CN108431215A

CN108431215A - 用于二羧酸生产的宿主细胞

Info

Publication number: CN108431215A
Application number: CN201680075200.0A
Authority: CN
Inventors: 埃里克·皮特·洛斯; 赵正; 瑞内·维尔瓦尔; 雅各布斯·托马斯·普龙克; 罗尔夫·珀尔德曼斯
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: Technip Energies France SAS
Priority date: 2015-12-23
Filing date: 2016-12-22
Publication date: 2018-08-21
Also published as: EP3394251A1; FI3394251T3; US20200181657A1; WO2017109091A1; PL3394251T3; CA3008963A1; ES2940213T3; US11078504B2; EP3394251B1

Abstract

本发明涉及一种宿主细胞，其能够生产二羧酸并且在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致至少一个催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷。本发明还涉及生产二羧酸的方法，所述方法包括：在合适的发酵培养基中发酵所述宿主细胞；和生产所述二羧酸。

Description

用于二羧酸生产的宿主细胞

发明领域

本发明涉及能够生产二羧酸的宿主细胞。本发明还涉及用于改善宿主细胞中的二羧酸产生的方法以及使用本发明的宿主细胞生产二羧酸的方法。本发明还涉及宿主细胞基因组中的修饰用于增加宿主细胞中二羧酸产生的用途。

背景技术

4-碳二羧酸苹果酸、延胡索酸和琥珀酸是大量化学品的潜在前体。例如，琥珀酸可以被转变为1,4-丁二醇(BDO)、四氢呋喃和γ-丁内酯。衍生自琥珀酸的另一产物是通过连接琥珀酸和BDO制造的聚酯聚合物。

用于工业用途的琥珀酸主要是通过马来酸或马来酸酐的催化氢化由丁烷通过石油化学生产的。这些方法被认为是对环境有害且昂贵的。琥珀酸的发酵生产被视为生产琥珀酸的一种吸引人的替代方法，其中可以使用可再生的原料作为碳源。

已经对(重组)酵母中C4-二羧酸的发酵生产进行了若干研究。

例如，EP2495304公开了适合琥珀酸生产的重组酵母，其中编码丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶和琥珀酸转运体的基因被遗传修饰。

尽管在宿主细胞(例如酵母)中发酵生产二羧酸已经取得了改进，但仍需要进一步改进的用于发酵生产二羧酸的宿主细胞。

发明概述

本发明基于以下发现：编码直接或间接导致一种或多种辅因子(例如NADH)的氧化的酶的一种或多种基因的缺失能够增加宿主细胞(该细胞能够生产二羧酸)中的二羧酸生产，例如琥珀酸生产。

因此，本发明涉及一种宿主细胞，其能够生产二羧酸并且在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致至少一个催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷。

本发明还涉及：

-用于改善宿主细胞中的二羧酸产生的方法，所述方法包括：

-提供能够生产二羧酸的宿主细胞；和

-在所述宿主细胞的基因组中进行修饰以导致至少一个催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷，

从而改善宿主细胞中的二羧酸产生；

-生产二羧酸的方法，所述方法包括：在合适的发酵培养基中发酵本发明的宿主细胞，和生产所述二羧酸；以及

-宿主细胞基因组中的修饰的用途，所述用途导致至少一个催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷，从而增加宿主细胞中的二羧酸产生。

附图简介

图1示出了pSUC223的质粒图谱。

图2示出了用FRD1表达盒置换PDC6的原理示意图。

图3示出了pSUC 228的质粒图谱。

图4示出了GUT2缺失的原理示意图。

图5示出了pSUC 227的质粒图谱。

图6示出了pSUC 225的质粒图谱。

图7示出了NDE1缺失的原理示意图。

图8示出了NDE2缺失的原理示意图。

图9示出了GPD1缺失的原理示意图。

图10示出了GPD2缺失的原理示意图。

序列表说明

SEQ ID NO：1示出了Escherichia coli延胡索酸酶fumB的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2示出了质粒pSUC223的完整核酸序列。

SEQ ID NO：3示出了缺少前19个氨基酸的FRD1(由YEL047c编码)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4示出了合成的TDH3p-FRD1-TDH3t基因的核酸序列。

SEQ ID NO：5示出了引物1(具有PDC6 5'悬突(overhang)的TDH3p FW)的核酸序列。

SEQ ID NO：6示出了引物2(具有与pSUC228Cre-1的悬突的TDH3t REV)的核酸序列。

SEQ ID NO：7示出了引物3(具有悬突TDH3t的pSUC228Cre-1FW)的核酸序列。

SEQ ID NO：8示出了引物4(DBC-03373，pSUC228Cre-1REV)的核酸序列。

SEQ ID NO：9示出了质粒pSUC228的完整核酸序列。

SEQ ID NO：10示出了引物5(DBC-03374，pSUC225Cre-2FW)的核酸序列。

SEQ ID NO：11示出了引物6(具有PDC6 3'悬突的pSUC225Cre-2REV)的核酸序列。

SEQ ID NO：12示出了缺少3个氨基酸的C末端靶向信号的糖酵解酶体(glycosomal)Trypanosoma brucei延胡索酸还原酶(FRDg)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13示出了缺少前23个N-末端氨基酸的Rhizopus oryzae延胡索酸酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：14示出了在第120-122位具有EGY到DAF修饰的Actinobacillussuccinogenes磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：15示出了缺少C-末端过氧化物酶体靶向序列(氨基酸SKL)的Saccharomyces cerevisiae过氧化物酶体苹果酸脱氢酶(Mdh3)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：16示出了Saccharomyces cerevisiae丙酮酸羧化酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：17示出了Kluyveromyces lactis异柠檬酸裂合酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：18示出了缺少3C-末端过氧化物酶体靶向序列的Saccharomycescerevisiae过氧化物酶体苹果酸合酶(Mls1)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：19示出了来自Aspergillus niger的二羧酸转运体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：20示出了引物7(FW，在GUT2上游)的核酸序列。

SEQ ID NO：21示出了引物8(REV，GUT2 50bp Lox66上游)的核酸序列。

SEQ ID NO：22示出了引物9(Cre_1REV)的核酸序列。

SEQ ID NO：23示出了引物10(Cre_2FW)的核酸序列。

SEQ ID NO：24示出了引物11(FW GUT2-KO-Cre_1)的核酸序列。

SEQ ID NO：25示出了引物12(REV GUT2-KO-Cre_2)的核酸序列。

SEQ ID NO：26示出了引物13(FW，GUT2 50bp Lox71下游)的核酸序列。

SEQ ID NO：27示出了引物14(REV，在GUT2下游)的核酸序列。

SEQ ID NO：28示出了引物15(FW，在NDE2上游)的核酸序列。

SEQ ID NO：29列出引物16(REV，NDE2 50bp Lox66上游)的核酸序列。

SEQ ID NO：30示出了引物17(FW，NDE2 50bp Lox71下游)的核酸序列。

SEQ ID NO：31示出了引物18(REV，在NDE2下游)的核酸序列。

SEQ ID NO：32示出了引物19(FW NDE2-KO-Cre_1)的核酸序列。

SEQ ID NO：33示出了引物20(REV NDE2-KO-Cre_2)的核酸序列。

SEQ ID NO：34示出了引物21(FW，在NDE1上游)的核酸序列。

SEQ ID NO：35示出了引物22(REV，NDE1 50bp Lox66上游)的核酸序列。

SEQ ID NO：36示出了引物23(FW，NDE1 50bp Lox71下游)的核酸序列。

SEQ ID NO：37示出了引物24(REV，在NDE1下游)的核酸序列。

SEQ ID NO：38示出了引物25(FW NDE1-KO-Cre_1)的核酸序列。

SEQ ID NO：39示出了引物26(REV NDE1-KO-Cre_2)的核酸序列。

SEQ ID NO：40示出了Saccharomyces cerevisiae NDE1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：41示出了Saccharomyces cerevisiae NDE2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：42示出了Saccharomyces cerevisiae GUT2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：43示出了pSUC227的核酸序列。

SEQ ID NO：44示出了pSUC225的核酸序列。

SEQ ID NO：45示出了引物27(FW，在gpd1上游)的核酸序列。

SEQ ID NO：46示出了引物28(REV，在gpd1上游)的核酸序列。

SEQ ID NO：47示出了引物29(FW GPD1-KO-Cre_1)的核酸序列。

SEQ ID NO：48示出了引物30(REV GPD1-KO-Cre_2)的核酸序列。

SEQ ID NO：49示出了引物31(FW，在gpd1下游)的核酸序列。

SEQ ID NO：50示出了引物32(REV，在gpd1下游)的核酸序列。

SEQ ID NO：51示出了引物33(FW，在gpd2上游)的核酸序列。

SEQ ID NO：52示出了引物34(REV，在gpd2上游)的核酸序列。

SEQ ID NO：53示出了引物35(FW gpd2-KO-Cre_1)的核酸序列。

SEQ ID NO：54示出了引物36(REV gpd KO Cre-2)的核酸序列。

SEQ ID NO：55示出了引物37(FW，在gpd2下游)的核酸序列。

SEQ ID NO：56示出了引物38(REV，在gpd2下游)的核酸序列。

SEQ ID NO：57示出了Saccharomyces cerevisiae GPD1(甘油3-磷酸脱氢酶1)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：58示出了Saccharomyces cerevisiae GPD2(甘油3-磷酸脱氢酶2)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：59示出了Saccharomyces cerevisiae ADH1(醇脱氢酶1)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：60示出了Saccharomyces cerevisiae ADH2(醇脱氢酶2)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：61示出了Saccharomyces cerevisiae ADH3(醇脱氢酶3)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：62示出了Saccharomyces cerevisiae ADH4(醇脱氢酶4)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：63示出了Saccharomyces cerevisiae ADH5(醇脱氢酶5)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：64示出了Saccharomyces cerevisiae ADH6(醇脱氢酶6)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：65示出了Saccharomyces cerevisiae ALD2(醛脱氢酶2)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：66示出了Saccharomyces cerevisiae ALD3(醛脱氢酶3)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：67示出了Saccharomyces cerevisiae ALD4(醛脱氢酶4)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：68示出了Saccharomyces cerevisiae ALD5(醛脱氢酶5)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：69示出了Saccharomyces cerevisiae ALD6(醛脱氢酶6)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：70示出了Arabidopsis thaliana延胡索酸酶的氨基酸序列。

发明详述

在本说明书和所附的权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“具有”及其变形应被理解为“包含在内”。也就是说，在语境允许的情况下，这些词语意图传达的意思是：可以包括其它没有明确列举的要素或整体。

本文中不使用数量词修饰时指的是一个/种或多于一个/种(即一个/种或至少一个/种)对象。例如，“要素”可意味着一个/种要素或多于一个/种要素。

本发明基于以下发现：编码直接或间接参与一种或多种辅因子(例如NADH)的氧化的酶的一种或多种基因的缺失能够增加宿主细胞(该细胞能够生产二羧酸)中的二羧酸生产，例如琥珀酸生产。

因此，本发明提供一种宿主细胞，其能够生产二羧酸并且在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致至少一个催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷。

本文提及的催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷被定义为这样的表型特征，其中当在基本相同的条件下分析时，与其基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞相比，本发明的宿主细胞由于基因组中的修饰而在所述酶促步骤中生成更少的部分或完全氧化状态的辅因子。

也就是说，与其基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞相比(当在基本相同的条件下分析时)，本发明的宿主细胞中催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷导致所述步骤中部分或完全还原形式的辅因子的氧化减少。

因此，与其基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞(当在基本相同的条件下分析时)相比，在本发明的宿主细胞中，一种或多种处于更还原状态(部分或完全还原)的辅因子的可得性(availability)提高。

本发明的宿主细胞中催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷通常是基因组中的修饰的结果，其中当在基本相同的条件下分析时，与其基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞相比，本发明的宿主细胞：a)产生更少多肽，和/或b)由编码多肽的基因转录的mRNA的表达水平降低，和/或c)产生具有降低的蛋白活性或降低的蛋白比活性的多肽，和/或d)产生更少由多肽产生的产物，以及这些可能性中的一种或多种的组合。所述多肽可以是直接或间接导致一种或多种辅因子的氧化的多肽。

在该语境中，基因就此被定义为包含开放阅读框(ORF)和其转录控制元件(启动子和终止子)的多核苷酸，所述ORF是基因上的将被转录并且翻译成蛋白序列的区域。

因此，酶促步骤的缺陷可以如下测量：通过确定如果与其基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞相比(当在基本相同的条件下分析时)，由上文所限定的本发明宿主细胞产生的直接或间接导致一种或多种辅因子的氧化的多肽的量和/或(比)活性，和/或由编码多肽的基因转录的mRNA的量，和/或上文所限定的本发明宿主细胞中的多肽产生的产物的量，和/或通过基因或基因组测序。可使用对技术人员而言可得到的任何检验，例如转录谱、Northern印迹法、RT-PCR、Q-PCR、蛋白质组和Western印迹法来测量多肽的产生缺陷。

宿主细胞的基因组修饰在本文中被定义为导致细胞基因组中的多核苷酸序列改变的任何事件。修饰被理解为一种/个或多种/个修饰。可通过经典的菌株改进，随机诱变随后选择来引入修饰。可通过引入(插入)、替换或去除(缺失)核苷酸序列中的一个或多个核苷酸来完成修饰。该修饰可例如在编码序列或对多核苷酸的转录或翻译而言必需的调节元件中。例如，可插入或去除核苷酸，以导致引入终止密码子、去除起始密码子或使编码序列的开放阅读框改变或移码。编码序列或其调节元件的修饰可根据本领域中已知的方法通过定点或随机诱变、DNA改组方法、DNA再组装方法、基因合成(参见例如Young和Dong,(2004),Nucleic Acids Research 32,(7)electronic access http://nar.oupjournals.org/cgi/reprint/32/7/e59或者Gupta等人(1968),Proc.Natl.Acad.Sci USA,60:1338-1344；Scarpulla等人(1982),Anal.Biochem.121:356-365；Stemmer等人(1995),Gene 164:49-53)或PCR产生的诱变完成。随机诱变程序的例子是本领域中熟知的，例如化学(例如NTG)诱变或物理(例如UV)诱变。定向诱变程序的例子是QuickChange^TM定点诱变试剂盒(Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA)、‘The AlteredII体外诱变系统’(Promega Corporation)或在Gene(1989)77(1):51-9(Ho SN,Hunt HD,Horton RM,PullenJK,Pease LR“Site-directed mutagenesis by overlap extension using thepolymerase chain reaction”)中描述的使用PCR或如在Molecular Biology:CurrentInnovations and Future Trends.(A.M.Griffin和H.G.Griffin.编，ISBN 1-898486-01-8；1995Horizon Scientific Press,PO Box 1,Wymondham,Norfolk,英国)中描述的使用PCR通过重叠延伸来进行。

可通过将经修饰宿主细胞的DNA序列与亲本宿主细胞的序列进行比较来确定基因组中的修饰。可使用对本领域技术人员而言已知的标准方法，例如使用Sanger测序技术和/或下一代测序技术比如在Elaine R.Mardis(2008),Next-Generation DNA SequencingMethods,Annual Review of Genomics and Human Genetics,9:387-402.(doi:10.1146/annurev.genom.9.081307.164359)中综述的Illumina GA2,Roche 454等等，进行DNA测序和基因组测序。

一些优选的修饰方法基于基因置换、基因缺失或基因破坏技术。

例如，在多核苷酸、核酸构建体或表达盒置换的情况下，可在将被置换的靶基因座处引入适当的DNA序列。所述适当的DNA序列优选地存在于克隆载体上。优选的整合型克隆载体包含下述DNA片段，所述DNA片段与将被置换的基因座侧翼的多核苷酸同源和/或与所述多核苷酸具有同源性，以用于将克隆载体的整合靶向该预定的基因座。为了促进靶向整合，优选地在转化细胞之前对克隆载体线性化。优选地，进行线性化以使得克隆载体的至少一端，但优选地任意一端的侧翼为与将被置换的DNA序列(或侧翼序列)同源的序列。该方法被称为同源重组并且还可使用该技术以实现(部分)基因缺失或基因破坏。

例如，对于基因破坏，可通过缺陷型多核苷酸置换对应于内源多核苷酸的多核苷酸，所述缺陷型多核苷酸是不能产生(完全功能性的)蛋白的多核苷酸。通过同源重组，缺陷型多核苷酸置换内源多核苷酸。可期望的是，缺陷型多核苷酸还编码标记，所述标记可用于选择其中核酸序列已被修饰的转化体。

或者，可使用与多核苷酸的核酸序列互补的核苷酸序列通过已建立的反义技术来进行修饰，其中所述宿主细胞产生更少的本文所述多肽中的一种或所述宿主细胞在本文所述多肽中的一种的产生方面缺陷。更特别地，可通过引入与多核苷酸的核酸序列互补的核苷酸序列(其可在细胞中转录，并且能与细胞中产生的mRNA杂交)来降低或消除本发明宿主细胞的多核苷酸的表达。在允许互补反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，翻译的蛋白的量因此减少或消除。表达反义RNA的例子展示于Appl.Environ.Microbiol.(2000年)2月；66(2):775-82(Characterization of a foldase,protein disulfide isomerase A,in theprotein secretory pathway of Aspergillus niger.Ngiam C,Jeenes DJ,Punt PJ,VanDen Hondel CA,Archer DB)或者(Zrenner R,Willmitzer L,Sonnewald U.Analysis ofthe expression of potato uridinediphosphate-glucose pyrophosphorylase and itsinhibition by antisense RNA.Planta.(1993)；190(2):247-52)中。

此外，可通过RNA干扰(RNAi)技术(FEMS Microb.Lett.237(2004):317-324)来获得多核苷酸的修饰、下调或失活。在该方法中，核苷酸序列(其表达待被影响)的相同的正义和反义部分被克隆为处于前后位置，中间是核苷酸间隔，并且插入到表达载体中。此种分子转录后，小核苷酸片段的形成将导致待被影响的mRNA的靶向降解。对特定mRNA的去除可进行至不同的程度。W02008/053019、W02005/05672A1、W02005/026356A1、Oliveira等人,“Efficient cloning system for construction of gene silencing vectors inAspergillus niger”(2008)Appl.Microbiol.and Biotechnol.80(5):917-924和/或Barnes等人,“siRNA as a molecular tool for use in Aspergillus niger”(2008)Biotechnology Letters 30(5):885-890中描述的RNA干扰技术可用于对多核苷酸的下调、修饰或失活。

在本文中，辅因子通常是指蛋白质(例如酶)的生物活性所需的非蛋白质化合物。也就是说，辅因子可以被认为是辅助生物化学转化的“助手分子”。在本发明的上下文中，术语“辅因子”和“辅酶”在本文中具有相同的含义并可互换使用。

通常，本发明宿主细胞基因组中的修饰会导致有机辅因子氧化的缺陷。这种辅因子通常是小的有机分子(通常分子量小于1000Da)，其可以松散地或紧密地结合到酶上并可以直接参与反应。在一些酶中，辅因子可以紧密地结合；而在其他酶中，辅因子松散地结合。

在本发明的宿主细胞中，基因组中的修饰通常导致部分或完全还原形式的辅因子的氧化缺陷。在本发明中，辅因子可以是NADH、NADPH或FADH₂。

本发明中宿主细胞基因组中的修饰可以直接或间接导致辅因子氧化缺陷。

在本发明的宿主细胞中，基因组中的修饰通常导致胞质溶胶中催化辅因子氧化的至少一个酶促步骤的缺陷。

在本发明的宿主细胞中，宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：

-至少一种线粒体外部NADH脱氢酶；或

-至少一种线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶；或

-至少一种胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶；或

-至少一种醇脱氢酶；或

-至少一种醛脱氢酶；或

它们的组合。

在本发明的宿主细胞中，线粒体外部NADH脱氢酶具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：41所示序列或包含与SEQ ID NO：40或SEQ IDNO：41具有至少35％同一性、更优选至少40％同一性、更优选至少45％同一性、更优选至少50％同一性、甚至更优选至少55％同一性、甚至更优选至少60％同一性、甚至更优选至少65％同一性、甚至更优选至少70％同一性、甚至更优选至少75％同一性、甚至更优选至少80％同一性、甚至更优选至少85％同一性、甚至更优选至少90％同一性、例如至少91％同一性、例如至少92％同一性、例如至少93％同一性、例如至少94％同一性、例如至少95％同一性、例如至少96％同一性、例如至少97％同一性、例如至少98％同一性、例如至少99％同一性的序列。

在本发明的宿主细胞中，线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：42所示序列或包含与SEQ ID NO：42具有至少35％同一性、更优选至少40％同一性、更优选至少45％同一性、更优选至少50％同一性、甚至更优选至少55％同一性、甚至更优选至少60％同一性、甚至更优选至少65％同一性、甚至更优选至少70％同一性、甚至更优选至少75％同一性、甚至更优选至少80％同一性、甚至更优选至少85％同一性、甚至更优选至少90％同一性、例如至少91％同一性、例如至少92％同一性、例如至少93％同一性、例如至少94％同一性、例如至少95％同一性、例如至少96％同一性、例如至少97％同一性、例如至少98％同一性、例如至少99％同一性的序列。

在本发明的宿主细胞中，胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：58所示序列或包含与SEQ ID NO：57或SEQID NO：58具有至少35％同一性、更优选至少40％同一性、更优选至少45％同一性、更优选至少50％同一性、甚至更优选至少55％同一性、甚至更优选至少60％同一性、甚至更优选至少65％同一性、甚至更优选至少70％同一性、甚至更优选至少75％同一性、甚至更优选至少80％同一性、甚至更优选至少85％同一性、甚至更优选至少90％同一性、例如至少91％同一性、例如至少92％同一性、例如至少93％同一性、例如至少94％同一性、例如至少95％同一性、例如至少96％同一性、例如至少97％同一性、例如至少98％同一性、例如至少99％同一性的序列。

在本发明的宿主细胞中，醇脱氢酶具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：64所示序列或包含与SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ IDNO：63或SEQ ID NO：64具有至少35％同一性、更优选至少40％同一性、更优选至少45％同一性、更优选至少50％同一性、甚至更优选至少55％同一性、甚至更优选至少60％同一性、甚至更优选至少65％同一性、甚至更优选至少70％同一性、甚至更优选至少75％同一性、甚至更优选至少80％同一性、甚至更优选至少85％同一性、甚至更优选至少90％同一性、例如至少91％同一性、例如至少92％同一性、例如至少93％同一性、例如至少94％同一性、例如至少95％同一性、例如至少96％同一性、例如至少97％同一性、例如至少98％同一性、例如至少99％同一性的序列。

在本发明的宿主细胞中，醛脱氢酶具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：69所示序列或包含与SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：69具有至少35％同一性、更优选至少40％同一性、更优选至少45％同一性、更优选至少50％同一性、甚至更优选至少55％同一性、甚至更优选至少60％同一性、甚至更优选至少65％同一性、甚至更优选至少70％同一性、甚至更优选至少75％同一性、甚至更优选至少80％同一性、甚至更优选至少85％同一性、甚至更优选至少90％同一性、例如至少91％同一性、例如至少92％同一性、例如至少93％同一性、例如至少94％同一性、例如至少95％同一性、例如至少96％同一性、例如至少97％同一性、例如至少98％同一性、例如至少99％同一性的序列。

在一种实施方式中，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：

-至少一种线粒体外部NADH脱氢酶。

特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：

-至少一种线粒体外部NADH脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：41所示序列或包含与SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：41具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列。

更特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：

-线粒体外部NADH脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ IDNO：40所示序列或包含与SEQ ID NO：40具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列；和

-线粒体外部NADH脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ IDNO：41所示序列或包含与SEQ ID NO：41具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列。

在另一种实施方式中，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：

-至少一种线粒体外部NADH脱氢酶；和

-至少一种线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶。

-至少一种线粒体外部NADH脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：41所示序列或包含与SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：41具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列；和

-至少一种线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：42所示序列或包含与SEQ ID NO：42具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列。

-线粒体外部NADH脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ IDNO：41所示序列或包含与SEQ ID NO：41具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列；和

-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQID NO：42所示序列或包含与SEQ ID NO：42具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列。

甚至更特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：

-线粒体外部NADH脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQID NO：40具有至少70％同一性的序列；和

-线粒体外部NADH脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQID NO：41具有至少70％同一性的序列；和

-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO：42具有至少70％同一性的序列。

-线粒体外部NADH脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQID NO：40具有至少80％同一性的序列；和

-线粒体外部NADH脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQID NO：41具有至少80％同一性的序列；和

-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO：42具有至少80％同一性的序列。

-线粒体外部NADH脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQID NO：40具有至少90％同一性的序列；和

-线粒体外部NADH脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQID NO：41具有至少90％同一性的序列；和

-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO：42具有至少90％同一性的序列。

-线粒体外部NADH脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQID NO：40具有至少95％同一性的序列；和

-线粒体外部NADH脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQID NO：41具有至少95％同一性的序列；和

-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO：42具有至少95％同一性的序列。

最特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：

-线粒体外部NADH脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ IDNO：40所示序列；和

-线粒体外部NADH脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ IDNO：41所示序列；和

-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQID NO：42所示序列。

-至少一种线粒体外部NADH脱氢酶；和

-至少一种线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶；和

-至少一种胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶。

-至少一种线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：42所示序列或包含与SEQ ID NO：42具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列；和

-至少一种胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：58所示序列或包含与SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：58具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列。

-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQID NO：42所示序列或包含与SEQ ID NO：42具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列；和

-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：57所示序列或包含与SEQ ID NO：57具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列；和

-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：58所示序列或包含与SEQ ID NO：58具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列。

-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO：42具有至少70％同一性的序列；和

-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO：57具有至少70％同一性的序列；和

-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO：58具有至少70％同一性的序列。

-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO：42具有至少80％同一性的序列；和

-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO：57具有至少80％同一性的序列；和

-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO：58具有至少80％同一性的序列。

-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO：42具有至少90％同一性的序列；和

-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO：57具有至少90％同一性的序列；和

-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO：58具有至少90％同一性的序列。

-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO：42具有至少95％同一性的序列；和

-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO：57具有至少95％同一性的序列；和

-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO：58具有至少95％同一性的序列。

-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQID NO：42所示序列；和

-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：57所示序列；和

-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：58所示序列。

-至少一种胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶。

在另一种实施方式中，如上文所述的本发明的宿主细胞在其基因组中进一步包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致至少一种醇脱氢酶和/或至少一种醛脱氢酶的缺陷。醇脱氢酶和醛脱氢酶的优选实施方式如上所述。

优选地，在本发明的宿主细胞中，本文确定的一种或多种多肽的产生缺陷是产生减少至少20％、更优选至少30％、更优选至少40％、甚至更优选至少50％、甚至更优选至少60％、特别地至少70％、更特别地至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少100％(当在基本相同的条件下分析时，与基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞相比)。

优选地，在本发明的宿主细胞中，从编码本文确定的一种或多种多肽的一种或多种基因转录的mRNA的表达水平缺陷是表达减少至少20％、更优选至少30％、更优选至少40％、甚至更优选至少50％、甚至更优选至少60％、特别地至少70％、更特别地至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少100％(当在基本相同的条件下分析时，与基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞相比)。

优选地，在本发明的宿主细胞中，本文确定的一种或多种多肽的蛋白活性或蛋白比活性的缺陷是活性或比活性降低至少20％、更优选至少30％、更优选至少40％、甚至更优选至少50％、甚至更优选至少60％、特别地至少70％、更特别地至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少100％(当在基本相同的条件下分析时，与基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞相比)。

优选地，在本发明的宿主细胞中，由一种或多种多肽产生的产物的缺陷是产生减少至少20％、更优选至少30％、更优选至少40％、甚至更优选至少50％、甚至更优选至少60％、特别地至少70％、更特别地至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少100％(当在基本相同的条件下分析时，与基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞相比)。

本发明的宿主细胞能够生产二羧酸，例如苹果酸、延胡索酸和/或琥珀酸。

术语“二羧酸”和“二羧酸盐/酯”(例如“琥珀酸”和“琥珀酸盐/酯”)在本文中具有相同的含义并可互换使用，前者是后者的氢化形式。

如上文所述，本发明的宿主细胞是经遗传修饰的宿主细胞，其在基因组中包含至少一种遗传修饰(例如内源或同源核苷酸序列的缺失或破坏)，从而导致至少一个催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷。本发明的宿主细胞来源于或产生自“亲本宿主细胞”(其基因组未被根据本发明修饰)。亲本宿主细胞可以是野生型菌株或经遗传修饰的宿主细胞。例如，亲本宿主细胞可以是产生二羧酸的任何野生型菌株。或者，亲本宿主细胞可以是已经经历了用于二羧酸生产的重组核酸转化或经典诱变处理的任何感兴趣的野生型菌株。例如，亲本宿主细胞可含有编码参与二羧酸生产的多肽的同源或异源表达构建体。

本领域技术人员会知道修饰细胞如微生物细胞的方法，使得其能够产生参与二羧酸生产的多肽。为此目的，重组基因技术的方法在本领域非常完善，并且描述于Sambrook和Russel(2001)"Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第三版),Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press或F.Ausubel等人编.,"Currentprotocols in molecular biology",Green Publishing and Wiley Interscience,NewYork(1987)中。

在本文中使用时，术语“核酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)聚合物，即多核苷酸，除非另有限制，其包括具有天然核苷酸基本特性从而以类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交的已知类似物(例如肽核酸)。多核苷酸可以是天然或异源的结构基因或调节基因的全长或子序列(subsequence)。除非另有说明，该术语包括所示出的序列及其互补序列。

在本文中使用时，“基因”可以指经分离的核酸分子。因此，在本申请的上下文中，术语“基因”不仅仅指天然存在的序列。

在本文中使用时，术语“异源的”是指并非天然存在于宿主细胞中的核酸或氨基酸序列。换句话说，核酸或氨基酸序列与宿主细胞中天然发现的核酸或氨基酸序列不同。

在本文中使用时，术语“内源的”或“同源的”是指宿主细胞中天然存在的核酸或氨基酸序列。

合适的本发明宿主细胞可以是原核细胞。优选地，所述原核细胞是细菌细胞。术语“细菌细胞”包括革兰氏阴性微生物和革兰氏阳性微生物。

合适的细菌可以选自例如Escherichia、Anabaena、Caulobactert、Gluconobacter、Rhodobacter、Pseudomonas、Paracoccus、Bacillus、Brevibacterium、Corynebacterium、Rhizobium(Sinorhizobium)、Flavobacterium、Klebsiella、Enterobacter、Lactobacillus、Lactococcus、Methylobacterium、Staphylococcus或Actinomycetes例如Streptomyces和Actinoplanes种。优选地，细菌细胞选自Bacillussubtilis、B.amyloliquefaciens、B.licheniformis、B.puntis、B.megaterium、B.halodurans、B.pumilus、Gluconobacter oxydans、Caulobacter crescentus CB 15、Methylobacterium extorquens、Rhodobacter sphaeroides、Pseudomonaszeaxanthinifaciens、Pseudomonas putida、Pseudomonas fluorescens、Paracoccusdenitrificans、Escherichia coli、Corynebacterium glutamicum、Staphylococcuscarnosus、Streptomyces lividans、Streptomyces clavuligerus、Sinorhizobiummelioti和Rhizobium radiobacter。

根据本发明的宿主细胞可以是真核宿主细胞。优选地，所述真核宿主细胞是哺乳动物、昆虫、植物、真菌或藻类细胞。更优选地，真核宿主细胞是真菌细胞。合适的真菌宿主细胞可以例如属于Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Aspergillus、Penicillium、Pichia、Kluyveromyces、Yarrowia、Candida、Hansenula、Humicola、Issatchenkia、Kloeckera、Schwanniomyces、Torulaspora、Trichosporon、Brettanomyces、Rhizopus、Zygosaccharomyces、Pachysolen或Yamadazyma属。真菌细胞可以例如属于Saccharomycescerevisiae、S.uvarum、S.bayanus S.pastorianus、S.carlsbergensis、Aspergillusniger、Penicillium chrysogenum、Pichia stipidis、P.pastoris、Kluyveromycesmarxianus、K.lactis、K.thermotolerans、Yarrowia lipolytica、Candida sonorensis、C.revkaufi、C.pulcherrima、C.tropicalis、C.utilis、C.kruisei、C.glabrata、Hansenulapolymorpha、Issatchenkia orientalis、Torulaspora delbrueckii、Brettanomycesbruxellensis、Rhizopus oryzae或Zygosaccharomyces bailii种。在一种实施方式中，本发明的真菌宿主细胞是酵母，例如属于Saccharomyces sp.，例如Saccharomycescerevisiae。

具体酵母宿主细胞的实例包括C.sonorensis、K.marxianus、K.thermotolerans、C.methanesorbosa、Saccharomyces bulderi(S.bulderi)、I.orientalis、C.lambica、C.sorboxylosa、C.zemplinina、C.geochares、P.membranifaciens、Z.kombuchaensis、C.sorbosivorans、C.vanderwaltii、C.sorbophila、Z.bisporus、Z.lentus、Saccharomycesbayanus(S.bayanus)、D.castellii、C、boidinii、C.etchellsii、K.lactis、P.jadinii、P.anomala、Saccharomyces cerevisiae(S.cerevisiae)、Pichia galeiformis、Pichiasp.YB-4149(NRRL命名)、Candida ethanolica、P.deserticola、P.membranifaciens、P.fermentans和Saccharomycopsis crataegensis(S.crataegensis)。K.marxianus和C.sonorensis的合适菌株包括WO 00/71738 Al、WO 02/42471 A2、WO 03/049525 A2、WO03/102152 A2和WO 03/102201A2中描述的那些。I.orientalis的合适菌株是ATCC菌株32196和ATCC菌株PTA-6648。在本发明中，宿主细胞可以是克拉布特里(Crabtree)阴性的野生型菌株。克拉布特里效应被定义为：当以高比生长速率(长期效应)或在存在高浓度葡萄糖的情况下(短期效应)培养时，由于微生物氧消耗的抑制在有氧条件下发生的发酵性代谢。克拉布特里阴性表型不展示出这种效应，因此即使在存在高浓度葡萄糖的情况下或在高生长速率下也能够消耗氧。

真核细胞可以是丝状真菌宿主细胞。丝状真菌包括真菌(Eumycota)和卵菌(Oomycota)亚门的所有丝状形式(如Hawksworth等人在Ainsworth and Bisby'sDictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中定义)。丝状真菌的特征为由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复杂多糖构成的菌丝壁。营养生长通过菌丝伸长进行且碳分解代谢专性好氧。丝状真菌菌株包括但不限于Acremonium、Aspergillus、Agaricus、Aureobasidium、Cryptococcus、Corynascus、Chrysosporium、Filibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Monascus、Mucor、Myceliophthora、Mortierella、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Phanerochaete Podospora、Pycnoporus、Rhizopus、Schizophyllum、Sordaria、Talaromyces、Rasamsonia、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium、Trametes和Trichoderma的菌株。可作为宿主细胞的优选丝状真菌菌株属于Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Aspergillus fumigatus、Penicilliumchrysogenum、Penicillium citrinum、Acremonium chrysogenum、Trichoderma reesei、Rasamsonia emersonii(以前被称为Talaromyces emersonii)、Aspergillus sojae、Chrysosporium lucknowense、Myceliophtora thermophyla种。用于比较经转化细胞和未转化细胞的发酵特征的参照宿主细胞包括例如Aspergillus niger CBS120.49、CBS513.88、Aspergillus oryzae ATCC16868、ATCC 20423、IFO 4177、ATCC 1011、ATCC 9576、ATCC14488-14491、ATCC 11601、ATCC12892、Aspergillus fumigatus AF293(CBS101355)、P.chrysogenum CBS 455.95、Penicillium citrinum ATCC 38065、Penicilliumchrysogenum P2、Thielavia terrestris NRRL8126、Talaromyces emersonii CBS124.902、Rasamsonia emersonii CBS393.64、Acremonium chrysogenum ATCC 36225、ATCC48272、Trichoderma reesei ATCC 26921、ATCC 56765、ATCC 26921、Aspergillus sojaeATCC11906、Chrysosporium lucknowense ATCC44006以及所有这些菌株的衍生株。

一种更优选的宿主细胞属于Aspergillus属，更优选地，宿主细胞属于Aspergillus niger种。当根据本发明的宿主细胞是Aspergillus niger宿主细胞时，宿主细胞优选是CBS 513.88、CBS124.903或其衍生株。

在一种优选的实施方式中，根据本发明的宿主细胞是选自Candida、Hansenula、Issatchenkia、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces或Yarrowia菌株的酵母宿主细胞，或者选自属于Acremonium、Aspergillus、Chrysosporium、Myceliophthora、Penicillium、Talaromyces、Rasamsonia、Thielavia、Fusarium或Trichoderma种的丝状真菌细胞的丝状真菌宿主细胞。

本发明的宿主细胞可以包含活性的还原性三羧酸(TCA)通路。还原性TCA通路是微生物可产生二羧酸的主要通路之一。近年来，在宿主细胞中引入还原性TCA通路已被证明是(微生物)生产二羧酸例如琥珀酸的最佳经济选择。

在一种实施方式中，对本发明的宿主细胞进行遗传修饰以包含还原性TCA通路。也就是说，本发明的宿主细胞可以包含用于二羧酸生产的重组还原性TCA通路。

在另一种实施方式中，对本发明的宿主细胞进行遗传修饰以包含在胞质溶胶中有活性的还原性TCA通路。也就是说，本发明的宿主细胞可以包含在胞质溶胶中有活性的重组还原性TCA通路。

在该语境中，术语“重组”是指TCA通路是通过本领域已完善建立的重组基因技术产生的事实。

参与所述还原性TCA通路的酶可以是同源酶或异源酶。

在一种优选的实施方式中，所述还原性TCA通路包括磷酸烯醇式丙酮酸盐/酯或丙酮酸盐/酯朝向琥珀酸盐/酯的转变。

因此，本发明的宿主细胞可以包含选自催化以下反应的酶的组的同源酶或异源酶：

-丙酮酸盐/酯朝向草酰乙酸盐/酯和/或磷酸烯醇式丙酮酸盐/酯朝向草酰乙酸盐/酯；

-草酰乙酸盐/酯朝向苹果酸盐/酯；

-苹果酸盐/酯朝向延胡索酸盐/酯；和

-延胡索酸盐/酯朝向琥珀酸盐/酯。

本发明的宿主细胞可以进一步包含二羧酸转运体，所述二羧酸转运体将二羧酸(例如琥珀酸)从细胞内输出到细胞外环境。

因此，本发明的宿主细胞可包含一个或多个拷贝的以下核酸，所述核酸编码磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶和/或二羧酸转运体中的一种或多种。

因此，本发明的宿主细胞可以过表达一个或多个拷贝的以下核酸，所述核酸编码磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶和/或二羧酸转运体中的一种或多种。优选地，当一种或多种所述酶被过表达时，它们在胞质溶胶中有活性。

优选地，本发明的宿主细胞是真菌宿主细胞，例如酵母宿主细胞。更优选地，本发明的真菌宿主细胞包含根据下文所述的优选实施方式的遗传修饰。

本发明的真菌宿主细胞可包含丙酮酸羧化酶(PYC)的遗传修饰，丙酮酸羧化酶催化从丙酮酸盐/酯到草酰乙酸盐/酯的反应(EC 6.4.1.1)。丙酮酸羧化酶例如可在基因表达后在胞质溶胶中有活性。例如，真菌宿主细胞过表达丙酮酸羧化酶，例如内源性或同源丙酮酸羧化酶被过表达。可以用与SEQ ID NO：16的核酸序列所编码的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的丙酮酸羧化酶遗传修饰根据本发明的真菌宿主细胞。

优选地，本发明的真菌宿主细胞表达编码胞质溶胶中的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶的核苷酸序列。优选地，编码PEP羧激酶的核苷酸序列被过表达。PEP羧激酶(EC4.1.1.49)优选地是异源酶，优选地来自细菌，更优选地，具有PEP羧激酶活性的酶来自Escherichia coli、Mannheimia sp.、Actinobacillus sp.或Anaerobiospirillum sp.，更优选地Mannheimia succiniciproducens。编码PEP羧激酶的基因可被过表达，并且在真菌细胞的胞质溶胶中有活性。优选地，用与SEQ ID NO：14的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的PEP羧激酶遗传修饰根据本发明的真菌宿主细胞。

优选地，本发明的真菌宿主细胞表达编码胞质溶胶中的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化酶的核苷酸序列。优选地，编码PEP羧化酶的核苷酸序列被过表达。PEP羧化酶(EC4.1.1.31)优选地是异源酶，优选地来自细菌。

在一种实施方式中，用编码在基因表达之后在胞质溶胶中有活性的苹果酸脱氢酶(MDH)的基因进一步遗传修饰本发明的真菌宿主细胞。胞质溶胶表达可以通过缺失过氧化物酶体靶向信号来实现。苹果酸脱氢酶可被过表达。胞质溶胶MDH可以是催化从草酰乙酸盐/酯到苹果酸盐/酯的反应的任何合适的同源或异源苹果酸脱氢酶(EC 1.1.1.37)，例如来自S.cerevisiae。

优选地，MDH是S.cerevisiae MDH3，更优选具有C-末端SKL缺失从而使得其在胞质溶胶中有活性的S.cerevisiae MDH3。优选地，本发明的真菌宿主细胞包含编码与SEQ IDNO:15的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的苹果酸脱氢酶的核苷酸序列。

在另一种实施方式中，用编码催化从苹果酸到延胡索酸的反应的延胡索酸酶(EC4.2.1.2)的基因进一步遗传修饰本发明的真菌宿主细胞。编码延胡索酸酶的基因可来自于任何合适的来源，优选地来自微生物来源，例如酵母(例如Saccharomyces)或丝状真菌(例如Rhizopus oryzae)或细菌(例如Escherichia coli)。本发明的真菌宿主细胞可过表达编码延胡索酸酶的核苷酸序列。在核苷酸序列表达后，延胡索酸酶可在胞质溶胶中有活性，例如通过缺失过氧化物酶体靶向信号来实现。已发现：延胡索酸酶的胞质溶胶活性导致真菌细胞对二羧酸的高生产力。

优选地，本发明的真菌宿主细胞过表达编码与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：13或SEQID NO：70的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的延胡索酸酶的核苷酸序列。

在另一种实施方式中，用编码催化从延胡索酸盐/酯到琥珀酸盐/酯的反应的NAD(H)依赖型延胡索酸还原酶(EC 1.3.1.6)的任何合适的同源或异源基因遗传修饰本发明的真菌宿主细胞。NADH依赖型延胡索酸还原酶可以是异源酶，其可来自任何合适的来源，例如细菌、真菌、原生动物或植物。本公开的真菌细胞包含异源NAD(H)依赖型延胡索酸还原酶，优选地来自Trypanosoma sp，例如Trypanosoma brucei。在一种实施方式中，NAD(H)依赖型延胡索酸还原酶被表达并在胞质溶胶中有活性，例如通过缺失过氧化物酶体靶向信号来实现。真菌细胞可过表达编码NAD(H)依赖型延胡索酸还原酶的基因。

优选地，用与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的NAD(H)依赖型延胡索酸还原酶遗传修饰根据本发明的真菌宿主细胞。

在另一种实施方式中，用WO2015/086839中所公开的具有延胡索酸还原酶活性的变体多肽遗传修饰本发明的真菌宿主细胞。

在另一种实施方式中，本发明的真菌宿主细胞表达编码二羧酸转运蛋白的核苷酸序列。优选地，二羧酸转运蛋白被过表达。二羧酸转运蛋白可以是任何合适的同源或异源蛋白。优选地，二羧酸转运蛋白是异源蛋白。二羧酸转运蛋白可以来自任何合适的生物体，优选来自酵母或真菌，例如Schizosaccharomyces pombe或Aspergillus niger。优选地，二羧酸转运蛋白是这样的二羧酸转运蛋白/苹果酸转运蛋白，例如来自Aspergillus niger，其与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

本发明的真菌宿主细胞可以进一步包含编码异柠檬酸裂合酶(EC4.1.3.1)的基因的遗传修饰，所述异柠檬酸裂合酶可以是任何合适的同源或异源酶。异柠檬酸裂合酶可例如获自Kluyveromyces lactis或Escherichia coli。

用与SEQ ID NO：17的核酸序列所编码的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的异柠檬酸裂合酶遗传修饰根据本发明的真菌宿主细胞。

本发明的真菌宿主细胞可以进一步包含苹果酸合酶(EC 2.3.3.9)的遗传修饰。苹果酸合酶可被过表达和/或在胞质溶胶中有活性，例如通过缺失过氧化物酶体靶向信号来实现。如果苹果酸合酶是S.cerevisiae苹果酸合酶，例如通过缺失SKL羧基端序列来改变天然苹果酸合酶。

用与SEQ ID NO：18的核酸序列所编码的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的苹果酸合酶遗传修饰本发明的真菌宿主细胞。

在另一种实施方式中，本文所公开的本发明的真菌宿主细胞包含编码丙酮酸脱羧酶(EC 4.1.1.1)的基因的破坏，所述丙酮酸脱羧酶催化从丙酮酸盐/酯到乙醛的反应。

优选地，本发明的真菌宿主细胞可以过表达包含编码PEP羧激酶、PEP羧化酶、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶和/或二羧酸转运体中的一种或多种的序列的同源或异源核苷酸序列。更优选地，当一种或多种所述酶被过表达时，它们在胞质溶胶中有活性。酶的优选实施方式如上文所述。

优选地，本发明的真菌宿主细胞是酵母宿主细胞。酵母宿主细胞的优选实施方式如上文关于真菌宿主细胞所述。

上述酶的胞质溶胶表达可通过缺失过氧化物酶体或线粒体靶向信号来实现。过氧化物酶体或线粒体靶向信号的存在可例如通过Schlüter等人,Nucleid Acid Research2007,35,D815-D822所公开的方法来确定。

标准的遗传学技术例如宿主细胞中酶的过表达、宿主细胞的遗传修饰或杂交技术是本领域已知的方法，例如Sambrook和Russel(2001)“Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第三版),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor LaboratoryPress或F.Ausubel等编，"Current protocols in molecular biology",GreenPublishing and Wiley Interscience,New York(1987)中所述。转化(例如用于真菌宿主细胞的遗传修饰)的方法从例如EP-A-0 635 574、WO 98/46772、WO 99/60102和WO 00/37671、WO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635 574和US 6,265,186中已知。

两个序列之间的序列比较和序列同一性百分比的确定可使用数学算法来完成。本领域的技术人员将意识到以下事实：若干不同的计算机程序可用于比对两个序列并确定两个序列之间的同一性(Kruskal,J.B.(1983)An overview of sequence comparison，D.Sankoff和J.B.Kruskal,(编),Time warps,string edits and macromolecules:thetheory and practice of sequence comparison,第1-44页Addison Wesley)。两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比可使用用于比对两个序列的Needleman和Wunsch算法来确定(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。氨基酸序列和核苷酸序列两者均可通过算法进行比对。Needleman-Wunsch算法已在计算机程序NEEDLE中实现。出于本发明的目的，使用了来自EMBOSS包的NEEDLE程序(2.8.0版或更高版本，EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)Rice,P.Longden,I.和Bleasby,A.Trends in Genetics 16,(6)第276—277页,http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列而言，EBLOSUM62用于替换矩阵。对于核苷酸序列而言，使用EDNAFULL。所使用的任选参数是空位开放罚分为10，以及空位延伸罚分为0.5。技术人员将理解的是，所有这些不同的参数将产生稍微不同的结果，但是当使用不同的算法时，两个序列的总体同一性百分比没有显著改变。

在通过如上所述的程序NEEDLE进行比对后，查询序列与本发明的序列之间的序列同一性的百分比计算如下：在两个序列中显示相同氨基酸或相同核苷酸的比对中的相应位置的数目除以在减去比对中的总空位数后比对的总长度。如本文定义的同一性可通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得，并且在程序的输出中标记为“最长同一性”。

本发明的核酸和蛋白质序列可进一步用作“查询序列”以进行针对公共数据库的搜索，以例如鉴定其它家族成员或相关序列。此类搜索可使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403—10的blastn和blastx程序(2.2.31版或更高版本)进行。BLAST核苷酸搜索可用blastn程序(得分＝100、字长＝11)来进行，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可用blastx程序(得分＝50、字长＝3)来进行，以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可利用如在Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中描述的空位BLAST。当利用BLAST和空位BLAST程序时，可使用相应程序(例如blastx和blastn)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/的国家生物技术信息中心的主页。

本发明提供了用于改善宿主细胞中的二羧酸产生的方法，所述方法包括：

-提供能够生产二羧酸的宿主细胞；和

-在所述宿主细胞的基因组中进行修饰以导致一种或多种辅因子的氧化的缺陷，

从而改善宿主细胞中的二羧酸产生。

能够生产二羧酸的宿主细胞和导致一种或多种辅因子的氧化的缺陷的遗传修饰的优选实施方式如上文所述。

本发明还提供了生产二羧酸的方法，所述方法包括：在适于生产二羧酸的条件下发酵如上文所述的本发明的宿主细胞，和任选地从发酵培养基中回收二羧酸。

在所述方法中，在包含合适发酵培养基的容器中发酵本发明的宿主细胞。本文所使用的术语发酵指的是化合物的细胞(例如微生物)生产，在此处是由碳水化合物生产二羧酸。

优选地，发酵产物是二羧酸，优选地苹果酸、延胡索酸和/或琥珀酸，优选地琥珀酸。

分批发酵在本文中被定义为这样的发酵，其中所有营养物在发酵开始时加入。

补料分批发酵是这样的分批发酵，其中营养物在发酵期间加入。分批和补料分批发酵中的产物可在合适的时机收获，例如在一种或更多种营养物耗尽时收获。

连续发酵是这样的发酵，其中营养物被连续加入到发酵中且其中产物被连续地移出发酵。

在一种实施方式中，在本发明的方法中发酵本发明的宿主细胞是在碳水化合物限制条件下进行的。当在本文中使用时，碳水化合物限制条件被定义为维持碳水化合物浓度低于10g/l，例如约5g/l。

根据本发明的生产二羧酸的方法可以以任何合适的体积和规模进行，优选地以工业规模进行。工业规模在本文中被定义为至少10升或100升，优选地至少1m³，优选地至少10m³或100m³，优选地至少1000m³，通常低于10,000m³的体积。

在本发明的方法中发酵本发明的宿主细胞可在任何合适的发酵培养基中进行，所述发酵培养基包含合适的氮源、碳水化合物和本发明所述方法中生长和二羧酸生产所需的其它营养物。根据本发明的发酵方法中合适的碳水化合物可以是葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖或麦芽糖。

在一种实施方式中，所述发酵方法在CO₂分压为5％-60％、优选地约50％下进行。

在所述生产二羧酸的方法中，pH通常在二羧酸生产期间降低。优选地，在所述生产二羧酸的方法中，pH在1和5之间、优选地1.5和4.5之间、更优选地2和4之间的范围。

在另一优选实施方式中，根据本发明的方法包括以下步骤：在碳水化合物的存在下在需氧条件下预培养本发明的宿主细胞。优选地，在预培养期间宿主细胞的发酵在4-6之间的pH下进行。优选地，预培养期间的碳水化合物是非抑制性碳水化合物、优选半乳糖。已发现在非抑制性碳水化合物上预培养宿主细胞是有利的，因为这防止了葡萄糖抑制的发生，而葡萄糖抑制可负面影响所产生生物质的量。此外，还发现：在需氧条件下预培养宿主细胞的步骤导致更高的生物质产率和更快的生长。优选地，所述预培养以分批模式进行。

通常进行用于生产增加的生物质的增殖步骤，优选地在碳水化合物限制条件下进行。

生产二羧酸的方法可在任何合适的温度下进行。合适的温度可例如在约10℃和约40℃之间，例如在约15℃和约30℃之间。

在一种实施方式中，以至少部分本发明的宿主细胞被重复利用(即，再循环)的方式进行本发明的方法。宿主细胞可被再循环回原始容器或者再循环入第二容器。优选地，用维生素和/或微量元素补充引入再循环宿主细胞的培养基。

在一种优选的实施方式中，发酵培养基包含1-150g/l、优选5-100g/l、更优选10-80g/l或15-60g/l的量的二羧酸例如琥珀酸。在任何情况下，与基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞相比(当在基本相同的条件下分析时)，本发明的宿主细胞通常能够在发酵培养基中积累更多二羧酸。与基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞相比(当在基本相同的条件下分析时)，本发明的宿主细胞通常会展示出二羧酸(例如琥珀酸)的滴度增加至少1％、更优选至少2％、甚至更优选至少4％、特别地至少5％、更特别地至少6％、例如至少8％、例如至少10％。在该语境中，通过将产生的二羧酸的量除以培养上清液的总体积来计算二羧酸的滴度(二羧酸的g数/上清液的l数)。

在进一步优选的实施方式中，与基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞相比(当在基本相同的条件下分析时)，本发明的宿主细胞通常会展示出二羧酸(例如琥珀酸)的发酵产率提高至少1％、更优选至少2％、甚至更优选至少4％、特别地至少5％、更特别地至少6％、例如至少8％、例如至少10％。在该语境中，通过将产生的二羧酸的量除以消耗的糖的总量(包括在生物质繁殖阶段期间)来计算二羧酸的发酵产率(二羧酸的g数/葡萄糖的g数)。

生产二羧酸的方法可以进一步包括回收二羧酸。可通过本领域已知的任何合适方法来回收二羧酸，例如通过结晶、铵沉淀、离子交换技术、离心或过滤或这些方法的任意合适组合。

在一种优选的实施方式中，回收二羧酸包括：使二羧酸结晶和形成二羧酸晶体。优选地，使二羧酸结晶包括除去部分发酵培养基，优选地通过蒸发，以获得浓缩的培养基。

根据本发明，可以通过从pH为1-5且包含二羧酸的水性溶液结晶所述二羧酸(例如琥珀酸)来回收二羧酸(例如琥珀酸)，包括蒸发部分水性溶液以获得浓缩溶液，将浓缩的溶液的温度降低至5-35℃之间的值，其中二羧酸晶体形成。优选地，结晶包括：使浓缩的培养基的温度达到10-30℃，优选地15-25℃的温度。优选地，包含二羧酸的水性溶液的pH为1.5-4.5，优选地2-4。

已发现，相较于在低于10度的低温下结晶的二羧酸(例如琥珀酸)的晶体，使二羧酸(例如琥珀酸)在较高温度(例如，10-30℃)下结晶产生杂质(例如，有机酸、蛋白质、颜色和/或气味)量更低的二羧酸(例如琥珀酸)的晶体。

相较于在低于10℃或5℃的温度下进行的二羧酸结晶，在更高温度下结晶二羧酸(例如琥珀酸)的另一个优点是：冷却水性溶液需要更少量的能量，从而导致更加经济和可持续的方法。

优选地，结晶二羧酸(例如琥珀酸)包括洗涤二羧酸晶体的步骤。可由pH为1-5的发酵培养基直接将二羧酸(例如琥珀酸)结晶至纯度为至少90重量/重量％，优选地至少95重量/重量％、96重量/重量％、97重量/重量％、或至少98重量/重量％、或99-100重量/重量％。

在一种优选的实施方式中，生产二羧酸的方法还包括：在工业方法中使用二羧酸。

优选地，在根据本发明的方法中制备的二羧酸(例如琥珀酸)被进一步转变为期望的产品。期望的产品可以是例如聚合物，例如聚丁二酸丁二醇酯(PBS)，除冰剂(deicingagent)，食品添加剂，化妆品添加剂或表面活性剂。也就是说，本发明提供了生产产品(例如聚合物，例如聚丁二酸丁二醇酯(PBS)，除冰剂，食品添加剂，化妆品添加剂或表面活性剂)的方法，所述方法包括：如本文所述生产二羧酸；以及在所述产品的生产中使用所述二羧酸。

本发明还提供了宿主细胞基因组中的修饰的用途，所述用途导致至少一个催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷，从而增加宿主细胞中的二羧酸产生。遗传修饰和宿主细胞的优选实施方式如上文所述。

本文中作为现有技术所给出的专利文件或其它材料的引用并不应被认为是承认所述文件或材料在任何一项权利要求的优先权日时是已知的或者其所包含的信息是公知常识的一部分。

本文中陈述的每个引用的公开内容通过引用以整体并入本文中。

通过以下实施例进一步阐释本发明：

实施例

通用的材料和方法

DNA程序

除非另有说明，否则如别处(Sambrook等人,1989,Molecular cloning:alaboratory manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,New York)所述进行标准DNA程序。使用校正酶Phusion聚合酶(Finnzymes)扩增DNA。限制酶来自Invitrogen或New England Biolabs。

琥珀酸生产菌株的MTP发酵

为了确定琥珀酸生产，使菌株一式三份地在湿度振荡器(Infors)中的微量滴定板(MTP)中在30度、550rpm和80％湿度下生长3天。培养基基于Verduyn培养基(Verduyn C,Postma E,Scheffers WA,Van Dijken JP.Yeast,1992Jul；8(7):501-517)，但如下文所述对碳源和氮源进行更改。

表1.MTP预培养基组成

原材料		浓度(g/L)
			半乳糖	C₆H₁₂O₆.H₂O	40.00
尿素	(NH₂)₂CO	2.30
			磷酸二氢钾	KH₂PO₄	3.00
硫酸镁	MgSO₄.7H₂O	0.50
			微量元素溶液a		1.00
维生素溶液b		1.00

^a微量元素溶液

^b维生素溶液

组分	式	浓度(g/kg)
			生物素(D-)	C₁₀H₁₆N₂O₃S	0.05
Ca D(+)泛酸	C₁₈H₃₂CaN₂O₁₀	1.00
			烟酸	C₆H₅NO₂	1.00
肌醇	C₆H₁₂O₆	25.00
			盐酸氯化硫胺	C₁₂H₁₈Cl₂N₄OS.xH₂O	1.00
盐酸吡哆醇	C₈H₁₂ClNO₃	1.00
			对氨基苯甲酸	C₇H₇NO₂	0.20

使用共80μl预培养物接种24孔板中含有1.5％半乳糖作为碳源的2.5ml培养基。使培养物在30℃、550rpm、80％湿度的湿度振荡器(Infors)中生长72小时。生成生物质后，通过将细胞重悬于2.5ml含有葡萄糖作为碳源的矿质培养基中来开始生产实验。在30℃、550rpm、80％湿度的湿度振荡器(Infors)中孵育主要培养物，并在培养48小时后取样。

通过NMR的MTP样品的代谢物分析

对于MTP样品的代谢物分析，将90μl发酵样品上清液与10μl NMR标准品(20g/l马来酸)和100μl 10％D2O溶液混合。将样品冻干，随后溶在1mL D2O中。

使用不具有水抑制的脉冲程序(ZG)，在300K的温度下，使用90度激发脉冲、2.0s的采集时间和40s的放松延迟，在配备有He冷却低温探头、以500MHz的质子频率运行的BESTBruker Avance III光谱仪上记录1D 1H NMR谱。扫描次数设置为8，不使用虚拟扫描。

基于以下信号(δ相对于4,4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸)计算琥珀酸浓度[以g/L计]：

琥珀酸：2.67ppm处的琥珀酸信号(s，4H)；

用于标准品的信号：约6.3ppm处的马来酸峰(S，2H)。

实施例1：构建酵母菌株SUC-947

如WO2013/004670中所述构建Saccharomyces cerevisiae菌株SUC-632。使用菌株SUC-632作为构建菌株SUC-947的起点。菌株SUC-708是通过经典菌株改良获得的菌株SUC-632的突变株。

如下所述将E.coli的延胡索酸酶基因(fumB)转化到菌株SUC-708中。SEQ ID NO：1描述了来自Escherichia coli的延胡索酸酶(fumB)蛋白序列(E.C.4.2.1.2，UniProt检索号为P14407)。如专利申请WO2008/000632中所公开，针对在S.cerevisiae中表达对基因序列进行密码子对优化。终止密码子TAA被修饰为TAAG。FUM_01基因的表达由TDH1启动子(紧接在TDH1基因的起始密码子之前的600bp)和TDH1终止子(紧接在TDH1基因的终止密码子之后的300bp)控制。控制FUM_01表达的TDH1启动子和TDH1终止子序列是来自Saccharomycescerevisiae S288C的天然序列。包括合适的限制位点的合成的启动子-基因序列由GenArt(Regensburg，德国)合成。该合成片段是质粒pSUC223的一部分(图1)。SEQ ID NO：2中描述了pSUC223的完整序列。质粒pSUC223含有KanMX标记，允许选择G418存在下的生长。如Gueldender等人(Nucleic Acids Res.1996年7月1日；24(13):2519-24)所述，可以通过Cre重组酶的作用除去侧翼为lox66和lox71位点(Albert等人,Plant Journal,7(4),649-659)的KanMX标记。TDH1p-fumB-TDH1t和lox66-KanMX-lox71序列的侧翼是允许通过双交换而在YPRCtau3基因座整合的序列，所述YPRCtau3基因座位于染色体XVI上。

使用限制酶ApaLI和XhoI限制切割质粒pSUC223。从琼脂糖凝胶中切出5.408bp的片段，该片段含有5’YPRCtau3侧翼、合成的fumB构建体、侧翼为lox66和lox71位点的KanMX选择标记以及3’YPRCtau3侧翼，并使用Zymoclean^TM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo Research,Irvine,CA,USA)根据制造商的说明进行纯化。

将该片段转化到菌株SUC-708中。在用于选择含有KanMX标记的转化体的补充有200μg G418/毫升的酵母提取物细菌蛋白胨(YEP)2％半乳糖板上选择转化体，产生了多个转化体。通过PCR证实了引入的fumB基因的存在，所述PCR使用可以与SEQ ID NO：2所编码的ORF的编码序列退火的引物序列。正确的转化体之一SUC-708FUM_01#3被命名为SUC-813。

使用SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)(Bendtsen等人,2004,Mol.Biol.,340:783-795)和TargetP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)(Emanuelsson等人,2007,Nature Protocols 2,953-971)分析由YEL047C编码的S.cerevisiae的延胡索酸还原酶FRD1(EC1.3.1.6，UniProt检索号为P32614)是否存在信号序列。S.cerevisiae Frd1蛋白具有多种可能的定位。它含有预测的19个氨基酸的信号肽。去除推定的SP之后，预测的胞质溶胶定位倾向大幅提高。省略19个氨基酸的信号肽的变体描述于SEQ ID NO：3中，其经受了如WO2008/000632中公开的密码子对方法以在S.cerevisiae中表达。终止密码子TAA被修饰为TAAG。FRD1基因的表达由TDH3启动子(紧接在TDH3基因的起始密码子之前的600bp)和TDH3终止子(紧接在TDH3基因的终止密码子之后的300bp)控制。控制FRD1表达的TDH3启动子和TDH3终止子序列是来自Saccharomycescerevisiae S288C的天然序列。包括合适的限制位点的合成的启动子-基因序列由DNA2.0(Menlo Park,CA,USA)合成，并描述于SEQ ID NO：4中。

如图2所示，将经修饰的FRD1基因转化到菌株SUC-813中。使用如PCT/EP2013/055047中所述的“分裂Cre重组酶整合”或“直接Cre重组酶整合”(DCI)方法，用经修饰的FRD1基因置换菌株SUC-813中的PDC6基因。使用Phusion DNA聚合酶(New EnglandBiolabs，USA)根据制造商的说明生成PCR片段。通过使用SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6中描述的引物序列，使用包含SEQ ID NO：4的DNA 2.0的克隆质粒作为模板，来生成PCR片段1。SEQ ID NO：5与PDC6基因的5'区域(其直接位于PDC6基因的起始密码子之前)具有66bp重叠。通过使用SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8中描述的引物序列，使用质粒pSUC228(图3，SEQID NO：9)作为模板，来生成PCR片段2。质粒pSUC228是PCT/EP2013/055047中所述的pSUC227的经修饰版本。质粒pSUC227含有KanMX标记，该标记被诺尔丝菌素(natMX4)标记(Goldstein和McCusker,Yeast.1999年10月；15(14):1541-53)置换，从而产生了pSUC228。通过使用SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11中描述的引物序列，使用(PCT/EP2013/055047中所述的)pSUC225作为模板，来生成PCR片段3。SEQ ID NO：11与PDC6基因的3'区域(其直接位于PDC6基因的终止密码子之后)具有64bp重叠。

利用标准琼脂糖电泳技术检查PCR片段的大小。使用Zymoclean^TM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo Research,Irvine,CA,USA)根据制造商的说明纯化PCR扩增的DNA片段。

通过本领域技术人员已知的方法进行酵母转化。用纯化的PCR片段1、2和3转化S.cerevisiae菌株SUC-813。PCR片段1在其3'端与PCR片段2具有重叠。PCR片段3在其5'端与PCR片段2具有重叠。PCR片段2在其5'端与PCR片段1具有重叠，并在其3'端与PCR片段3具有重叠，从而使得允许所有三个PCR片段的同源重组(图2)。PCR片段1的5'端和PCR片段3的3'端与PDC6基因座同源，使得所有三个PCR片段能够整合在PDC6基因座。这产生了一个由整合在PDC6基因座的PCR片段1至3组成的线性片段(图2)。专利申请WO2013/076280中描述了这种整合方法。

将转化混合物涂布在含有100μg诺尔丝菌素(Jena Bioscience，德国)/ml的YPD-琼脂(每升：10g酵母提取物，20g/l蛋白胨，20g/l右旋糖，20g琼脂)上。在30℃下生长3-5天后，将各个转化体重新划线在含有100μg诺尔丝菌素/ml的新鲜YPD-琼脂板上。

随后，通过PCT/EP2013/055047中所述的方法经由重组有效地移除标记盒和Cre重组酶，从而导致PDC6基因被SEQ ID NO：4置换，并留下lox72位点，这是lox66和lox71位点之间重组的结果。由于Cre重组酶的活性，被引入基因组DNA中以产生菌株SUC-813的侧翼为lox66和lox71位点的KanMX标记也被有效地移除。所产生的无标记菌株被命名为SUC-947。菌株SUC-947能够在YPD-琼脂板上生长，但不能在补充有200μg G418/ml或100μg/ml诺尔丝菌素或两者的YPD-琼脂板上生长，从而证实了KanMX和natMX4标记均被移除。

实施例2：构建酵母菌株SUP-003并通过SUP-003生产琥珀酸

生成PCR片段

使用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs，USA)根据制造商的说明生成PCR片段。通过使用SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21中描述的引物序列，使用基因组DNA作为模板，来生成PCR片段4。SEQ ID NO：21与GUT2基因的5'区域(其直接位于GUT2基因的起始密码子之前)具有27bp重叠。通过使用SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24中描述的引物序列，使用质粒pSUC227(图5，SEQ ID NO：43)作为模板，来生成PCR片段5。通过使用SEQ ID NO：23和SEQID NO：25中描述的引物序列，使用质粒pSUC225(图6，SEQ ID NO：44)作为模板，来生成PCR片段6。通过使用SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27中描述的引物序列，使用基因组DNA作为模板，来生成PCR片段7。SEQ ID NO：26与GUT2基因的3'区域(其直接位于GUT2基因的终止密码子之后)具有29bp重叠。

转化到菌株SUC-947中以构建菌株SUP-003

如实施例1所述构建Saccharomyces cerevisiae菌株SUC-947。使用菌株SUC-947作为构建菌株SUP-003的起点。

通过本领域技术人员已知的方法进行酵母转化。用纯化的PCR片段4、5、6和7转化S.cerevisiae菌株SUC-947。PCR片段4在其3'端与PCR片段5具有重叠。PCR片段7在其5'端与PCR片段6具有重叠。PCR片段5在其5'端与PCR片段4具有重叠，并在其3'端与PCR片段6具有重叠，并且PCR片段6在其5'端与PCR片段5具有重叠，并在其3'端与PCR片段7具有重叠，从而使得允许所有4个PCR片段的同源重组(图4)。PCR片段4的5'端和PCR片段7的3'端与GUT2基因座同源，使得所有4个PCR片段能够整合在GUT2基因座。这产生了一个由整合在GUT2基因座的PCR片段4至7组成的线性片段(图4)。实施例1中描述了这种整合方法。

将转化混合物涂布在含有200μg G418/ml的YPD-琼脂(每升：10g酵母提取物，20g/l蛋白胨，20g/l右旋糖，20g琼脂)上。在30℃下生长3-5天后，将各个转化体重新划线在含有200μg G418/ml的新鲜YPD-琼脂板上。

随后，通过PCT/EP2013/055047中所述的方法经由重组有效地移除标记盒和Cre重组酶，从而导致GUT2基因被缺失，并留下lox72位点，这是lox66和lox71位点之间重组的结果。所产生的无标记菌株被命名为SUP-003。菌株SUP-003能够在YPD-琼脂板上生长，但不能在补充有200μg G418/ml的YPD-琼脂板上生长，从而证实了KanMX标记被移除。

通过SUP-003生产琥珀酸

如通用的材料和方法中所述进行琥珀酸生产实验并测量琥珀酸滴度。如在微量滴定板发酵中所测定的，在SUP-003的上清液中检测到的琥珀酸比在SUC-947的上清液中检测到的琥珀酸多2.5％。

实施例3：构建酵母菌株SUP-001并通过SUP-001生产琥珀酸

生成PCR片段

使用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs，USA)根据制造商的说明生成PCR片段。通过使用SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35中描述的引物序列，使用基因组DNA作为模板，来生成PCR片段8。SEQ ID NO：35与NDE1基因的5'区域(其直接位于NDE1基因的起始密码子之前)具有27bp重叠。通过使用SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：38中描述的引物序列，使用质粒pSUC227(图5，SEQ ID NO：43)作为模板，来生成PCR片段9。通过使用SEQ ID NO：23和SEQID NO：39中描述的引物序列，使用质粒pSUC225(图6，SEQ ID NO：44)作为模板，来生成PCR片段10。通过使用SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37中描述的引物序列，使用基因组DNA作为模板，来生成PCR片段11。SEQ ID NO：36与NDE1基因的3'区域(其直接位于NDE1基因的终止密码子之后)具有18bp重叠。

转化到菌株SUC-947中以构建菌株SUP-001

如实施例1所述构建Saccharomyces cerevisiae菌株SUC-947。使用菌株SUC-947作为构建菌株SUP-001的起点。

通过本领域技术人员已知的方法进行酵母转化。用纯化的PCR片段8、9、10和11转化S.cerevisiae菌株SUC-947。PCR片段8在其3'端与PCR片段9具有重叠。PCR片段11在其5'端与PCR片段10具有重叠。PCR片段9在其5'端与PCR片段8具有重叠，并在其3'端与PCR片段10具有重叠，并且PCR片段10在其5'端与PCR片段9具有重叠，并在其3'端与PCR片段11具有重叠，从而使得允许所有4个PCR片段的同源重组(图7)。PCR片段8的5'端和PCR片段11的3'端与NDE1基因座同源，使得所有4个PCR片段能够整合在NDE1基因座。这产生了一个由整合在NDE1基因座的PCR片段8至11组成的线性片段(图7)。实施例1中描述了这种整合方法。

随后，通过PCT/EP2013/055047中所述的方法经由重组有效地移除标记盒和Cre重组酶，从而导致NDE1基因被缺失，并留下lox72位点，这是lox66和lox71位点之间重组的结果。所产生的无标记菌株被命名为SUP-001。菌株SUP-001能够在YPD-琼脂板上生长，但不能在补充有200μg G418/ml的YPD-琼脂板上生长，从而证实了KanMX标记被移除。

通过SUP-001生产琥珀酸

如通用的材料和方法中所述进行琥珀酸生产实验并测量琥珀酸滴度。如在微量滴定板发酵中所测定的，在SUP-001的上清液中检测到的琥珀酸比在SUC-947的上清液中检测到的琥珀酸多5％。

实施例4：构建酵母菌株SUP-002并通过SUP-002生产琥珀酸

生成PCR片段

使用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs，USA)根据制造商的说明生成PCR片段。通过使用SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29中描述的引物序列，使用基因组DNA作为模板，来生成PCR片段12。SEQ ID NO：29与NDE2基因的5'区域(其直接位于NDE2基因的起始密码子之前)具有27bp重叠。通过使用SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：32中描述的引物序列，使用质粒pSUC227(图5，SEQ ID NO：43)作为模板，来生成PCR片段13。通过使用SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：33中描述的引物序列，使用质粒pSUC225(图6，SEQ ID NO：44)作为模板，来生成PCR片段14。通过使用SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31中描述的引物序列，使用基因组DNA作为模板，来生成PCR片段15。SEQ ID NO：30与NDE2基因的3'区域(其直接位于NDE2基因的终止密码子之后)具有26bp重叠。

转化到菌株SUC-947中以构建菌株SUP-002

如实施例1所述构建Saccharomyces cerevisiae菌株SUC-947。使用菌株SUC-947作为构建菌株SUP-002的起点。

通过本领域技术人员已知的方法进行酵母转化。用纯化的PCR片段12、13、14和15转化S.cerevisiae菌株SUC-947。PCR片段12在其3'端与PCR片段13具有重叠。PCR片段15在其5'端与PCR片段14具有重叠。PCR片段13在其5'端与PCR片段12具有重叠，并在其3'端与PCR片段14具有重叠，并且PCR片段14在其5'端与PCR片段13具有重叠，并在其3'端与PCR片段15具有重叠，从而使得允许所有4个PCR片段的同源重组(图8)。PCR片段12的5'端和PCR片段15的3'端与NDE2基因座同源，使得所有4个PCR片段能够整合在NDE2基因座。这产生了一个由整合在NDE2基因座的PCR片段12至15组成的线性片段(图8)。实施例1中描述了这种整合方法。

随后，通过PCT/EP2013/055047中所述的方法经由重组有效地移除标记盒和Cre重组酶，从而导致NDE2基因被缺失，并留下lox72位点，这是lox66和lox71位点之间重组的结果。所产生的无标记菌株被命名为SUP-002。菌株SUP-002能够在YPD-琼脂板上生长，但不能在补充有200μg G418/ml的YPD-琼脂板上生长，从而证实了KanMX标记被移除。

通过SUP-002生产琥珀酸

如通用的材料和方法中所述进行琥珀酸生产实验并测量琥珀酸滴度。如在微量滴定板发酵中所测定的，在SUP-002的上清液中检测到的琥珀酸比在SUC-947的上清液中检测到的琥珀酸多2.3％。

实施例5：构建酵母菌株SUP-004

转化菌株SUP-001以构建菌株SUP-004

如实施例3所述构建Saccharomyces cerevisiae菌株SUP-001。使用菌株SUP-001作为构建菌株SUP-004的起点。SUP-001包含NDE1缺失。为了产生NDE1、NDE2双重缺失，根据实施例4中所述的方法在SUP-001中缺失NDE2。

实施例6：构建酵母菌株SUP-005

转化菌株SUP-004以构建菌株SUP-005

如实施例5所述构建Saccharomyces cerevisiae菌株SUP-004。使用菌株SUP-004作为构建菌株SUP-005的起点。SUP-004包含NDE1和NDE2双重缺失。为了产生NDE1、NDE2、GUT2三重缺失，根据实施例2中所述的方法在SUP-004中缺失GUT2，从而生成了SUP-005。

实施例7：构建酵母菌株SUP-006

生成PCR片段

使用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs，USA)根据制造商的说明生成PCR片段。通过使用SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46中描述的引物序列，使用基因组DNA作为模板，来生成PCR片段16。SEQ ID NO：46与GPD1基因的5'区域(其直接位于GPD1基因的起始密码子之前)具有27bp重叠。通过使用SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：22中描述的引物序列，使用质粒pSUC227(图5，SEQ ID NO：43)作为模板，来生成PCR片段17。通过使用SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：48中描述的引物序列，使用质粒pSUC225(图6，SEQ ID NO：44)作为模板，来生成PCR片段18。通过使用SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50中描述的引物序列，使用基因组DNA作为模板，来生成PCR片段19。SEQ ID NO：49与GPD1基因的3'区域(其直接位于GPD1基因的终止密码子之后)具有26bp重叠。

转化菌株SUP-005以构建菌株SUP-006

如实施例6所述构建Saccharomyces cerevisiae菌株SUP-005。使用菌株SUP-005作为构建菌株SUP-006的起点。

通过本领域技术人员已知的方法进行酵母转化。用纯化的PCR片段16、17、18和19转化S.cerevisiae菌株SUP-005。PCR片段16在其3'端与PCR片段17具有重叠。PCR片段19在其5'端与PCR片段18具有重叠。PCR片段17在其5'端与PCR片段16具有重叠，并在其3'端与PCR片段18具有重叠，并且PCR片段18在其5'端与PCR片段17具有重叠，并在其3'端与PCR片段19具有重叠，从而使得允许所有4个PCR片段的同源重组(图9)。PCR片段16的5'端和PCR片段19的3'端与GPD1基因座同源，使得所有4个PCR片段能够整合在GPD1基因座。这产生了一个由整合在GPD1基因座的PCR片段16至19组成的线性片段(图9)。实施例1中描述了这种整合方法。

随后，通过PCT/EP2013/055047中所述的方法经由重组有效地移除标记盒和Cre重组酶，从而导致GPD1基因被缺失，并留下lox72位点，这是lox66和lox71位点之间重组的结果。所产生的无标记菌株被命名为SUP-006。菌株SUP-006能够在YPD-琼脂板上生长，但不能在补充有200μg G418/ml的YPD-琼脂板上生长，从而证实了KanMX标记被移除。

实施例8：构建酵母菌株SUP-007

生成PCR片段

使用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs，USA)根据制造商的说明生成PCR片段。通过使用SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52中描述的引物序列，使用基因组DNA作为模板，来生成PCR片段20。SEQ ID NO：52与GPD2基因的5'区域(其直接位于GPD2基因的起始密码子之前)具有27bp重叠。通过使用SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：22中描述的引物序列，使用质粒pSUC227(图5，SEQ ID NO：43)作为模板，来生成PCR片段21。通过使用SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：54中描述的引物序列，使用质粒pSUC225(图6，SEQ ID NO：44)作为模板，来生成PCR片段22。通过使用SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56中描述的引物序列，使用基因组DNA作为模板，来生成PCR片段23。SEQ ID NO：55与GPD2基因的3'区域(其直接位于GPD2基因的终止密码子之后)具有26bp重叠。

转化菌株SUP-006以构建菌株SUP-007

如实施例7所述构建Saccharomyces cerevisiae菌株SUP-006。使用菌株SUP-006作为构建菌株SUP-007的起点。

通过本领域技术人员已知的方法进行酵母转化。用纯化的PCR片段20、21、22和23转化S.cerevisiae菌株SUP-006。PCR片段20在其3'端与PCR片段21具有重叠。PCR片段23在其5'端与PCR片段22具有重叠。PCR片段21在其5'端与PCR片段20具有重叠，并在其3'端与PCR片段22具有重叠，并且PCR片段22在其5'端与PCR片段21具有重叠，并在其3'端与PCR片段23具有重叠，从而使得允许所有4个PCR片段的同源重组(图10)。PCR片段20的5'端和PCR片段23的3'端与GPD2基因座同源，使得所有4个PCR片段能够整合在GPD2基因座。这产生了一个由整合在GPD2基因座的PCR片段20至23组成的线性片段(图10)。实施例1中描述了这种整合方法。

随后，通过PCT/EP2013/055047中所述的方法经由重组有效地移除标记盒和Cre重组酶，从而导致GPD2基因被缺失，并留下lox72位点，这是lox66和lox71位点之间重组的结果。所产生的无标记菌株被命名为SUP-007。菌株SUP-007能够在YPD-琼脂板上生长，但不能在补充有200μg G418/ml的YPD-琼脂板上生长，从而证实了KanMX标记被移除。

实施例9：在SUP-005和SUP-007中生产琥珀酸

在摇瓶(50ml)中在30℃和280rpm下培养SUC-947、SUP-005和SUP-007酵母菌株3天。培养基基于Verduyn等人(Verduyn C,Postma E,Scheffers WA,Van Dijken JP.Yeast,1992Jul；8(7):501-517)，碳源和氮源有更改，如下文所述。

表2.预培养基组成

原材料		浓度(g/kg)
			半乳糖	C₆H₁₂O₆.H₂O	20.00
尿素	(NH₂)₂CO	2.30
			磷酸二氢钾	KH₂PO₄	3.00
硫酸镁	MgSO₄.7H₂O	0.50
			微量元素溶液^a		1.00
维生素溶液^b		1.00
			白垩	CaCO3	1.00

^a微量元素溶液

^b维生素溶液

随后，将约3ml摇瓶的内容物转移到含有表3中所示培养基的种子发酵罐(起始体积为0.3kg，1％接种强度)中。

表3.种子发酵罐的培养基组成

原材料		浓度(g/kg)
			硫酸铵	(NH₄)₂SO₄	1.00
磷酸二氢钾	KH₂PO₄	10.00
			硫酸镁	MgSO₄.7H₂O	5.00
微量元素溶液	-	8.00
			维生素溶液	-	8.00

通过添加氨水(10重量％)将pH控制在5.0。温度控制在30℃。通过调节搅拌器速度将pO₂控制在25％(相对于空气饱和度)。应用的总气流为18NL/h。保持葡萄糖浓度受进入发酵罐的受控进料所限制(应用指数(exponent)0.15)。

发酵68小时后，将80g种子发酵罐中的培养液转移至生产发酵罐(起始体积为0.4kg)，其含有表4中所示培养基。

表4.生产发酵罐的培养基组成

不应用pH控制，因为最初加入的CaCO₃使培养基的pH缓冲在5-5.5。作为自然酸化的结果，在发酵结束时，pH降至3。将温度控制在30℃。应用的总气流为12NL/h，50％空气和50％CO₂。保持葡萄糖浓度受进入发酵罐的受控进料(进料中的葡萄糖浓度为423g/kg)所限制(0-9h：5.6ml/h g/L/h；>9h：进料以ml/h计＝(0.0003*(t)^2-0.1028*(t)+7.8991)*4/5)。需要时，相应地调节这些速率。

在发酵48小时后利用NMR分析葡萄糖和琥珀酸。将发酵样品的上清液在MilliQ水中稀释两次(1:1)。

准确称量约500mg样品到合适的小瓶中，并称量约500mg内标溶液(包含在D₂O中的10g/l马来酸)到该小瓶中。随后将小瓶置于预热的水浴(100度)中并使样品沸腾10分钟。将材料冻干并溶解在1mL含有痕量DSS(4,4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸)的D₂O中。

基于以下信号(δ相对于4,4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸)计算苹果酸浓度[以g/L计]：

苹果酸：2.92ppm处的苹果酸信号的第一dd，n＝1H(苹果酸α-CH2信号为ddd,2.89ppm,2H J＝4Hz,J＝17Hz,J＝44Hz)。

琥珀酸：2.67ppm处的琥珀酸信号(s，4H)；

用于标准品的信号：约6.3ppm处的马来酸峰(S，2H)。

Bharti等人,2012,TrAC Trends in Analytical Chemistry 35:5-26描述了通过NMR定量。

通过将产生的琥珀酸的量除以消耗的糖的总量(包括在生物质繁殖阶段期间)来计算发酵产率(琥珀酸的g数/葡萄糖的g数)。

如在受控补料分批发酵中所测定的，与SUC-947相比，含有nde1、nde2、gut2三重缺失的菌株SUP-005显示出琥珀酸的发酵产率提高2％。编码线粒体外部NADH脱氢酶(例如nde1和/或nde2)和线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶(例如gut2)的基因的缺失的组合显示出对宿主细胞中琥珀酸的发酵产率具有有益的影响。

如在受控补料分批发酵中所测定的，与SUC-947相比，含有nde1、nde2、gut2、gpd1和gpd2五重缺失的菌株SUP-007显示出琥珀酸的发酵产率进一步提高；即提高6％。如在受控补料分批发酵中所测定的，与SUC-947相比，琥珀酸滴度显示出增加6％。编码胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶的基因的缺失(例如gpd1和/或gpd2缺失)显示出对宿主细胞中琥珀酸的滴度和发酵产率具有进一步有益的影响。

序列表

<110> 帝斯曼知识产权资产管理有限公司

<120> 用于二羧酸生产的宿主细胞

<160> 70

<170> BiSSAP 1.2

<210> 1

<211> 548

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 1

Met Ser Asn Lys Pro Phe Ile Tyr Gln Ala Pro Phe Pro Met Gly Lys

1 5 10 15

Asp Asn Thr Glu Tyr Tyr Leu Leu Thr Ser Asp Tyr Val Ser Val Ala

20 25 30

Asp Phe Asp Gly Glu Thr Ile Leu Lys Val Glu Pro Glu Ala Leu Thr

35 40 45

Leu Leu Ala Gln Gln Ala Phe His Asp Ala Ser Phe Met Leu Arg Pro

50 55 60

Ala His Gln Lys Gln Val Ala Ala Ile Leu His Asp Pro Glu Ala Ser

65 70 75 80

Glu Asn Asp Lys Tyr Val Ala Leu Gln Phe Leu Arg Asn Ser Glu Ile

85 90 95

Ala Ala Lys Gly Val Leu Pro Thr Cys Gln Asp Thr Gly Thr Ala Ile

100 105 110

Ile Val Gly Lys Lys Gly Gln Arg Val Trp Thr Gly Gly Gly Asp Glu

115 120 125

Glu Thr Leu Ser Lys Gly Val Tyr Asn Thr Tyr Ile Glu Asp Asn Leu

130 135 140

Arg Tyr Ser Gln Asn Ala Ala Leu Asp Met Tyr Lys Glu Val Asn Thr

145 150 155 160

Gly Thr Asn Leu Pro Ala Gln Ile Asp Leu Tyr Ala Val Asp Gly Asp

165 170 175

Glu Tyr Lys Phe Leu Cys Val Ala Lys Gly Gly Gly Ser Ala Asn Lys

180 185 190

Thr Tyr Leu Tyr Gln Glu Thr Lys Ala Leu Leu Thr Pro Gly Lys Leu

195 200 205

Lys Asn Phe Leu Val Glu Lys Met Arg Thr Leu Gly Thr Ala Ala Cys

210 215 220

Pro Pro Tyr His Ile Ala Phe Val Ile Gly Gly Thr Ser Ala Glu Thr

225 230 235 240

Asn Leu Lys Thr Val Lys Leu Ala Ser Ala His Tyr Tyr Asp Glu Leu

245 250 255

Pro Thr Glu Gly Asn Glu His Gly Gln Ala Phe Arg Asp Val Gln Leu

260 265 270

Glu Gln Glu Leu Leu Glu Glu Ala Gln Lys Leu Gly Leu Gly Ala Gln

275 280 285

Phe Gly Gly Lys Tyr Phe Ala His Asp Ile Arg Val Ile Arg Leu Pro

290 295 300

Arg His Gly Ala Ser Cys Pro Val Gly Met Gly Val Ser Cys Ser Ala

305 310 315 320

Asp Arg Asn Ile Lys Ala Lys Ile Asn Arg Glu Gly Ile Trp Ile Glu

325 330 335

Lys Leu Glu His Asn Pro Gly Gln Tyr Ile Pro Gln Glu Leu Arg Gln

340 345 350

Ala Gly Glu Gly Glu Ala Val Lys Val Asp Leu Asn Arg Pro Met Lys

355 360 365

Glu Ile Leu Ala Gln Leu Ser Gln Tyr Pro Val Ser Thr Arg Leu Ser

370 375 380

Leu Thr Gly Thr Ile Ile Val Gly Arg Asp Ile Ala His Ala Lys Leu

385 390 395 400

Lys Glu Leu Ile Asp Ala Gly Lys Glu Leu Pro Gln Tyr Ile Lys Asp

405 410 415

His Pro Ile Tyr Tyr Ala Gly Pro Ala Lys Thr Pro Ala Gly Tyr Pro

420 425 430

Ser Gly Ser Leu Gly Pro Thr Thr Ala Gly Arg Met Asp Ser Tyr Val

435 440 445

Asp Leu Leu Gln Ser His Gly Gly Ser Met Ile Met Leu Ala Lys Gly

450 455 460

Asn Arg Ser Gln Gln Val Thr Asp Ala Cys His Lys His Gly Gly Phe

465 470 475 480

Tyr Leu Gly Ser Ile Gly Gly Pro Ala Ala Val Leu Ala Gln Gln Ser

485 490 495

Ile Lys His Leu Glu Cys Val Ala Tyr Pro Glu Leu Gly Met Glu Ala

500 505 510

Ile Trp Lys Ile Glu Val Glu Asp Phe Pro Ala Phe Ile Leu Val Asp

515 520 525

Asp Lys Gly Asn Asp Phe Phe Gln Gln Ile Val Asn Lys Gln Cys Ala

530 535 540

Asn Cys Thr Lys

545

<210> 2

<211> 8074

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> source

<222> 1..8074

<223> /organism="Artificial sequence"

/note="Sequence of plasmid pSUC223"

/mol_type="unassigned DNA"

<400> 2

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcttaa 240

ttaaaggagg tgcacgcatt atggagacca ctacgatacg atagctgcgt tgttgttgaa 300

ggggtttctt aaggttgttt tcgttgaagg taaatattgg tcgtttttgt gcagcatatt 360

gtcctctaga tgcaaactct gcaggtccat ttgcagtaaa gtgagttgcc tctcgaagaa 420

tcattaattt cgtataaccg tcactattaa agtcagaaaa taaattctgt cgtagacaat 480

gttaccataa tgttcttgtc cattttgcat acactttaaa tattcatttg atttctcagg 540

gttcatgatc ataataaatt gcgcattcgc aaggcggtag tattataatg gggtccatca 600

ttctgtagca agaagttaca gtacgctgtt caagcgttaa acaagataag taatctcgaa 660

tgaaacattc atatttcgca tgagccaaca tacagttgct gagtaatctt cattgcgctt 720

atttatcggc attgagattg taaaggaagt aaaacgcatt tttgcagatc tgttctctta 780

tgtattttta atcgtccttg tatggaagta tcaaagggga cgttcttcac ctccttggaa 840

ggatcccagc gccagtaggg ttgttgagct tagtaaaaat gtgcgcacca caagcctaca 900

tgactccacg tcacatgaaa ccacaccgtg gggccttgtt gcgctaggaa taggatatgc 960

gacgaagacg cttctgctta gtaaccacac cacattttca gggggtcgat ctgcttgctt 1020

cctttactgt cacgagcggc ccataatcgc gctttttttt taaaaggcgc gagacagcaa 1080

acaggaagct cgggtttcaa ccttcggagt ggtcgcagat ctggagactg gatctttaca 1140

atacagtaag gcaagccacc atctgcttct taggtgcatg cgacggtatc cacgtgcaga 1200

acaacatagt ctgaagaagg gggggaggag catgttcatt ctctgtagca gtaagagctt 1260

ggtgataatg accaaaactg gagtctcgaa atcatataaa tagacaatat attttcacac 1320

aatgagattt gtagtacagt tctattctct ctcttgcata aataagaaat tcatcaagaa 1380

cttggtttga tatttcacca acacacacaa aaaacagtac ttcactaaat ttacacacaa 1440

aacaaaatgt ccaacaagcc tttcatctac caagctccat tcccaatggg taaggacaac 1500

actgaatact acttgttgac ttctgactac gtttccgttg ctgatttcga tggtgaaacc 1560

atcttgaagg ttgaaccaga agccttgact ttgttggctc aacaagcctt ccacgatgct 1620

tctttcatgt tgcgtccagc tcaccaaaag caagttgctg ccattttgca cgacccagaa 1680

gcctccgaaa acgacaaata cgttgctttg caattcttga gaaactctga aattgctgcc 1740

aagggtgtct taccaacttg tcaagacact ggtactgcca tcattgtcgg taagaagggt 1800

caaagagtct ggaccggtgg tggtgacgaa gaaactctat ccaagggtgt ttacaacact 1860

tacattgaag ataatttacg ttactctcaa aatgctgctt tggacatgta caaggaagtc 1920

aacactggta ccaacttgcc agctcaaatc gacttatacg ctgttgacgg tgacgaatac 1980

aagttcttgt gtgttgccaa gggtggtggt tctgctaaca agacctactt gtaccaagaa 2040

accaaggctt tgttgactcc aggtaaattg aagaacttct tggtcgaaaa gatgagaact 2100

ttgggtactg ctgcttgtcc accataccac attgctttcg ttatcggtgg tacttccgct 2160

gaaaccaact tgaaaaccgt caaattggct tccgctcact actacgatga attgccaact 2220

gaaggtaacg aacacggtca agccttcaga gatgtccaat tggaacaaga attgttggaa 2280

gaagctcaaa aattaggttt gggtgctcaa tttggtggta aatactttgc tcacgatatc 2340

agagttatca gattaccaag acatggtgct tcttgtccag ttggtatggg tgtttcctgt 2400

tctgctgaca gaaacatcaa ggccaagatc aacagagaag gtatctggat tgaaaaattg 2460

gaacacaacc caggtcaata catcccacaa gaattgagac aagctggtga aggtgaagct 2520

gtcaaggttg acttgaacag accaatgaag gaaatcttgg ctcaattatc tcaataccca 2580

gtttccacca gattatcttt gaccggtacc atcattgtcg gtcgtgacat tgctcatgcc 2640

aagttgaagg aattgattga tgctggtaag gaattgcctc aatacatcaa ggaccatcca 2700

atctactacg ctggtccagc caagacccca gctggttacc catctggttc tttgggtcca 2760

accaccgctg gtagaatgga ctcttacgtt gacttgctac aatctcacgg tggttccatg 2820

atcatgttgg ctaagggtaa cagatctcaa caagtcaccg atgcttgtca caagcacggt 2880

ggtttctatt tgggttccat tggtggtcca gctgctgtct tggctcaaca atctatcaag 2940

cacttggaat gtgttgctta cccagaattg ggtatggaag ccatctggaa gattgaagtc 3000

gaagatttcc cagctttcat cttagtcgat gacaagggta acgacttctt ccaacaaatt 3060

gtcaacaagc aatgtgccaa ctgtaccaag taagcgtacg ataaagcaat cttgatgagg 3120

ataatgattt ttttttgaat atacataaat actaccgttt ttctgctaga ttttgtgaag 3180

acgtaaataa gtacatatta ctttttaagc caagacaaga ttaagcatta actttaccct 3240

tttctcttct aagtttcaat actagttatc actgtttaaa agttatggcg agaacgtcgg 3300

cggttaaaat atattaccct gaacgtggtg aattgaagtt ctaggatggt ttaaagattt 3360

ttcctttttg ggaaataagt aaacaatata ttgctgcctt ggcgcgcccc ttccgggccc 3420

acgcgtggcc ggccgcggcc gccagctgaa gcttcgtacg ctgcaggtcg acgaattcta 3480

ccgttcgtat aatgtatgct atacgaagtt atagatctgt ttagcttgcc tcgtccccgc 3540

cgggtcaccc ggccagcgac atggaggccc agaataccct ccttgacagt cttgacgtgc 3600

gcagctcagg ggcatgatgt gactgtcgcc cgtacattta gcccatacat ccccatgtat 3660

aatcatttgc atccatacat tttgatggcc gcacggcgcg aagcaaaaat tacggctcct 3720

cgctgcagac ctgcgagcag ggaaacgctc ccctcacaga cgcgttgaat tgtccccacg 3780

ccgcgcccct gtagagaaat ataaaaggtt aggatttgcc actgaggttc ttctttcata 3840

tacttccttt taaaatcttg ctaggataca gttctcacat cacatccgaa cataaacaac 3900

catgggtaag gaaaagactc acgtttcgag gccgcgatta aattccaaca tggatgctga 3960

tttatatggg tataaatggg ctcgcgataa tgtcgggcaa tcaggtgcga caatctatcg 4020

attgtatggg aagcccgatg cgccagagtt gtttctgaaa catggcaaag gtagcgttgc 4080

caatgatgtt acagatgaga tggtcagact aaactggctg acggaattta tgcctcttcc 4140

gaccatcaag cattttatcc gtactcctga tgatgcatgg ttactcacca ctgcgatccc 4200

cggcaaaaca gcattccagg tattagaaga atatcctgat tcaggtgaaa atattgttga 4260

tgcgctggca gtgttcctgc gccggttgca ttcgattcct gtttgtaatt gtccttttaa 4320

cagcgatcgc gtatttcgtc tcgctcaggc gcaatcacga atgaataacg gtttggttga 4380

tgcgagtgat tttgatgacg agcgtaatgg ctggcctgtt gaacaagtct ggaaagaaat 4440

gcataagctt ttgccattct caccggattc agtcgtcact catggtgatt tctcacttga 4500

taaccttatt tttgacgagg ggaaattaat aggttgtatt gatgttggac gagtcggaat 4560

cgcagaccga taccaggatc ttgccatcct atggaactgc ctcggtgagt tttctccttc 4620

attacagaaa cggctttttc aaaaatatgg tattgataat cctgatatga ataaattgca 4680

gtttcatttg atgctcgatg agtttttcta atcagtactg acaataaaaa gattcttgtt 4740

ttcaagaact tgtcatttgt atagtttttt tatattgtag ttgttctatt ttaatcaaat 4800

gttagcgtga tttatatttt ttttcgcctc gacatcatct gcccagatgc gaagttaagt 4860

gcgcagaaag taatatcatg cgtcaatcgt atgtgaatgc tggtcgctat actgctgtcg 4920

attcgatact aacgccgcca tccagtgtcg aaaacgagct cataacttcg tataatgtat 4980

gctatacgaa cggtagaatt cgaatcagat ccactagtgg cctatgcggc cgcgatggga 5040

cgtcagcact gtacttgttt ttgcgactag attgtaaatc attctttatt taatctcttt 5100

ctttaactac tgcttaaagt ataatttggt ccgtagttta ataactatac taagcgtaac 5160

aatgcatact gacattataa gcctgaacat tacgagttta agttgtatgt aggcgttctg 5220

taagaggtta ctgcgtaaat tatcaacgaa tgcattggtg tatttgcgaa agctacttct 5280

tttaacaagt atttacataa gaataatggt gatctgctca actgatttgg tgataactct 5340

aactttttta gcaacaattt aaaagataat tcgaacatat ataacagtag gaagaatttg 5400

tgtacgtcaa attaagataa tttagcatta ccaaagttat taacctaaac ataaaatata 5460

tatgagacac atgtggaaat cgtatgaaac aactgttatg aaactgacaa gaatgaatat 5520

atagagtaag ctccgcttgt aaagaggaat cacttaagtg tataaatgtc tcgacgatta 5580

ctttagatcc aagattgatg attgatatta ctctgtaata cttaagctct tttaatagct 5640

cactgttgta ttacgggctc gagtaatacc ggaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc 5700

gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg 5760

ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc 5820

tgaatggcga atggcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac 5880

accgcatatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc 5940

gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt 6000

acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac 6060

cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga 6120

taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 6180

tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 6240

aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 6300

ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 6360

aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 6420

acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 6480

ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 6540

gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 6600

atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 6660

acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 6720

tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 6780

ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 6840

aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 6900

aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 6960

ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 7020

atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 7080

aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 7140

accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 7200

tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 7260

tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 7320

tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 7380

cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 7440

caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 7500

cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 7560

cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 7620

gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 7680

acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 7740

atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 7800

cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 7860

gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 7920

tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg 7980

tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg 8040

agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aaga 8074

<210> 3

<211> 452

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Modified protein sequence of YEL047c encoding FRD1 (E.C. 1.3.1.6,

UniProt accession number P32614)

<400> 3

Met Asn Glu Leu Val Asn Lys Tyr Asn Ile Pro Val Thr Ile Leu Glu

1 5 10 15

Lys Ala Ser Ser Ile Gly Gly Asn Ser Ile Lys Ala Ser Ser Gly Ile

20 25 30

Asn Gly Ala Cys Thr Glu Thr Gln Arg His Phe His Ile Glu Asp Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Phe Glu Asp Asp Thr Ile Lys Ser Ala Lys Gly Lys Gly

50 55 60

Val Gln Glu Leu Met Ala Lys Leu Ala Asn Asp Ser Pro Leu Ala Ile

65 70 75 80

Glu Trp Leu Lys Asn Glu Phe Asp Leu Lys Leu Asp Leu Leu Ala Gln

85 90 95

Leu Gly Gly His Ser Val Ala Arg Thr His Arg Ser Ser Gly Lys Leu

100 105 110

Pro Pro Gly Phe Glu Ile Val Ser Ala Leu Ser Asn Asn Leu Lys Lys

115 120 125

Leu Ala Glu Thr Lys Pro Glu Leu Val Lys Ile Asn Leu Asp Ser Lys

130 135 140

Val Val Asp Ile His Glu Lys Asp Gly Ser Ile Ser Ala Val Val Tyr

145 150 155 160

Glu Asp Lys Asn Gly Glu Lys His Met Val Ser Ala Asn Asp Val Val

165 170 175

Phe Cys Ser Gly Gly Phe Gly Phe Ser Lys Glu Met Leu Lys Glu Tyr

180 185 190

Ala Pro Glu Leu Val Asn Leu Pro Thr Thr Asn Gly Gln Gln Thr Thr

195 200 205

Gly Asp Gly Gln Arg Leu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Asp Leu Ile Asp

210 215 220

Met Asp Gln Ile Gln Val His Pro Thr Gly Phe Ile Asp Pro Asn Asp

225 230 235 240

Arg Ser Ser Ser Trp Lys Phe Leu Ala Ala Glu Ser Leu Arg Gly Leu

245 250 255

Gly Gly Ile Leu Leu Asn Pro Ile Thr Gly Arg Arg Phe Val Asn Glu

260 265 270

Leu Thr Thr Arg Asp Val Val Thr Ala Ala Ile Gln Lys Val Cys Pro

275 280 285

Gln Glu Asp Asn Arg Ala Leu Leu Val Met Gly Glu Lys Met Tyr Thr

290 295 300

Asp Leu Lys Asn Asn Leu Asp Phe Tyr Met Phe Lys Lys Leu Val Gln

305 310 315 320

Lys Leu Thr Leu Ser Gln Val Val Ser Glu Tyr Asn Leu Pro Ile Thr

325 330 335

Val Ala Gln Leu Cys Glu Glu Leu Gln Thr Tyr Ser Ser Phe Thr Thr

340 345 350

Lys Ala Asp Pro Leu Gly Arg Thr Val Ile Leu Asn Glu Phe Gly Ser

355 360 365

Asp Val Thr Pro Glu Thr Val Val Phe Ile Gly Glu Val Thr Pro Val

370 375 380

Val His Phe Thr Met Gly Gly Ala Arg Ile Asn Val Lys Ala Gln Val

385 390 395 400

Ile Gly Lys Asn Asp Glu Arg Leu Leu Lys Gly Leu Tyr Ala Ala Gly

405 410 415

Glu Val Ser Gly Gly Val His Gly Ala Asn Arg Leu Gly Gly Ser Ser

420 425 430

Leu Leu Glu Cys Val Val Phe Gly Arg Thr Ala Ala Glu Ser Ile Ala

435 440 445

Asn Asp Arg Lys

450

<210> 4

<211> 2260

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> source

<222> 1..2260

<223> /organism="Artificial sequence"

/note="Synthetic TDH3p-FRD1-TDH3t gene"

/mol_type="unassigned DNA"

<400> 4

ttagtcaaaa aattagcctt ttaattctgc tgtaacccgt acatgcccaa aatagggggc 60

gggttacaca gaatatataa catcgtaggt gtctgggtga acagtttatt cctggcatcc 120

actaaatata atggagcccg ctttttaagc tggcatccag aaaaaaaaag aatcccagca 180

ccaaaatatt gttttcttca ccaaccatca gttcataggt ccattctctt agcgcaacta 240

cagagaacag gggcacaaac aggcaaaaaa cgggcacaac ctcaatggag tgatgcaacc 300

tgcctggagt aaatgatgac acaaggcaat tgacccacgc atgtatctat ctcattttct 360

tacaccttct attaccttct gctctctctg atttggaaaa agctgaaaaa aaaggttgaa 420

accagttccc tgaaattatt cccctacttg actaataagt atataaagac ggtaggtatt 480

gattgtaatt ctgtaaatct atttcttaaa cttcttaaat tctactttta tagttagtct 540

tttttttagt tttaaaacac caagaactta gtttcgaata aacacacata aacaaacaaa 600

atgaacgaat tagtcaacaa atacaacatt ccagtcacca ttttggaaaa ggcttcttcc 660

attggtggta actccatcaa ggcttcctcc ggtatcaacg gtgcttgtac cgaaactcaa 720

agacatttcc acattgaaga ttctccaaga ttgtttgaag atgacaccat caaatctgcc 780

aagggtaagg gtgtccaaga attgatggcc aagttggcta acgactctcc attggccatt 840

gaatggttga aaaatgaatt cgacttgaaa ttggacttgt tggctcaatt aggtggtcac 900

tccgttgcca gaactcaccg ttcttctggt aagttgccac caggtttcga aattgtttct 960

gctttgtcca acaacttgaa gaaattggct gaaaccaagc cagaattggt caagatcaac 1020

ttggactcca aggttgtcga tatccacgaa aaggacggtt ccatctctgc tgttgtttac 1080

gaagataaga acggtgaaaa gcacatggtt tctgctaacg atgttgtctt ttgttctggt 1140

ggtttcggtt tctccaagga aatgttgaag gaatacgctc cagaattggt caacttgcca 1200

accaccaacg gtcaacaaac cactggtgat ggtcaaagat tactacaaaa gttgggtgct 1260

gacttgattg acatggacca aatccaagtt cacccaactg gtttcattga cccaaacgac 1320

cgttcttctt cctggaaatt cttggctgct gaatctttga gaggtttggg tggtatcttg 1380

ttgaacccaa tcactggtag aagatttgtc aatgaattga ccaccagaga tgtcgttacc 1440

gctgccatcc aaaaggtctg tccacaagaa gataacagag ctttgttggt catgggtgaa 1500

aagatgtaca ctgacttgaa gaacaacttg gacttctaca tgttcaagaa gttggttcaa 1560

aagttgactt tatctcaagt tgtttctgaa tacaacttgc caatcactgt tgctcaatta 1620

tgtgaagaat tgcaaactta ctcctctttc accaccaagg ctgacccttt gggtagaacc 1680

gttatcttga acgaattcgg ttctgatgtc actccagaaa ctgttgtttt catcggtgaa 1740

gtcactccag ttgtccactt caccatgggt ggtgccagaa tcaacgtcaa ggctcaagtt 1800

atcggtaaga acgatgaaag attattgaag ggtttatacg ctgctggtga agtctctggt 1860

ggtgtccacg gtgctaacag attaggtggt tcctctctat tggaatgtgt tgttttcggt 1920

agaactgctg ctgaatccat tgccaacgac cgcaagtaag gtgaatttac tttaaatctt 1980

gcatttaaat aaattttctt tttatagctt tatgacttag tttcaattta tatactattt 2040

taatgacatt ttcgattcat tgattgaaag ctttgtgttt tttcttgatg cgctattgca 2100

ttgttcttgt ctttttcgcc acatgtaata tctgtagtag atacctgata cattgtggat 2160

gctgagtgaa attttagtta ataatggagg cgctcttaat aattttgggg atattggctt 2220

ttttttttaa agtttacaaa tgaatttttt ccgccaggat 2260

<210> 5

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> source

<222> 1..84

<223> /organism="Artificial sequence"

/note="Primer 1 (TDH3p FW with PDC6 5' overhang)"

/mol_type="unassigned DNA"

<400> 5

gtcctctttt atatacagta taaataaaaa acccacgtaa tatagcaaaa acatattgcc 60

aacaaattag tcaaaaaatt agcc 84

<210> 6

<211> 82

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> source

<222> 1..82

<223> /organism="Artificial sequence"

/note="Primer 2 (TDH3t REV with overhang to pSUC228 Cre-1)"

/mol_type="unassigned DNA"

<400> 6

cgctatactg atttaaatat aacttcgtat agcatacatt atacgaacgg tactcgaggt 60

cgaatcctgg cggaaaaaat tc 82

<210> 7

<211> 86

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> source

<222> 1..86

<223> /organism="Artificial sequence"

/note="Primer 3 (pSUC228 Cre-1 FW with overhang TDH3t)"

/mol_type="unassigned DNA"

<400> 7

cttaataatt ttggggatat tggctttttt ttttaaagtt tacaaatgaa ttttttccgc 60

caggattcga cctcgagtac cgttcg 86

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> source

<222> 1..21

<223> /organism="Artificial sequence"

/note="Primer 4 (DBC-03373, pSUC228 Cre-1 REV)"

/mol_type="unassigned DNA"

<400> 8

gcaatttcgg ctatacgtaa c 21

<210> 9

<211> 4780

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> source

<222> 1..4780

<223> /organism="Artificial sequence"

/note="Sequence of plasmid pSUC228"

/mol_type="unassigned DNA"

<400> 9

aaatagcttg ccttgtcccc gccgggtcac ccggccagcg acatggaggc ccagaatacc 60

ctccttgaca gtcttgacgt gcgcagctca ggggcatgat gtgactgtcg cccgtacatt 120

tagcccatac atccccatgt ataatcattt gcatccatac attttgatgg ccgcacggcg 180

cgaagcaaaa attacggctc ctcgctgcag acctgcgagc agggaaacgc tcccctcaca 240

gacgcgttga attgtcccca cgccgcgccc ctgtagagaa atataaaagg ttaggatttg 300

ccactgaggt tcttctttca tatacttcct tttaaaatct tgctaggata cagttctcac 360

atcacatccg aacataaaca accatgggta ccactcttga cgacacggct taccggtacc 420

gcaccagtgt cccgggggac gccgaggcca tcgaggcact ggatgggtcc ttcaccaccg 480

acaccgtctt ccgcgtcacc gccaccgggg acggcttcac cctgcgggag gtgccggtgg 540

acccgcccct gaccaaggtg ttccccgacg acgaatcgga cgacgaatcg gacgacgggg 600

aggacggcga cccggactcc cggacgttcg tcgcgtacgg ggacgacggc gacctggcgg 660

gcttcgtggt cgtctcgtac tccggctgga accgccggct gaccgtcgag gacatcgagg 720

tcgccccgga gcaccggggg cacggggtcg ggcgcgcgtt gatggggctc gcgacggagt 780

tcgcccgcga gcggggcgcc gggcacctct ggctggaggt caccaacgtc aacgcaccgg 840

cgatccacgc gtaccggcgg atggggttca ccctctgcgg cctggacacc gccctgtacg 900

acggcaccgc ctcggacggc gagcaggcgc tctacatgag catgccctgc ccctaatcag 960

tactgacaat aaaaagattc ttgttttcaa gaacttgtca tttgtatagt ttttttatat 1020

tgtagttgtt ctattttaat caaatgttag cgtgatttat attttttttc gcctcgacat 1080

catctgccca gatgcgaagt taagtgcgca gaaagtaata tcatgcgtca atcgtatgtg 1140

aatgctggtc gctatactgc tgtcgattcg atactaacgc cgccatccag tgtcgattta 1200

aatctagtac ggattagaag ccgccgagcg ggtgacagcc ctccgaagga agactctcct 1260

ccgtgcgtcc tcgtcttcac cggtcgcgtt cctgaaacgc agatgtgcct cgcgccgcac 1320

tgctccgaac aataaagatt ctacaatact agcttttatg gttatgaaga ggaaaaattg 1380

gcagtaacct ggccccacaa accttcaaat gaacgaatca aattaacaac cataggatga 1440

taatgcgatt agttttttag ccttatttct ggggtaatta atcagcgaag cgatgatttt 1500

tgatctatta acagatatat aaatgcaaaa actgcataac cactttaact aatactttca 1560

acattttcgg tttgtattac ttcttattca aatgtaataa aagtatcaac aaaaaattgt 1620

taatatacct ctatacttta acgtcaagga gaaaaaaccc cggattctag aactagtgga 1680

tcccccgggc tgcaggaatt cgatatcaag cttatcgata ccgtcgaggg gcagagccga 1740

tcctgtacac tttacttaaa accattatct gagtgttaaa tgtccaattt actgaccgta 1800

caccaaaatt tgcctgcatt accggtcgat gcaacgagtg atgaggttcg caagaacctg 1860

atggacatgt tcagggatcg ccaggcgttt tctgagcata cctggaaaat gcttctgtcc 1920

gtttgccggt cgtgggcggc atggtgcaag ttgaataacc ggaaatggtt tcccgcagaa 1980

cctgaagatg ttcgcgatta tcttctatat cttcaggcgc gcggtctggc agtaaaaact 2040

atccagcaac atttgggcca gctaaacatg cttcatcgtc ggtccgggct gccacgacca 2100

agtgacagca atgctgtttc actggttatg cggcggatcc gaaaagaaaa cgttgatgcc 2160

ggtgaacgtg caaaacaggc tctagcgttc gaacgcactg atttcgacca ggttcgttca 2220

ctcatggaaa atagcgatcg ctgccaggat atacgtaatc tggcatttct ggggattgct 2280

tataacaccc tgttacgtat agccgaaatt gcggcgcgcc ggtacctctt aattaactgg 2340

cctcatgggc cttccgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 2400

attaacatgg tcatagctgt ttccttgcgt attgggcgct ctccgcttcc tcgctcactg 2460

actcgctgcg ctcggtcgtt cgggtaaagc ctggggtgcc taatgagcaa aaggccagca 2520

aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 2580

tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 2640

aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 2700

gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 2760

acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 2820

accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 2880

ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 2940

gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 3000

aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 3060

ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 3120

gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 3180

cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 3240

cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 3300

gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 3360

tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 3420

gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gaaccacgct caccggctcc 3480

agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 3540

tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 3600

agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc 3660

gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 3720

catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 3780

ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc 3840

atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg 3900

tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag 3960

cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat 4020

cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc 4080

atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa 4140

aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta 4200

ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 4260

aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccaccta aattgtaagc 4320

gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa 4380

taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt 4440

ggccgctaca gggcgctccc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgttt 4500

cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat 4560

taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgagc 4620

gcgacgtaat acgactcact atagggcgaa ttggcggaag gccgtcaagg cctaggcgcg 4680

ccatgagctc ggcgcgccgc ggccgcaggc ctggcgccca gctggggccc gtcgacctcg 4740

agtaccgttc gtataatgta tgctatacga agttatattt 4780

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> source

<222> 1..21

<223> /organism="Artificial sequence"

/note="Primer 5 (DBC-03374, pSUC225 Cre-2 FW)"

/mol_type="unassigned DNA"

<400> 10

cgttcactca tggaaaatag c 21

<210> 11

<211> 85

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> source

<222> 1..85

<223> /organism="Artificial sequence"

/note="Primer 6 (pSUC225 Cre-2 REV with PDC6 3' overhang)"

/mol_type="unassigned DNA"

<400> 11

gtattcaaac tgtgtaagtt tatttatttg caacaataat tcgtttgagt acactactaa 60

tggccggatc ctaccgttcg tatag 85

<210> 12

<211> 1139

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Glycosomal Trypanosoma brucei fumarate reductase (FRDg) amino

acid sequence lacking 3 aa C-terminal targeting signal.

<400> 12

Met Val Asp Gly Arg Ser Ser Ala Ser Ile Val Ala Val Asp Pro Glu

1 5 10 15

Arg Ala Ala Arg Glu Arg Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu Leu Gln Asp

20 25 30

Ser Pro Leu His Thr Thr Met Gln Tyr Ala Thr Ser Gly Leu Glu Leu

35 40 45

Thr Val Pro Tyr Ala Leu Lys Val Val Ala Ser Ala Asp Thr Phe Asp

50 55 60

Arg Ala Lys Glu Val Ala Asp Glu Val Leu Arg Cys Ala Trp Gln Leu

65 70 75 80

Ala Asp Thr Val Leu Asn Ser Phe Asn Pro Asn Ser Glu Val Ser Leu

85 90 95

Val Gly Arg Leu Pro Val Gly Gln Lys His Gln Met Ser Ala Pro Leu

100 105 110

Lys Arg Val Met Ala Cys Cys Gln Arg Val Tyr Asn Ser Ser Ala Gly

115 120 125

Cys Phe Asp Pro Ser Thr Ala Pro Val Ala Lys Ala Leu Arg Glu Ile

130 135 140

Ala Leu Gly Lys Glu Arg Asn Asn Ala Cys Leu Glu Ala Leu Thr Gln

145 150 155 160

Ala Cys Thr Leu Pro Asn Ser Phe Val Ile Asp Phe Glu Ala Gly Thr

165 170 175

Ile Ser Arg Lys His Glu His Ala Ser Leu Asp Leu Gly Gly Val Ser

180 185 190

Lys Gly Tyr Ile Val Asp Tyr Val Ile Asp Asn Ile Asn Ala Ala Gly

195 200 205

Phe Gln Asn Val Phe Phe Asp Trp Gly Gly Asp Cys Arg Ala Ser Gly

210 215 220

Met Asn Ala Arg Asn Thr Pro Trp Val Val Gly Ile Thr Arg Pro Pro

225 230 235 240

Ser Leu Asp Met Leu Pro Asn Pro Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Ile Ser

245 250 255

Val Ile Ser Leu Asp Asn Glu Ala Leu Ala Thr Ser Gly Asp Tyr Glu

260 265 270

Asn Leu Ile Tyr Thr Ala Asp Asp Lys Pro Leu Thr Cys Thr Tyr Asp

275 280 285

Trp Lys Gly Lys Glu Leu Met Lys Pro Ser Gln Ser Asn Ile Ala Gln

290 295 300

Val Ser Val Lys Cys Tyr Ser Ala Met Tyr Ala Asp Ala Leu Ala Thr

305 310 315 320

Ala Cys Phe Ile Lys Arg Asp Pro Ala Lys Val Arg Gln Leu Leu Asp

325 330 335

Gly Trp Arg Tyr Val Arg Asp Thr Val Arg Asp Tyr Arg Val Tyr Val

340 345 350

Arg Glu Asn Glu Arg Val Ala Lys Met Phe Glu Ile Ala Thr Glu Asp

355 360 365

Ala Glu Met Arg Lys Arg Arg Ile Ser Asn Thr Leu Pro Ala Arg Val

370 375 380

Ile Val Val Gly Gly Gly Leu Ala Gly Leu Ser Ala Ala Ile Glu Ala

385 390 395 400

Ala Gly Cys Gly Ala Gln Val Val Leu Met Glu Lys Glu Ala Lys Leu

405 410 415

Gly Gly Asn Ser Ala Lys Ala Thr Ser Gly Ile Asn Gly Trp Gly Thr

420 425 430

Arg Ala Gln Ala Lys Ala Ser Ile Val Asp Gly Gly Lys Tyr Phe Glu

435 440 445

Arg Asp Thr Tyr Lys Ser Gly Ile Gly Gly Asn Thr Asp Pro Ala Leu

450 455 460

Val Lys Thr Leu Ser Met Lys Ser Ala Asp Ala Ile Gly Trp Leu Thr

465 470 475 480

Ser Leu Gly Val Pro Leu Thr Val Leu Ser Gln Leu Gly Gly His Ser

485 490 495

Arg Lys Arg Thr His Arg Ala Pro Asp Lys Lys Asp Gly Thr Pro Leu

500 505 510

Pro Ile Gly Phe Thr Ile Met Lys Thr Leu Glu Asp His Val Arg Gly

515 520 525

Asn Leu Ser Gly Arg Ile Thr Ile Met Glu Asn Cys Ser Val Thr Ser

530 535 540

Leu Leu Ser Glu Thr Lys Glu Arg Pro Asp Gly Thr Lys Gln Ile Arg

545 550 555 560

Val Thr Gly Val Glu Phe Thr Gln Ala Gly Ser Gly Lys Thr Thr Ile

565 570 575

Leu Ala Asp Ala Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Phe Ser Asn Asp Lys

580 585 590

Thr Ala Asp Ser Leu Leu Arg Glu His Ala Pro His Leu Val Asn Phe

595 600 605

Pro Thr Thr Asn Gly Pro Trp Ala Thr Gly Asp Gly Val Lys Leu Ala

610 615 620

Gln Arg Leu Gly Ala Gln Leu Val Asp Met Asp Lys Val Gln Leu His

625 630 635 640

Pro Thr Gly Leu Ile Asn Pro Lys Asp Pro Ala Asn Pro Thr Lys Phe

645 650 655

Leu Gly Pro Glu Ala Leu Arg Gly Ser Gly Gly Val Leu Leu Asn Lys

660 665 670

Gln Gly Lys Arg Phe Val Asn Glu Leu Asp Leu Arg Ser Val Val Ser

675 680 685

Lys Ala Ile Met Glu Gln Gly Ala Glu Tyr Pro Gly Ser Gly Gly Ser

690 695 700

Met Phe Ala Tyr Cys Val Leu Asn Ala Ala Ala Gln Lys Leu Phe Gly

705 710 715 720

Val Ser Ser His Glu Phe Tyr Trp Lys Lys Met Gly Leu Phe Val Lys

725 730 735

Ala Asp Thr Met Arg Asp Leu Ala Ala Leu Ile Gly Cys Pro Val Glu

740 745 750

Ser Val Gln Gln Thr Leu Glu Glu Tyr Glu Arg Leu Ser Ile Ser Gln

755 760 765

Arg Ser Cys Pro Ile Thr Arg Lys Ser Val Tyr Pro Cys Val Leu Gly

770 775 780

Thr Lys Gly Pro Tyr Tyr Val Ala Phe Val Thr Pro Ser Ile His Tyr

785 790 795 800

Thr Met Gly Gly Cys Leu Ile Ser Pro Ser Ala Glu Ile Gln Met Lys

805 810 815

Asn Thr Ser Ser Arg Ala Pro Leu Ser His Ser Asn Pro Ile Leu Gly

820 825 830

Leu Phe Gly Ala Gly Glu Val Thr Gly Gly Val His Gly Gly Asn Arg

835 840 845

Leu Gly Gly Asn Ser Leu Leu Glu Cys Val Val Phe Gly Arg Ile Ala

850 855 860

Gly Asp Arg Ala Ser Thr Ile Leu Gln Arg Lys Ser Ser Ala Leu Ser

865 870 875 880

Phe Lys Val Trp Thr Thr Val Val Leu Arg Glu Val Arg Glu Gly Gly

885 890 895

Val Tyr Gly Ala Gly Ser Arg Val Leu Arg Phe Asn Leu Pro Gly Ala

900 905 910

Leu Gln Arg Ser Gly Leu Ser Leu Gly Gln Phe Ile Ala Ile Arg Gly

915 920 925

Asp Trp Asp Gly Gln Gln Leu Ile Gly Tyr Tyr Ser Pro Ile Thr Leu

930 935 940

Pro Asp Asp Leu Gly Met Ile Asp Ile Leu Ala Arg Ser Asp Lys Gly

945 950 955 960

Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Ala Leu Glu Pro Gly Asp Ala Val Glu

965 970 975

Met Lys Ala Cys Gly Gly Leu Val Ile Glu Arg Arg Leu Ser Asp Lys

980 985 990

His Phe Val Phe Met Gly His Ile Ile Asn Lys Leu Cys Leu Ile Ala

995 1000 1005

Gly Gly Thr Gly Val Ala Pro Met Leu Gln Ile Ile Lys Ala Ala Phe

1010 1015 1020

Met Lys Pro Phe Ile Asp Thr Leu Glu Ser Val His Leu Ile Tyr Ala

1025 1030 1035 1040

Ala Glu Asp Val Thr Glu Leu Thr Tyr Arg Glu Val Leu Glu Glu Arg

1045 1050 1055

Arg Arg Glu Ser Arg Gly Lys Phe Lys Lys Thr Phe Val Leu Asn Arg

1060 1065 1070

Pro Pro Pro Leu Trp Thr Asp Gly Val Gly Phe Ile Asp Arg Gly Ile

1075 1080 1085

Leu Thr Asn His Val Gln Pro Pro Ser Asp Asn Leu Leu Val Ala Ile

1090 1095 1100

Cys Gly Pro Pro Val Met Gln Arg Ile Val Lys Ala Thr Leu Lys Thr

1105 1110 1115 1120

Leu Gly Tyr Asn Met Asn Leu Val Arg Thr Val Asp Glu Thr Glu Pro

1125 1130 1135

Ser Gly Ser

<210> 13

<211> 472

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Rhizopus oryzae fumarase amino acid sequence, lacking the first

23 N-terminal amino acids.

<400> 13

Met Ser Ser Ala Ser Ala Ala Leu Gln Lys Phe Arg Ala Glu Arg Asp

1 5 10 15

Thr Phe Gly Asp Leu Gln Val Pro Ala Asp Arg Tyr Trp Gly Ala Gln

20 25 30

Thr Gln Arg Ser Leu Gln Asn Phe Asp Ile Gly Gly Pro Thr Glu Arg

35 40 45

Met Pro Glu Pro Leu Ile Arg Ala Phe Gly Val Leu Lys Lys Ala Ala

50 55 60

Ala Thr Val Asn Met Thr Tyr Gly Leu Asp Pro Lys Val Gly Glu Ala

65 70 75 80

Ile Gln Lys Ala Ala Asp Glu Val Ile Asp Gly Ser Leu Ile Asp His

85 90 95

Phe Pro Leu Val Val Trp Gln Thr Gly Ser Gly Thr Gln Thr Lys Met

100 105 110

Asn Val Asn Glu Val Ile Ser Asn Arg Ala Ile Glu Leu Leu Gly Gly

115 120 125

Glu Leu Gly Ser Lys Ala Pro Val His Pro Asn Asp His Val Asn Met

130 135 140

Ser Gln Ser Ser Asn Asp Thr Phe Pro Thr Ala Met His Val Ala Ala

145 150 155 160

Val Val Glu Ile His Gly Arg Leu Ile Pro Ala Leu Thr Thr Leu Arg

165 170 175

Asp Ala Leu Gln Ala Lys Ser Ala Glu Phe Glu His Ile Ile Lys Ile

180 185 190

Gly Arg Thr His Leu Gln Asp Ala Thr Pro Leu Thr Leu Gly Gln Glu

195 200 205

Phe Ser Gly Tyr Thr Gln Gln Leu Thr Tyr Gly Ile Ala Arg Val Gln

210 215 220

Gly Thr Leu Glu Arg Leu Tyr Asn Leu Ala Gln Gly Gly Thr Ala Val

225 230 235 240

Gly Thr Gly Leu Asn Thr Arg Lys Gly Phe Asp Ala Lys Val Ala Glu

245 250 255

Ala Ile Ala Ser Ile Thr Gly Leu Pro Phe Lys Thr Ala Pro Asn Lys

260 265 270

Phe Glu Ala Leu Ala Ala His Asp Ala Leu Val Glu Ala His Gly Ala

275 280 285

Leu Asn Thr Val Ala Cys Ser Leu Met Lys Ile Ala Asn Asp Ile Arg

290 295 300

Tyr Leu Gly Ser Gly Pro Arg Cys Gly Leu Gly Glu Leu Ser Leu Pro

305 310 315 320

Glu Asn Glu Pro Gly Ser Ser Ile Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Thr

325 330 335

Gln Cys Glu Ala Met Thr Met Val Cys Ala Gln Val Met Gly Asn Asn

340 345 350

Thr Ala Ile Ser Val Ala Gly Ser Asn Gly Gln Phe Glu Leu Asn Val

355 360 365

Phe Lys Pro Val Met Ile Lys Asn Leu Ile Gln Ser Ile Arg Leu Ile

370 375 380

Ser Asp Ala Ser Ile Ser Phe Thr Lys Asn Cys Val Val Gly Ile Glu

385 390 395 400

Ala Asn Glu Lys Lys Ile Ser Ser Ile Met Asn Glu Ser Leu Met Leu

405 410 415

Val Thr Ala Leu Asn Pro His Ile Gly Tyr Asp Lys Ala Ala Lys Cys

420 425 430

Ala Lys Lys Ala His Lys Glu Gly Thr Thr Leu Lys Glu Ala Ala Leu

435 440 445

Ser Leu Gly Tyr Leu Thr Ser Glu Glu Phe Asp Gln Trp Val Arg Pro

450 455 460

Glu Asp Met Ile Ser Ala Lys Asp

465 470

<210> 14

<211> 538

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Actinobacillus succinogenes phosphoenolpyruvate carboxykinase

amino acid sequence, with EGY to DAF modification at pos 120 -

122.

<400> 14

Met Thr Asp Leu Asn Lys Leu Val Lys Glu Leu Asn Asp Leu Gly Leu

1 5 10 15

Thr Asp Val Lys Glu Ile Val Tyr Asn Pro Ser Tyr Glu Gln Leu Phe

20 25 30

Glu Glu Glu Thr Lys Pro Gly Leu Glu Gly Phe Asp Lys Gly Thr Leu

35 40 45

Thr Thr Leu Gly Ala Val Ala Val Asp Thr Gly Ile Phe Thr Gly Arg

50 55 60

Ser Pro Lys Asp Lys Tyr Ile Val Cys Asp Glu Thr Thr Lys Asp Thr

65 70 75 80

Val Trp Trp Asn Ser Glu Ala Ala Lys Asn Asp Asn Lys Pro Met Thr

85 90 95

Gln Glu Thr Trp Lys Ser Leu Arg Glu Leu Val Ala Lys Gln Leu Ser

100 105 110

Gly Lys Arg Leu Phe Val Val Asp Ala Phe Cys Gly Ala Ser Glu Lys

115 120 125

His Arg Ile Gly Val Arg Met Val Thr Glu Val Ala Trp Gln Ala His

130 135 140

Phe Val Lys Asn Met Phe Ile Arg Pro Thr Asp Glu Glu Leu Lys Asn

145 150 155 160

Phe Lys Ala Asp Phe Thr Val Leu Asn Gly Ala Lys Cys Thr Asn Pro

165 170 175

Asn Trp Lys Glu Gln Gly Leu Asn Ser Glu Asn Phe Val Ala Phe Asn

180 185 190

Ile Thr Glu Gly Ile Gln Leu Ile Gly Gly Thr Trp Tyr Gly Gly Glu

195 200 205

Met Lys Lys Gly Met Phe Ser Met Met Asn Tyr Phe Leu Pro Leu Lys

210 215 220

Gly Val Ala Ser Met His Cys Ser Ala Asn Val Gly Lys Asp Gly Asp

225 230 235 240

Val Ala Ile Phe Phe Gly Leu Ser Gly Thr Gly Lys Thr Thr Leu Ser

245 250 255

Thr Asp Pro Lys Arg Gln Leu Ile Gly Asp Asp Glu His Gly Trp Asp

260 265 270

Glu Ser Gly Val Phe Asn Phe Glu Gly Gly Cys Tyr Ala Lys Thr Ile

275 280 285

Asn Leu Ser Gln Glu Asn Glu Pro Asp Ile Tyr Gly Ala Ile Arg Arg

290 295 300

Asp Ala Leu Leu Glu Asn Val Val Val Arg Ala Asp Gly Ser Val Asp

305 310 315 320

Phe Asp Asp Gly Ser Lys Thr Glu Asn Thr Arg Val Ser Tyr Pro Ile

325 330 335

Tyr His Ile Asp Asn Ile Val Arg Pro Val Ser Lys Ala Gly His Ala

340 345 350

Thr Lys Val Ile Phe Leu Thr Ala Asp Ala Phe Gly Val Leu Pro Pro

355 360 365

Val Ser Lys Leu Thr Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Tyr Phe Leu Ser Gly

370 375 380

Phe Thr Ala Lys Leu Ala Gly Thr Glu Arg Gly Val Thr Glu Pro Thr

385 390 395 400

Pro Thr Phe Ser Ala Cys Phe Gly Ala Ala Phe Leu Ser Leu His Pro

405 410 415

Ile Gln Tyr Ala Asp Val Leu Val Glu Arg Met Lys Ala Ser Gly Ala

420 425 430

Glu Ala Tyr Leu Val Asn Thr Gly Trp Asn Gly Thr Gly Lys Arg Ile

435 440 445

Ser Ile Lys Asp Thr Arg Gly Ile Ile Asp Ala Ile Leu Asp Gly Ser

450 455 460

Ile Glu Lys Ala Glu Met Gly Glu Leu Pro Ile Phe Asn Leu Ala Ile

465 470 475 480

Pro Lys Ala Leu Pro Gly Val Asp Pro Ala Ile Leu Asp Pro Arg Asp

485 490 495

Thr Tyr Ala Asp Lys Ala Gln Trp Gln Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala

500 505 510

Asn Arg Phe Val Lys Asn Phe Val Lys Tyr Thr Ala Asn Pro Glu Ala

515 520 525

Ala Lys Leu Val Gly Ala Gly Pro Lys Ala

530 535

<210> 15

<211> 340

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Saccharomyces cerevisiae peroxisomal malate dehydrogenase (Mdh3)

amino acid sequence, lacking the 3 C-terminal peroxisomal

targeting sequence (SKL).

<400> 15

Met Val Lys Val Ala Ile Leu Gly Ala Ser Gly Gly Val Gly Gln Pro

1 5 10 15

Leu Ser Leu Leu Leu Lys Leu Ser Pro Tyr Val Ser Glu Leu Ala Leu

20 25 30

Tyr Asp Ile Arg Ala Ala Glu Gly Ile Gly Lys Asp Leu Ser His Ile

35 40 45

Asn Thr Asn Ser Ser Cys Val Gly Tyr Asp Lys Asp Ser Ile Glu Asn

50 55 60

Thr Leu Ser Asn Ala Gln Val Val Leu Ile Pro Ala Gly Val Pro Arg

65 70 75 80

Lys Pro Gly Leu Thr Arg Asp Asp Leu Phe Lys Met Asn Ala Gly Ile

85 90 95

Val Lys Ser Leu Val Thr Ala Val Gly Lys Phe Ala Pro Asn Ala Arg

100 105 110

Ile Leu Val Ile Ser Asn Pro Val Asn Ser Leu Val Pro Ile Ala Val

115 120 125

Glu Thr Leu Lys Lys Met Gly Lys Phe Lys Pro Gly Asn Val Met Gly

130 135 140

Val Thr Asn Leu Asp Leu Val Arg Ala Glu Thr Phe Leu Val Asp Tyr

145 150 155 160

Leu Met Leu Lys Asn Pro Lys Ile Gly Gln Glu Gln Asp Lys Thr Thr

165 170 175

Met His Arg Lys Val Thr Val Ile Gly Gly His Ser Gly Glu Thr Ile

180 185 190

Ile Pro Ile Ile Thr Asp Lys Ser Leu Val Phe Gln Leu Asp Lys Gln

195 200 205

Tyr Glu His Phe Ile His Arg Val Gln Phe Gly Gly Asp Glu Ile Val

210 215 220

Lys Ala Lys Gln Gly Ala Gly Ser Ala Thr Leu Ser Met Ala Phe Ala

225 230 235 240

Gly Ala Lys Phe Ala Glu Glu Val Leu Arg Ser Phe His Asn Glu Lys

245 250 255

Pro Glu Thr Glu Ser Leu Ser Ala Phe Val Tyr Leu Pro Gly Leu Lys

260 265 270

Asn Gly Lys Lys Ala Gln Gln Leu Val Gly Asp Asn Ser Ile Glu Tyr

275 280 285

Phe Ser Leu Pro Ile Val Leu Arg Asn Gly Ser Val Val Ser Ile Asp

290 295 300

Thr Ser Val Leu Glu Lys Leu Ser Pro Arg Glu Glu Gln Leu Val Asn

305 310 315 320

Thr Ala Val Lys Glu Leu Arg Lys Asn Ile Glu Lys Gly Lys Ser Phe

325 330 335

Ile Leu Asp Ser

340

<210> 16

<211> 1180

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 16

Met Ser Ser Ser Lys Lys Leu Ala Gly Leu Arg Asp Asn Phe Ser Leu

1 5 10 15

Leu Gly Glu Lys Asn Lys Ile Leu Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Pro

20 25 30

Ile Arg Ile Phe Arg Ser Ala His Glu Leu Ser Met Arg Thr Ile Ala

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<212> PRT

<213> Kluyveromyces lactis

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Sacharomyces cerevisiae malate synthase amino acid sequence

(artificial) Saccharomyces cerevisiae peroxisomal malate synthase

(Mls1) amino acid sequence, lacking the 3 C-terminal peroxisomal

targeting

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<213> Aspergillus niger

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<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

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Gly Gly Ser His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile

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260 265 270

Gly Met Pro Ala His Ala Tyr Cys Asn Ser Asp Val Phe Asn Gln Val

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Ile His Leu Ala Gly Leu Ser Asp Val Pro Glu Ile Phe Ala Lys Met

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<212> PRT

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<220>

<223> ADH6

<400> 64

Met Ser Tyr Pro Glu Lys Phe Glu Gly Ile Ala Ile Gln Ser His Glu

1 5 10 15

Asp Trp Lys Asn Pro Lys Lys Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Pro Phe Tyr

20 25 30

Asp His Asp Ile Asp Ile Lys Ile Glu Ala Cys Gly Val Cys Gly Ser

35 40 45

Asp Ile His Cys Ala Ala Gly His Trp Gly Asn Met Lys Met Pro Leu

50 55 60

Val Val Gly His Glu Ile Val Gly Lys Val Val Lys Leu Gly Pro Lys

65 70 75 80

Ser Asn Ser Gly Leu Lys Val Gly Gln Arg Val Gly Val Gly Ala Gln

85 90 95

Val Phe Ser Cys Leu Glu Cys Asp Arg Cys Lys Asn Asp Asn Glu Pro

100 105 110

Tyr Cys Thr Lys Phe Val Thr Thr Tyr Ser Gln Pro Tyr Glu Asp Gly

115 120 125

Tyr Val Ser Gln Gly Gly Tyr Ala Asn Tyr Val Arg Val His Glu His

130 135 140

Phe Val Val Pro Ile Pro Glu Asn Ile Pro Ser His Leu Ala Ala Pro

145 150 155 160

Leu Leu Cys Gly Gly Leu Thr Val Tyr Ser Pro Leu Val Arg Asn Gly

165 170 175

Cys Gly Pro Gly Lys Lys Val Gly Ile Val Gly Leu Gly Gly Ile Gly

180 185 190

Ser Met Gly Thr Leu Ile Ser Lys Ala Met Gly Ala Glu Thr Tyr Val

195 200 205

Ile Ser Arg Ser Ser Arg Lys Arg Glu Asp Ala Met Lys Met Gly Ala

210 215 220

Asp His Tyr Ile Ala Thr Leu Glu Glu Gly Asp Trp Gly Glu Lys Tyr

225 230 235 240

Phe Asp Thr Phe Asp Leu Ile Val Val Cys Ala Ser Ser Leu Thr Asp

245 250 255

Ile Asp Phe Asn Ile Met Pro Lys Ala Met Lys Val Gly Gly Arg Ile

260 265 270

Val Ser Ile Ser Ile Pro Glu Gln His Glu Met Leu Ser Leu Lys Pro

275 280 285

Tyr Gly Leu Lys Ala Val Ser Ile Ser Tyr Ser Ala Leu Gly Ser Ile

290 295 300

Lys Glu Leu Asn Gln Leu Leu Lys Leu Val Ser Glu Lys Asp Ile Lys

305 310 315 320

Ile Trp Val Glu Thr Leu Pro Val Gly Glu Ala Gly Val His Glu Ala

325 330 335

Phe Glu Arg Met Glu Lys Gly Asp Val Arg Tyr Arg Phe Thr Leu Val

340 345 350

Gly Tyr Asp Lys Glu Phe Ser Asp

355 360

<210> 65

<211> 206

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> ALD2

<400> 65

Met Ala Cys Trp Lys Leu Gln Gly Ala Leu Ala Ala Gly Asn Thr Val

1 5 10 15

Ile Ile Lys Pro Ala Glu Asn Thr Ser Leu Ser Leu Leu Tyr Phe Ala

20 25 30

Thr Leu Ile Lys Lys Ala Gly Phe Pro Pro Gly Val Val Asn Ile Val

35 40 45

Pro Gly Tyr Gly Ser Leu Val Gly Gln Ala Leu Ala Ser His Met Asp

50 55 60

Ile Asp Lys Ile Ser Phe Thr Gly Ser Thr Lys Val Gly Gly Phe Val

65 70 75 80

Leu Glu Ala Ser Gly Gln Ser Asn Leu Lys Asp Val Thr Leu Glu Cys

85 90 95

Gly Gly Lys Ser Pro Ala Leu Val Asp Glu Ile Phe Gly Pro Val Val

100 105 110

Val Val Ser Lys Phe Thr Asn Tyr Asp Asp Ala Leu Lys Leu Ala Asn

115 120 125

Asp Thr Cys Tyr Gly Leu Ala Ser Ala Val Phe Thr Lys Asp Val Lys

130 135 140

Lys Ala His Met Phe Ala Arg Asp Ile Lys Ala Gly Thr Val Trp Ile

145 150 155 160

Asn Ser Ser Asn Asp Glu Asp Val Thr Val Pro Phe Gly Gly Phe Lys

165 170 175

Met Ser Gly Ile Gly Arg Glu Leu Gly Gln Ser Gly Val Asp Thr Tyr

180 185 190

Leu Gln Thr Lys Ala Val His Ile Asn Leu Ser Leu Asp Asn

195 200 205

<210> 66

<211> 263

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> ALD3

<400> 66

Met Gly Glu Thr Ile Pro Leu Thr Phe Asn Lys Phe Ala Tyr Thr Leu

1 5 10 15

Lys Val Pro Phe Gly Val Val Ala Gln Ile Val Pro Trp Asn Tyr Pro

20 25 30

Leu Ala Met Ala Cys Arg Lys Met Gln Gly Ala Leu Ala Ala Gly Asn

35 40 45

Thr Val Ile Ile Lys Pro Ala Glu Asn Thr Ser Leu Ser Leu Leu Tyr

50 55 60

Phe Ala Thr Leu Ile Lys Lys Ala Gly Phe Pro Pro Gly Val Val Asn

65 70 75 80

Val Ile Pro Gly Tyr Gly Ser Val Val Gly Lys Ala Leu Gly Thr His

85 90 95

Met Asp Ile Asp Lys Ile Ser Phe Thr Gly Ser Thr Lys Val Gly Gly

100 105 110

Ser Val Leu Glu Ala Ser Gly Gln Ser Asn Leu Lys Asp Ile Thr Leu

115 120 125

Glu Cys Gly Gly Lys Ser Pro Ala Leu Val Phe Glu Asp Ala Asp Leu

130 135 140

Asp Lys Ala Ile Glu Trp Val Ala Asn Gly Lys Thr Ser Lys Leu Leu

145 150 155 160

Arg Asp Glu Ile Phe Gly Pro Val Val Val Val Ser Lys Phe Thr Asn

165 170 175

Tyr Asp Asp Ala Leu Lys Leu Ala Asn Asp Thr Cys Tyr Gly Leu Ala

180 185 190

Ser Ala Val Phe Thr Lys Asp Val Lys Lys Ala His Met Phe Ala Arg

195 200 205

Asp Ile Lys Ala Gly Thr Val Trp Ile Asn Gln Thr Asn Gln Glu Glu

210 215 220

Ala Lys Val Pro Phe Gly Gly Phe Lys Met Ser Gly Ile Gly Arg Glu

225 230 235 240

Ser Gly Asp Thr Gly Val Asp Asn Tyr Leu Gln Ile Lys Ser Val His

245 250 255

Val Asp Leu Ser Leu Asp Lys

260

<210> 67

<211> 519

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> ALD4

<400> 67

Met Phe Ser Arg Ser Thr Leu Cys Leu Lys Thr Ser Ala Ser Ser Ile

1 5 10 15

Gly Arg Leu Gln Leu Arg Tyr Phe Ser His Leu Pro Met Thr Val Pro

20 25 30

Ile Lys Leu Pro Asn Gly Leu Glu Tyr Glu Gln Pro Thr Gly Leu Phe

35 40 45

Ile Asn Asn Lys Phe Val Pro Ser Lys Gln Asn Lys Thr Phe Glu Val

50 55 60

Ile Asn Pro Ser Thr Glu Glu Glu Ile Cys His Ile Tyr Glu Gly Arg

65 70 75 80

Glu Asp Asp Val Glu Glu Ala Val Gln Ala Ala Asp Arg Ala Phe Ser

85 90 95

Asn Gly Ser Trp Asn Gly Ile Asp Pro Ile Asp Arg Gly Lys Ala Leu

100 105 110

Tyr Arg Leu Ala Glu Leu Ile Glu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ser

115 120 125

Ile Glu Thr Leu Asp Asn Gly Lys Ala Ile Ser Ser Ser Arg Gly Asp

130 135 140

Val Asp Leu Val Ile Asn Tyr Leu Lys Ser Ser Ala Gly Phe Ala Asp

145 150 155 160

Lys Ile Asp Gly Arg Met Ile Asp Thr Gly Arg Thr His Phe Ser Tyr

165 170 175

Thr Lys Arg Gln Pro Leu Gly Val Cys Gly Gln Ile Ile Pro Trp Asn

180 185 190

Phe Pro Leu Leu Met Trp Ala Trp Lys Ile Ala Pro Ala Leu Val Thr

195 200 205

Gly Asn Thr Val Val Leu Lys Thr Ala Glu Ser Thr Pro Leu Ser Ala

210 215 220

Leu Tyr Val Ser Lys Tyr Ile Pro Gln Ala Gly Ile Pro Pro Gly Val

225 230 235 240

Ile Asn Ile Val Ser Gly Phe Gly Lys Ile Val Gly Glu Ala Ile Thr

245 250 255

Asn His Pro Lys Ile Lys Lys Val Ala Phe Thr Gly Ser Thr Ala Thr

260 265 270

Gly Arg His Ile Tyr Gln Ser Ala Ala Ala Gly Leu Lys Lys Val Thr

275 280 285

Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro Asn Ile Val Phe Ala Asp Ala Glu

290 295 300

Leu Lys Lys Ala Val Gln Asn Ile Ile Leu Gly Ile Tyr Tyr Asn Ser

305 310 315 320

Gly Glu Val Cys Cys Ala Gly Ser Arg Val Tyr Val Glu Glu Ser Ile

325 330 335

Tyr Asp Lys Phe Ile Glu Glu Phe Lys Ala Ala Ser Glu Ser Ile Lys

340 345 350

Val Gly Asp Pro Phe Asp Glu Ser Thr Phe Gln Gly Ala Gln Thr Ser

355 360 365

Gln Met Gln Leu Asn Lys Ile Leu Lys Tyr Val Asp Ile Gly Lys Asn

370 375 380

Glu Gly Ala Thr Leu Ile Thr Gly Gly Glu Arg Leu Gly Ser Lys Gly

385 390 395 400

Tyr Phe Ile Lys Pro Thr Val Phe Gly Asp Val Lys Glu Asp Met Arg

405 410 415

Ile Val Lys Glu Glu Ile Phe Gly Pro Val Val Thr Val Thr Lys Phe

420 425 430

Lys Ser Ala Asp Glu Val Ile Asn Met Ala Asn Asp Ser Glu Tyr Gly

435 440 445

Leu Ala Ala Gly Ile His Thr Ser Asn Ile Asn Thr Ala Leu Lys Val

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Ala Asp Arg Val Asn Ala Gly Thr Val Trp Ile Asn Thr Tyr Asn Asp

465 470 475 480

Phe His His Ala Val Pro Phe Gly Gly Phe Asn Ala Ser Gly Leu Gly

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Arg Glu Met Ser Val Asp Ala Leu Gln Asn Tyr Leu Gln Val Lys Ala

500 505 510

Val Arg Ala Lys Leu Asp Glu

515

<210> 68

<211> 520

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> ALD5

<400> 68

Met Leu Ser Arg Thr Arg Ala Ala Ala Pro Asn Ser Arg Ile Phe Thr

1 5 10 15

Arg Ser Leu Leu Arg Leu Tyr Ser Gln Ala Pro Leu Arg Val Pro Ile

20 25 30

Thr Leu Pro Asn Gly Phe Thr Tyr Glu Gln Pro Thr Gly Leu Phe Ile

35 40 45

Asn Gly Glu Phe Val Ala Ser Lys Gln Lys Lys Thr Phe Asp Val Ile

50 55 60

Asn Pro Ser Asn Glu Glu Lys Ile Thr Thr Val Tyr Lys Ala Met Glu

65 70 75 80

Asp Asp Val Asp Glu Ala Val Ala Ala Ala Lys Lys Ala Phe Glu Thr

85 90 95

Lys Trp Ser Ile Val Glu Pro Glu Val Arg Ala Lys Ala Leu Phe Asn

100 105 110

Leu Ala Asp Leu Val Glu Lys His Gln Glu Thr Leu Ala Ala Ile Glu

115 120 125

Ser Met Asp Asn Gly Lys Ser Leu Phe Cys Ala Arg Gly Asp Val Ala

130 135 140

Leu Val Ser Lys Tyr Leu Arg Ser Cys Gly Gly Trp Ala Asp Lys Ile

145 150 155 160

Tyr Gly Asn Val Ile Asp Thr Gly Lys Asn His Phe Thr Tyr Ser Ile

165 170 175

Lys Glu Pro Leu Gly Val Cys Gly Gln Ile Ile Pro Trp Asn Phe Pro

180 185 190

Leu Leu Met Trp Ser Trp Lys Ile Gly Pro Ala Leu Ala Thr Gly Asn

195 200 205

Thr Val Val Leu Lys Pro Ala Glu Thr Thr Pro Leu Ser Ala Leu Phe

210 215 220

Ala Ser Gln Leu Cys Gln Glu Ala Gly Ile Pro Ala Gly Val Val Asn

225 230 235 240

Ile Leu Pro Gly Ser Gly Arg Val Val Gly Glu Arg Leu Ser Ala His

245 250 255

Pro Asp Val Lys Lys Ile Ala Phe Thr Gly Ser Thr Ala Thr Gly Arg

260 265 270

His Ile Met Lys Val Ala Ala Asp Thr Val Lys Lys Val Thr Leu Glu

275 280 285

Leu Gly Gly Lys Ser Pro Asn Ile Val Phe Ala Asp Ala Asp Leu Asp

290 295 300

Lys Ala Val Lys Asn Ile Ala Phe Gly Ile Phe Tyr Asn Ser Gly Glu

305 310 315 320

Val Cys Cys Ala Gly Ser Arg Ile Tyr Ile Gln Asp Thr Val Tyr Glu

325 330 335

Glu Val Leu Gln Lys Leu Lys Asp Tyr Thr Glu Ser Leu Lys Val Gly

340 345 350

Asp Pro Phe Asp Glu Glu Val Phe Gln Gly Ala Gln Thr Ser Asp Lys

355 360 365

Gln Leu His Lys Ile Leu Asp Tyr Val Asp Val Ala Lys Ser Glu Gly

370 375 380

Ala Arg Leu Val Thr Gly Gly Ala Arg His Gly Ser Lys Gly Tyr Phe

385 390 395 400

Val Lys Pro Thr Val Phe Ala Asp Val Lys Glu Asp Met Arg Ile Val

405 410 415

Lys Glu Glu Val Phe Gly Pro Ile Val Thr Val Ser Lys Phe Ser Thr

420 425 430

Val Asp Glu Val Ile Ala Met Ala Asn Asp Ser Gln Tyr Gly Leu Ala

435 440 445

Ala Gly Ile His Thr Asn Asp Ile Asn Lys Ala Val Asp Val Ser Lys

450 455 460

Arg Val Lys Ala Gly Thr Val Trp Ile Asn Thr Tyr Asn Asn Phe His

465 470 475 480

Gln Asn Val Pro Phe Gly Gly Phe Gly Gln Ser Gly Ile Gly Arg Glu

485 490 495

Met Gly Glu Ala Ala Leu Ser Asn Tyr Thr Gln Thr Lys Ser Val Arg

500 505 510

Ile Ala Ile Asp Lys Pro Ile Arg

515 520

<210> 69

<211> 500

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> ALD6

<400> 69

Met Thr Lys Leu His Phe Asp Thr Ala Glu Pro Val Lys Ile Thr Leu

1 5 10 15

Pro Asn Gly Leu Thr Tyr Glu Gln Pro Thr Gly Leu Phe Ile Asn Asn

20 25 30

Lys Phe Met Lys Ala Gln Asp Gly Lys Thr Tyr Pro Val Glu Asp Pro

35 40 45

Ser Thr Glu Asn Thr Val Cys Glu Val Ser Ser Ala Thr Thr Glu Asp

50 55 60

Val Glu Tyr Ala Ile Glu Cys Ala Asp Arg Ala Phe His Asp Thr Glu

65 70 75 80

Trp Ala Thr Gln Asp Pro Arg Glu Arg Gly Arg Leu Leu Ser Lys Leu

85 90 95

Ala Asp Glu Leu Glu Ser Gln Ile Asp Leu Val Ser Ser Ile Glu Ala

100 105 110

Leu Asp Asn Gly Lys Thr Leu Ala Leu Ala Arg Gly Asp Val Thr Ile

115 120 125

Ala Ile Asn Cys Leu Arg Asp Ala Ala Ala Tyr Ala Asp Lys Val Asn

130 135 140

Gly Arg Thr Ile Asn Thr Gly Asp Gly Tyr Met Asn Phe Thr Thr Leu

145 150 155 160

Glu Pro Ile Gly Val Cys Gly Gln Ile Ile Pro Trp Asn Phe Pro Ile

165 170 175

Met Met Leu Ala Trp Lys Ile Ala Pro Ala Leu Ala Met Gly Asn Val

180 185 190

Cys Ile Leu Lys Pro Ala Ala Val Thr Pro Leu Asn Ala Leu Tyr Phe

195 200 205

Ala Ser Leu Cys Lys Lys Val Gly Ile Pro Ala Gly Val Val Asn Ile

210 215 220

Val Pro Gly Pro Gly Arg Thr Val Gly Ala Ala Leu Thr Asn Asp Pro

225 230 235 240

Arg Ile Arg Lys Leu Ala Phe Thr Gly Ser Thr Glu Val Gly Lys Ser

245 250 255

Val Ala Val Asp Ser Ser Glu Ser Asn Leu Lys Lys Ile Thr Leu Glu

260 265 270

Leu Gly Gly Lys Ser Ala His Leu Val Phe Asp Asp Ala Asn Ile Lys

275 280 285

Lys Thr Leu Pro Asn Leu Val Asn Gly Ile Phe Lys Asn Ala Gly Gln

290 295 300

Ile Cys Ser Ser Gly Ser Arg Ile Tyr Val Gln Glu Gly Ile Tyr Asp

305 310 315 320

Glu Leu Leu Ala Ala Phe Lys Ala Tyr Leu Glu Thr Glu Ile Lys Val

325 330 335

Gly Asn Pro Phe Asp Lys Ala Asn Phe Gln Gly Ala Ile Thr Asn Arg

340 345 350

Gln Gln Phe Asp Thr Ile Met Asn Tyr Ile Asp Ile Gly Lys Lys Glu

355 360 365

Gly Ala Lys Ile Leu Thr Gly Gly Glu Lys Val Gly Asp Lys Gly Tyr

370 375 380

Phe Ile Arg Pro Thr Val Phe Tyr Asp Val Asn Glu Asp Met Arg Ile

385 390 395 400

Val Lys Glu Glu Ile Phe Gly Pro Val Val Thr Val Ala Lys Phe Lys

405 410 415

Thr Leu Glu Glu Gly Val Glu Met Ala Asn Ser Ser Glu Phe Gly Leu

420 425 430

Gly Ser Gly Ile Glu Thr Glu Ser Leu Ser Thr Gly Leu Lys Val Ala

435 440 445

Lys Met Leu Lys Ala Gly Thr Val Trp Ile Asn Thr Tyr Asn Asp Phe

450 455 460

Asp Ser Arg Val Pro Phe Gly Gly Val Lys Gln Ser Gly Tyr Gly Arg

465 470 475 480

Glu Met Gly Glu Glu Val Tyr His Ala Tyr Thr Glu Val Lys Ala Val

485 490 495

Arg Ile Lys Leu

500

<210> 70

<211> 499

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> fumarase

<400> 70

Met Ala Ala Leu Thr Met Gln Phe Glu Gly Glu Lys Lys Asn Val Ser

1 5 10 15

Glu Val Ala Asp Val Thr Leu Lys Gln Glu Asp Glu Gln Gln Glu Arg

20 25 30

Arg Ser Tyr Ser Thr Pro Phe Arg Glu Glu Arg Asp Thr Phe Gly Pro

35 40 45

Ile Gln Val Pro Ser Asp Lys Leu Trp Gly Ala Gln Thr Gln Arg Ser

50 55 60

Leu Gln Asn Phe Glu Ile Gly Gly Asp Arg Glu Arg Met Pro Glu Pro

65 70 75 80

Ile Val Arg Ala Phe Gly Val Leu Lys Lys Cys Ala Ala Lys Val Asn

85 90 95

Met Glu Tyr Gly Leu Asp Pro Met Ile Gly Glu Ala Ile Met Glu Ala

100 105 110

Ala Gln Glu Val Ala Glu Gly Lys Leu Asn Asp His Phe Pro Leu Val

115 120 125

Val Trp Gln Thr Gly Ser Gly Thr Gln Ser Asn Met Asn Ala Asn Glu

130 135 140

Val Ile Ala Asn Arg Ala Ala Glu Ile Leu Gly His Lys Arg Gly Glu

145 150 155 160

Lys Ile Val His Pro Asn Asp His Val Asn Arg Ser Gln Ser Ser Asn

165 170 175

Asp Thr Phe Pro Thr Val Met His Ile Ala Ala Ala Thr Glu Ile Thr

180 185 190

Ser Arg Leu Ile Pro Ser Leu Lys Asn Leu His Ser Ser Leu Glu Ser

195 200 205

Lys Ser Phe Glu Phe Lys Asp Ile Val Lys Ile Gly Arg Thr His Thr

210 215 220

Gln Asp Ala Thr Pro Leu Thr Leu Gly Gln Glu Phe Gly Gly Tyr Ala

225 230 235 240

Thr Gln Val Glu Tyr Gly Leu Asn Arg Val Ala Cys Thr Leu Pro Arg

245 250 255

Ile Tyr Gln Leu Ala Gln Gly Gly Thr Ala Val Gly Thr Gly Leu Asn

260 265 270

Thr Lys Lys Gly Phe Asp Val Lys Ile Ala Ala Ala Val Ala Glu Glu

275 280 285

Thr Asn Leu Pro Phe Val Thr Ala Glu Asn Lys Phe Glu Ala Leu Ala

290 295 300

Ala His Asp Ala Cys Val Glu Thr Ser Gly Ser Leu Asn Thr Ile Ala

305 310 315 320

Thr Ser Leu Met Lys Ile Ala Asn Asp Ile Arg Phe Leu Gly Ser Gly

325 330 335

Pro Arg Cys Gly Leu Gly Glu Leu Ser Leu Pro Glu Asn Glu Pro Gly

340 345 350

Ser Ser Ile Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Thr Gln Cys Glu Ala Leu

355 360 365

Thr Met Val Cys Ala Gln Val Met Gly Asn His Val Ala Val Thr Ile

370 375 380

Gly Gly Ser Asn Gly His Phe Glu Leu Asn Val Phe Lys Pro Val Ile

385 390 395 400

Ala Ser Ala Leu Leu His Ser Ile Arg Leu Ile Ala Asp Ala Ser Ala

405 410 415

Ser Phe Glu Lys Asn Cys Val Arg Gly Ile Glu Ala Asn Arg Glu Arg

420 425 430

Ile Ser Lys Leu Leu His Glu Ser Leu Met Leu Val Thr Ser Leu Asn

435 440 445

Pro Lys Ile Gly Tyr Asp Asn Ala Ala Ala Val Ala Lys Arg Ala His

450 455 460

Lys Glu Gly Cys Thr Leu Lys His Ala Ala Met Lys Leu Gly Val Leu

465 470 475 480

Thr Ser Glu Glu Phe Asp Thr Leu Val Val Pro Glu Lys Met Ile Gly

485 490 495

Pro Ser Asp

Claims

1.一种宿主细胞，其能够生产二羧酸并且在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致至少一个催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷。

2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述至少一种遗传修饰导致至少一个催化胞质溶胶中辅因子氧化的酶促步骤的缺陷。

3.根据权利要求1或2所述的宿主细胞，其中所述辅因子是NADH、NADPH或FADH2。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：

-至少一种线粒体外部NADH脱氢酶；或

-至少一种线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶；或

-至少一种胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶；或

-至少一种醇脱氢酶；或

-至少一种醛脱氢酶；或

它们的组合。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：

-至少一种线粒体外部NADH脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ IDNO：40所示序列或包含与SEQ ID NO：40具有至少50％同一性的序列；或

-至少一种线粒体外部NADH脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ IDNO：41所示序列或包含与SEQ ID NO：41具有至少50％同一性的序列；或

-至少一种线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQID NO：42所示序列或包含与SEQ ID NO：42具有至少50％同一性的序列；或

-至少一种胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQID NO：57所示序列或包含与SEQ ID NO：57具有至少50％同一性的序列；或

-至少一种胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQID NO：58所示序列或包含与SEQ ID NO：58具有至少50％同一性的序列。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：

-至少一种线粒体外部NADH脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ IDNO：40所示序列或包含与SEQ ID NO：40具有至少50％同一性的序列；和

-至少一种线粒体外部NADH脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ IDNO：41所示序列或包含与SEQ ID NO：41具有至少50％同一性的序列。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：

-至少一种线粒体外部NADH脱氢酶；和

-至少一种线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：

-至少一种线粒体外部NADH脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ IDNO：40或SEQ ID NO：41所示序列或包含与SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：41具有至少50％同一性的序列；和

-至少一种线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQID NO：42所示序列或包含与SEQ ID NO：42具有至少50％同一性的序列。

9.根据权利要求7至8中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：

-至少一种线粒体外部NADH脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ IDNO：41所示序列或包含与SEQ ID NO：41具有至少50％同一性的序列；和

10.根据权利要求6至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞在其基因组中进一步包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：

-至少一种胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶。

11.根据权利要求6至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞在其基因组中进一步包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：

-至少一种胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQID NO：57或SEQ ID NO：58所示序列或包含与SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：58具有至少50％同一性的序列。

12.根据权利要求6至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞在其基因组中进一步包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：

-至少一种胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQID NO：57所示序列或包含与SEQ ID NO：57具有至少50％同一性的序列；和

13.根据权利要求1至4中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：

14.根据前述权利要求中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞在其基因组中进一步包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：

-至少一种醇脱氢酶；或

-至少一种醛脱氢酶；或

它们的组合。

15.根据前述权利要求中任一项所述的宿主细胞，其包含还原性TCA通路。

16.根据前述权利要求中任一项所述的宿主细胞，其包含选自催化以下反应的酶的组的酶：

-丙酮酸盐/酯朝向草酰乙酸盐/酯，和/或磷酸烯醇式丙酮酸盐/酯朝向草酰乙酸盐/酯；

-草酰乙酸盐/酯朝向苹果酸盐/酯；

-苹果酸盐/酯朝向延胡索酸盐/酯；和

-延胡索酸盐/酯朝向琥珀酸盐/酯。

17.根据前述权利要求中任一项所述的宿主细胞，所述宿主细胞包含二羧酸转运体，所述二羧酸转运体将二羧酸从细胞内输出到细胞外环境。

18.根据前述权利要求中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含一个或多个拷贝的核酸，所述核酸编码磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶和/或二羧酸转运体中的一种或多种。

19.根据前述权利要求中任一项所述的宿主细胞，其是真核细胞，优选真菌细胞，更优选选自Candida、Hansenula、Issatchenkia、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces或Yarrowia菌株的酵母细胞，或选自属于Acremonium、Aspergillus、Chrysosporium、Myceliophthora、Penicillium、Talaromyces、Rasamsonia、Thielavia、Fusarium或Trichoderma属的丝状真菌细胞的丝状真菌细胞。

20.一种生产二羧酸的方法，所述方法包括：在合适的发酵培养基中发酵根据权利要求1-19中任一项所述的宿主细胞；和生产二羧酸。

21.根据权利要求20所述的方法，所述方法还包括：从所述发酵培养基中回收所述二羧酸。

22.根据权利要求21所述的方法，所述方法还包括：将回收的二羧酸转变为期望的产品，例如除冰剂、食品添加剂、化妆品添加剂、表面活性剂或聚合物，例如聚丁二酸丁二醇酯。

23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中所述二羧酸为琥珀酸、延胡索酸和/或苹果酸。