CN108420806A - 具有靶向性的抗肿瘤药物 - Google Patents

Abstract

N,N‑二乙基‑2‑[4‑(1,2‑二苯基‑2‑氯乙烯基)苯氧基]乙胺或其可药用盐作为一种靶向性的抗肿瘤药物、用于制备抗肿瘤药物的应用或者用于治疗肿瘤疾病。

Description

具有靶向性的抗肿瘤药物

技术领域

本发明涉及具有下列式I结构的化合物或其可药用盐，作为一种以IDH1为靶标的抗肿瘤药物、用于制备抗肿瘤药物的应用或者用于治疗肿瘤疾病。

背景技术

异柠檬酸脱氢酶(isocitratedhydrogenase,IDH)是三羧酸循环中的一种关键酶，在多种肿瘤中频发IDH基因突变，改变了细胞代谢并可能与肿瘤的发生发展相关。IDH1、IDH2基因突变是最常见的代谢酶基因突变类型，在胶质瘤和急性髓细胞白血病的一些亚型中相当普遍，在软骨肉瘤、胆管癌、副神经节瘤、大肠癌、前列腺癌、肺癌等实体肿瘤也有报道(Cancer Cell，2013，Vol.23(3):274-276)，是一个潜在的肿瘤治疗靶点。美国食品药品监督管理局(FDA)批准了基于突变IDH酶的靶向抑制剂的药物AG-120和AG-221用于临床试验。

式I化合物的系统命名为2-[对-(2-氯-1,2-二苯基乙烯基)苯氧基]三乙基胺，其国际药品通用名(INN)为Clomiphene，以下简称化合物I。化合物I或其药用盐作为选择性雌激素受体调节剂用于：1、治疗无排卵的女性不育症，2、治疗黄体功能不足，3、测试卵巢功能，4、探测男性下丘脑-垂体-性腺轴的功能异常，5、治疗因精子过少的男性不育等，并未见用于治疗肿瘤疾病。

发明内容

在本发明人等进行的基于结构的IDH1酶-配体相互作用的计算机分子对接中，化合物I显示了良好的IDH1结合特性。在此基础上，本发明人等进行了深入研究，药效学研究证实了计算机分子对接的结果，最终实现了本发明。

因此，本发明涉及：

1.一种通过抑制肿瘤细胞中高表达的IDH1而抗肿瘤的药物组合物，其特征在于含有化合物I——N,N-二乙基-2-[4-(1,2-二苯基-2-氯乙烯基)苯氧基]乙胺或其可药用盐作为活性成分。

2.根据1所述的药物组合物，所述IDH1高表达的肿瘤包括胶质瘤、白血病、软骨肉瘤、胆管癌、副神经节瘤、大肠癌、前列腺癌、肺癌等。

3.根据1～2任一项所述的药物组合物，其中还包含药用载体，并且实质上不包含化合物I以外的活性成分。

4.根据3所述的药物组合物，所述药用载体为适用于制成口服、注射、吸入、粘膜给药或者局部给药剂型的载体。

5.化合物I——N,N-二乙基-2-[4-(1,2-二苯基-2-氯乙烯基)苯氧基]乙胺或其可药用盐在制备通过抑制肿瘤细胞中高表达的IDH1而抗肿瘤的药物中的应用。

6.根据5所述的应用，所述IDH1高表达的肿瘤包括胶质瘤、白血病、软骨肉瘤、胆管癌、副神经节瘤、大肠癌、前列腺癌、肺癌等。

7.根据5～6任一项所述的应用，其中所述药物中还包含药用载体，并且实质上不包含化合物I以外的活性成分。

8.根据7所述的应用，所述药用载体为适用于制成口服、注射、吸入、粘膜给药或者局部给药剂型的载体。

9.一种通过抑制肿瘤细胞中高表达的IDH1而抗肿瘤的肿瘤疾病治疗方法，其特征在于对于需要治疗的对象投予N,N-二乙基-2-[4-(1,2-二苯基-2-氯乙烯基)苯氧基]乙胺或其可药用盐。

10.根据9所述的治疗方法，所述IDH1高表达的肿瘤包括胶质瘤、白血病、软骨肉瘤、胆管癌、副神经节瘤、大肠癌、前列腺癌、肺癌等。

11.根据9～10任一项所述的治疗方法，化合物I的给药方式为经口、注射、吸入、粘膜给药或者局部给药。

附图说明

图1酶活性抑制结果

图2对HT1080移植肿瘤的治疗作用(A肿瘤体积变化、B动物体重变化、C肿瘤外观变化、D肿瘤重量变化)

具体实施方式

为了使本领域的技术人员可以更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明技术方案进一步说明。

异柠檬酸脱氢酶(isocitratedhydrogenase,IDH)是三羧酸循环中的一种关键酶，是一个潜在的肿瘤治疗靶点。在多种肿瘤中频发IDH基因突变，改变了细胞代谢并可能与肿瘤的发生发展相关。IDH1、IDH2基因突变存在于胶质瘤、急性髓细胞白血病以及软骨肉瘤、胆管癌、副神经节瘤、大肠癌、前列腺癌、肺癌等实体肿瘤中。在IDH1/2基因发生突变时，能够催化NADPH依赖性的还原反应，把α-酮戊二酸(α-KG)还原成2-羟基戊二酸(2-HG)，该物质的的大量累积会促使正常细胞向恶性肿瘤转化。

本发明通过PDB数据库获取得到IDH1^R/H晶体结构，去掉结构中的原有抑制剂小分子，构建虚拟筛选的受体。采用计算机通过数据库进行筛选发现化合物I可与IDH1受体有效结合。在此基础上，进一步对Clomiphene进行了体外和体内的生物学活性测试，包括通过体外IDH1受体-配体结合试验、酶活性以及细胞活性实验确证了化合物I可以靶向的结合并抑制IDH1活性，通过动物试验确证了其在体内具有抗肿瘤活性，是一种靶向性IDH1的抗肿瘤抑制剂。

本发明中，根据不同的使用要求选择给药方式和剂型，可将化合物I直接以原形形式进行制剂，或者将其制成加成盐的进行使用。采取治疗的方式为将化合物I及其可药用的盐单独给药，也可以根据需要与其他有效治疗药物联合治疗发挥协同作用增强治疗效果。给药方式可根据临床需要选择口服、注射或者局部外用，根据给药途径的选择相应的药物剂型，口服剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服溶液、微丸剂、微片剂，注射剂型包括粉针剂、注射液、脂质体微球注射液，外用剂包括溶液、混悬液、乳剂、软膏、凝胶剂等。

本发明技术方案有以下特点：1、根据用药的需要选择化合物I原形或其可药用的盐；2、能有效地用于治疗IDH1高表达的相关疾病，包括肿瘤；3、采取治疗的方式可以单独给药或者与其他药物联合治疗；4、可以根据需要选择给不同的药方和剂型进行给药。

实施例

实施例一基于IDH1结构的化合物筛选

一、计算机筛选

本发明的工作在具备高速图形工作站式的计算机上进行，具体包括：CPU为i7-4960(6核12线程),图形卡为专业丽台Nvidia Quadro 4000，配备32GB DDR3内存，3TB高速硬盘。IDH1^R/H的晶体结构从PDB数据库下载，去掉结构中的原有抑制剂小分子，构建虚拟筛选的受体。化合物数据选择Drug Bank“所有数据库”。虚拟筛选的软件选用ICM-Pro。根据对接的化合物和IDH1^R/H复合物结构，排除结合在活性中心之外的化合物，对活性中心契合程度较好或几何形状匹配的化合物计算评分，发现可以有效地和IDH1受体结合。

二、测定与IDH1酶的结合能力

1、IDH1与IDH1^R/H蛋白表达和纯化

(1)IDH1(NCBI Reference Sequence:NP_002159.2)与IDH1^R/H(在IDH1基因序列的基础上将132位精氨酸突变为组氨酸)基因转入pET28a(Novagen公司，Cat.No.69864-3)质粒，将构建好的测序正确的质粒转入表达宿主感受态细胞BL21DE3，挑取单克隆子至5ml含有相应抗性的LB培养基中，37℃，200rpm，摇床过夜培养。次日按1:100(体积比)接入含有相应抗性的1L LB液体培养基中，继续摇床培养至对数期，使OD600＝0.8，加入IPTG至终浓度0.4mM，转移至20℃，200rpm继续诱导培养过夜。(2)离心收集细胞，加入适量体积的裂解液，超声破碎细胞，将破碎液体4℃，14000rpm离心30min，分离上清和沉淀，利用AKTA Pure蛋白纯化系统，分别采用亲和层析、离子交换层析和分子筛层析纯化得到IDH1与IDH1^R/H酶蛋白，供结合实验使用。

2、MST(微量热泳动仪)测定与IDH1^R/H酶的结合能力

待测化合物用DMSO溶解，配制成5mM母液，随后用缓冲液(20mM HEPES)稀释成250μM的初始工作液1，测定缓冲液为含5％DMSO的20mM HEPES。初始工作液1作为结合力测定的最高浓度，然后用测定缓冲液倍比稀释工作液1，共稀释9次，得到10个工作液，工作液10的浓度为7.62μM。各工作液加入等体积(终浓度为50nM)IDH1^R/H酶蛋白，在微量热泳动仪上测定平衡解离常数Kd。待测化合物和IDH1^R/H酶蛋白结合的平衡解离常数Kd值为18.4±1.61μM。

实施例三、体外活性试验

1、酶活性抑制测试：参照文献方法(Zheng,B.,et al.,Medicinal ChemistryLetters,2013.4(6):p542-546.)，对筛选的药物进行酶活性测试。

1.1.IDH1酶活性测试

IDH1酶反应体系：

总的反应体系200μL，加入IDH1酶的量为43nM。

1.2.IDH1R132H突变酶活性测试

IDH1 mutant的反应体系

总的反应体系200μL，加入IDH1酶的量为2μM。

酶活性测试检测指标为NADPH，用酶标仪在340nm处检测吸收。

实验结果：IC50值为50.203±0.124μM(结果见图1)

2.细胞实验

细胞实验部分，选取IDH1R132C高表达的HT1080细胞，收取细胞上清，用甲醇沉淀蛋白质，提取2-HG，用质谱检测化合物1对HT1080细胞内2-HG的抑制水平，并用CCK8(CellCounting Kit-8)检测化合物1对HT1080细胞存活率的影响。

细胞：HT1080cell培养基：MEM(含NEAA)+10％FBS

实验过程：收取细胞，计数；接种96孔板，5000cell/well，100ul/well，24小时后换液加药；药物浓度为：100,50,25,12.5,6.25,3.125μM，药物稀释液为细胞培养基，所有药物初始浓度均为10mM于DMSO中；加药48h后，收取细胞上清，按照1:4比例加入甲醇(上清：甲醇)，混匀，3000rpm离心20min；上清分装后负80度保存，进行质谱检测。板底细胞加入含10％CCK8的培养基37℃孵育30min，用酶标仪测定450nm吸光度。

实验结果：对HT1080细胞IC50值为3.805±0.58μM

对2-HG的IC50值为37.86±0.32μM

实施例四、动物实验

将18只接种了HT1080细胞的荷瘤SCID鼠随机等分为三组，第一组为模型组，第二组为100mg/kg给药组，第三组为50mg/kg给药组，每隔两天称重；从造模开始第7天给药，每隔两天测量肿瘤大小，连续给药15天后将裸鼠处死，量取肿瘤组织，测量实验组和对照组肿瘤块。在各测量天数，和对照组相比，治疗组的肿瘤体积显著缩小，提示肿瘤生长受到明显抑制。在实验终点，100mg/kg治疗组肿瘤体积平均值为642±127mm3,对照组肿瘤体积平均值为1879±244mm3，缩小了65.8％；图2显示了这种变化。

以上具体实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (11)

1.一种通过抑制肿瘤细胞中高表达的IDH1而抗肿瘤的药物组合物，其特征在于含有化合物I——N,N-二乙基-2-[4-(1,2-二苯基-2-氯乙烯基)苯氧基]乙胺或其可药用盐作为活性成分。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，所述IDH1高表达的肿瘤包括胶质瘤、白血病、软骨肉瘤、胆管癌、副神经节瘤、大肠癌、前列腺癌、肺癌等。

3.根据权利要求1〜2任一项所述的药物组合物，其中还包含药用载体，并且实质上不包含化合物I以外的活性成分。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，所述药用载体为适用于制成口服、注射、吸入、粘膜给药或者局部给药剂型的载体。

5.化合物I——N,N-二乙基-2-[4-(1,2-二苯基-2-氯乙烯基)苯氧基]乙胺或其可药用盐在制备通过抑制肿瘤细胞中高表达的IDH1而抗肿瘤的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，所述IDH1高表达的肿瘤包括胶质瘤、白血病、软骨肉瘤、胆管癌、副神经节瘤、大肠癌、前列腺癌、肺癌等。

7.根据权利要求5〜6任一项所述的应用，其中所述药物中还包含药用载体，并且实质上不包含化合物I以外的活性成分。

8.根据权利要求7所述的应用，所述药用载体为适用于制成口服、注射、吸入、粘膜给药或者局部给药剂型的载体。

9.一种通过抑制肿瘤细胞中高表达的IDH1而抗肿瘤的肿瘤疾病治疗方法，其特征在于对于需要治疗的对象投予N,N-二乙基-2-[4-(1,2-二苯基-2-氯乙烯基)苯氧基]乙胺或其可药用盐。

10.根据权利要求9所述的治疗方法，所述IDH1高表达的肿瘤包括胶质瘤、白血病、软骨肉瘤、胆管癌、副神经节瘤、大肠癌、前列腺癌、肺癌等。

11.根据权利要求9〜10任一项所述的治疗方法，化合物I的给药方式为经口、注射、吸入、粘膜给药或者局部给药。