度改变。

在本实施例中，干试剂的试剂配方分别如下：

总蛋白(TP)检测试剂包含：硫酸铜、碘化钾、酒石酸钾钠。检测波长为546nm。

白蛋白(ALB)检测试剂包含：丁二酸、溴甲酚绿、聚氧乙烯月桂醚。检测波长为630nm。

总胆红素(TBIL)检测试剂包含：柠檬酸缓冲液、表面活性剂和二苯胺重氮盐。检测波长为450nm。

胆碱酯酶(CHE)检测试剂包含：S-碘代丁酰硫代胆碱、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)。检测波长为414nm。

丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂包含：磷酸盐缓冲液、氯化镁、L-丙氨酸、酮戊二酸、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶、抗坏血酸氧化酶、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐。检测波长为555nm。

天冬氨酸氨基转移酶(AST)检测试剂包含：磷酸盐缓冲液、氯化镁、L-丙氨酸、酮戊二酸、草酰乙酸脱羧酶、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶、抗坏血酸氧化酶、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐。检测波长为555nm。

可将微流控检测芯片1和样本稀释缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液、0.9wt％氯化钠、1.2wt％曲拉通X-100)制备成试剂盒备用。

检测时，取30ul全血，加入120ul样本稀释缓冲液，充分混合。将样本和样本稀释缓冲液全部加入加样孔102后静止8min。之后使用小型紫外分光光度计针对不同指标检测区检测对应波长下的最大吸收峰吸收峰。对应标准品校准曲线，即可计算样本中总蛋白、白蛋白、总胆红素、胆碱酯酶、丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶的含量。

图9显示利用本实施例的微流控检测芯片对肝功能六项进行检测的评估结果。取新鲜血液样本20例进行检测，其中考核试剂为按照本实施例制备的微流控肝功能六项检测芯片，以本单位小型紫外分光光度计检测，以英国朗道公司生化复合校准血清校准。参比试剂为某市售生化体外诊断试剂盒在全自动生化分析仪上(罗氏C8000-C702模块)进行检测。图9(A-F)是对检测结果进行简单线性回归分析所得的结果，结果显示两者相关性和一致性较好，R²均在0.95以上。

Claims (9)

1.一种微流控检测芯片，其特征在于，所述检测芯片包含两层，上层为样本处理层，下层为反应层，两层紧密叠合以在芯片内部形成密闭的流体通道系统，所述样本处理层包括加样孔和透气孔，所述加样孔位于样本处理层的中部且为阶梯通孔，所述透气孔位于样本处理层的四周且为通孔，所述样本处理层朝向所述反应层的表面设有2个以上的流体通道，各流体通道的一端均与所述加样孔的大孔部即样本加入区相连通，各流体通道的另一端与各检测孔连通，所述样本加入区固定有全血过滤装置，所述反应层有多个与上层检测孔对应的检测区，所述检测区为凹陷的圆形或非圆形，其内固定检测干试剂，所述芯片的材料选自玻璃、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)或聚碳酸酯(PC)中的一种；所述反应层主要是进行样本溶液与干试剂的比色反应；在所述流体通道的靠近检测孔的旁侧设置连接通道，其与所述透气孔相连通，所述连接通道的宽度比流体通道窄。

2.根据权利要求1所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述流体通道有4个或6个。

3.根据权利要求1或2所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述干试剂通过冷冻干燥、烘干或者真空抽干形式固定在检测区内。

4.根据权利要求1或2所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述芯片的材料选自聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或聚碳酸酯(PC)。

5.根据权利要求1或2所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述样本处理层和所述反应层通过胶粘贴、超声波焊接或者激光焊接的方式紧密叠合。

6.根据权利要求1或2所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述芯片呈正方形，边长在30～40mm范围内，所述上层和下层的厚度均为1.5～2.5mm，所述流体通道宽度为0.8～1.6mm，深度为1～2mm，长度为7～8mm。

7.一种用于全血多指标检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内含有一个或多个如权利要求1-6任一项所述的微流控检测芯片以及样本稀释缓冲液，所述样本稀释缓冲液包括磷酸盐缓冲液、氯化钠和表面活性剂的组合。

8.一种基于权利要求1-6任一项所述的微流控检测芯片的全血多指标检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

(1)取10～50μl的全血样本用含0.5～1.5wt％表面活性剂的样本稀释缓冲液进行稀释得到样本溶液；

(2)将步骤(1)得到的样本溶液滴加至权利要求1-6任一项所述的微流控检测芯片的加样孔处；

(3)静置3～10分钟后进行检测。

9.权利要求1-6任一项所述的微流控检测芯片在制备用于全血检测的试剂盒中的应用，其特征在于，所述微流控检测芯片可对所述全血的一种或多种生化指标进行快速检测，所述生化指标包括肝功能指标、肾功能指标、血脂指标和/或电解质指标。

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