CN108410847B - 一种基于液体发酵法制备纳豆激酶干粉及纳豆杆菌饲料的方法及应用 - Google Patents
一种基于液体发酵法制备纳豆激酶干粉及纳豆杆菌饲料的方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于液体发酵法制备纳豆激酶干粉及纳豆杆菌饲料的方法及产品和应用，属于微生物发酵技术领域。具体技术方案包括：培养基的配制、纳豆杆菌的接种发酵、纳豆激酶溶液和纳豆杆菌饲料的分离、纳豆激酶溶液的干燥和纳豆杆菌饲料的干燥。与现有技术相比，本发明方法采用豆粕作为原料进行液体发酵，大大降低了成本提高了纳豆激酶产量；增加了固液分离步骤，大大提高了纳豆激酶纯度和单位酶活；获得的纳豆激酶含有保护剂(γ‑多聚谷氨酸)，可延长纳豆激酶的货架期；同时获得纳豆杆菌饲料，提高生产效率。所获纳豆激酶可以作为降脂溶栓保健品或药品原料使用，还能获得纳豆杆菌饲料，可供动物食用，减少动物的肠道疾病。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种保健品和益生菌饲料的制备，具体涉及一种基于液体发酵法制备纳豆激酶干粉及纳豆杆菌饲料的方法及应用。
背景技术
纳豆中最具开发价值的成分为有溶栓功能的纳豆激酶。纳豆激酶是一种由纳豆芽孢杆菌发酵产生的碱性胞外丝氨酸蛋白酶，其分子量为27.7KD，等电点为8.7，该酶在0℃-60℃的范围内是相对稳定的，在pH6-12时，该酶有很强的溶纤维能力，经过5次反复冻融后的纳豆激酶，仍可保持超过95％的活性(Sumi H et al.A novel fibrinolytic enzyme(nattokinase)in the vegetable cheese Natto：a typical and popular soybean foodin the Japanese diet[J].Experientia，1987，43(10)：1110.)。
目前，市面上常见的溶栓药物为尿激酶和链激酶，这两种药物只用于因梗塞而需抢救之时，而且用药是被限量的，否则会引发大出血，甚至死亡；如果有一种生物酶替代上述过分溶纤的尿激酶和链激酶的话，将是溶栓比较理想的改良型生物制剂。纳豆激酶的发现给我们带来福音，因为纳豆激酶就是具有这样特点的生物酶。由于纳豆激酶的广泛pH和温度耐受性及溶栓特异性，该酶也逐渐成为了人们预防和治疗血栓相关疾病最受欢迎的保健品和药品之一。
测定纳豆激酶纤溶活性最常见的方法为纤维蛋白原平板法(人工血栓平板法)，即可根据纤维蛋白原平板上透明圈面积的大小确定纳豆激酶的纯度或纤溶活性。也是纳豆激酶的发现者须见洋行博士最早使用的可靠方法。
在发酵纳豆激酶的过程中，会伴随着大量粘稠的副产物γ-多聚谷氨酸的产生(秦国宏等.枯草芽孢杆菌联产纳豆激酶和γ-聚谷氨酸[J].过程工程学报,2008(01)：120-124)。γ-多聚谷氨酸的聚合度在200-700，分子量范围从100KD-1000KD不等，分子量越大粘度越高。γ-多聚谷氨酸的等电点较低，在2.5左右(关阳等.γ-聚谷氨酸及其生物合成机制的研究进展[J].食品研究与开发，2014.35(02)：117-121)，而纳豆激酶的等电点较高，为8.7。在pH中性的条件下，纳豆激酶带正电，γ-多聚谷氨酸带负电，所以可以推测，在发酵液中二者是结合在一起的。γ-多聚谷氨酸是一种对人体和环境无毒无害的天然高分子(陈咏竹等.γ-聚谷氨酸的性质、发酵及其应用[J].微生物学通报，2004.31(01)：122-126)，所以，我们认为发酵液中与纳豆激酶结合的γ-多聚谷氨酸可作为纳豆激酶的保护剂，使得纳豆激酶活性得以保障，具有较长的货架期。
益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，可定植于动物肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡，产生有益作用的活性有益微生物的总称。常见的益生菌主要包括芽孢杆菌、双歧杆菌、乳杆菌等(李明阳等.益生菌的作用机理及抗菌性研究进展[J].农产品加工(创新版)，2011.31(09)：65-68+74)。纳豆杆菌属于芽孢杆菌的一个变种，具有广谱的抗菌抗病作用，其产生的抗菌素：如杆菌肽、多粘菌素、2,6-吡啶二羧酸，可抑制金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、伤寒菌及大肠杆菌等致病菌(张锦华等.纳豆提取物和纳豆芽孢杆菌的体外抑菌作用研究[J].江西畜牧兽医杂志，2006(06)：8+42)，若把该菌株作为饲料的添加剂，经动物食用后，可大大减少动物的肠道疾病。
目前，纳豆激酶的发酵方式主要有固体发酵和液体发酵两种，固体发酵的原料成本低，设备简陋，可以土法上马，但产酶量低，难以纯化，目前市面上很多没有纯化的纳豆产品都是通过固体发酵方式生产的；液体发酵对设备有一定要求，但规模易扩大，易于工业化，而目前纳豆激酶的液体发酵还处于实验室研究阶段，没有见液体发酵法大规模生产纳豆激酶的生产报道。此外，目前所公开和报道的通过液体发酵获得的纳豆激酶干粉的实验研究中，其液体培养基成分通常为价格较贵的黄豆粉，甚或大豆蛋白胨等，而且所报道的方法只获得了单一的纳豆激酶干粉，并没有对发酵后的纳豆杆菌进行利用。
本发明使用榨油废渣豆粕做原材料，替代价格高的黄豆或大豆蛋白胨，给出了廉价的液体发酵培养基配方，比目前报道的液体发酵方案，大大降低了原材料成本。
在建立可行的液体发酵法生产纳豆激酶工艺基础上，本发明还提出了发酵液中纳豆激酶的下游纯化方案。所获终产品大大提升了纳豆激酶的比活，使纳豆激酶发酵技术达到了可以工业化生产的要求。总之本发明首次贯通和完善了液体发酵法生产纳豆激酶的工艺。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于液体发酵法制备纳豆激酶干粉及纳豆杆菌饲料的方法及应用，该方法原料易得，普通的微生物发酵车间即可进行生产。通过本发明公开的工艺，能够同时获得纳豆激酶和纳豆杆菌饲料两种产品，充分利用资源，提高生产效率；纳豆激酶可以作为降脂溶栓保健品或药品原料使用；纳豆杆菌饲料可供动物食用，减少动物的肠道疾病。
本发明是通过以下技术方案来实现：
本发明公开的一种基于液体发酵法制备纳豆激酶干粉及纳豆杆菌饲料的方法，包括以下步骤：
1)培养基制备：采用废渣豆粕为原料，将豆粕研磨粉碎后过200目筛，制得豆粕粉；以质量百分比计，取2％～8％的豆粕粉，0.1％～0.5％的MgSO4，余量为水，自然pH值，灭菌处理后，冷却至室温，制得培养液；
2)接种发酵：将纳豆杆菌接种至步骤1)制得的培养液中，于30～40℃下进行液体发酵，液体发酵时间为30～40h，制得纳豆激酶发酵液；
3)固液分离：将纳豆激酶发酵液进行固液分离，收集上清液为纳豆激酶溶液，沉淀为湿的纳豆杆菌饲料。
4)干燥：将纳豆激酶溶液干燥处理后，制得纳豆激酶干粉；将湿的纳豆杆菌饲料烘干处理后，制得纳豆杆菌饲料。
优选地，步骤2)中，是按每100mL培养液接种0.5～5.0OD纳豆杆菌的接种量进行接种。
优选地，步骤2)中，液体发酵若采用摇床发酵，摇床转速为150～250rpm/min。更进一步优选地，摇床发酵处理时采用三角瓶进行，装液量为三角瓶体积的1/3～1/2。
优选地，步骤2)中，液体发酵若采用发酵罐有氧发酵，则通过调整通气量和搅拌转速使溶氧保持在30-50％。
优选地，步骤3)中，离心是在500～2000g的离心力条件下，离心10～30min。
优选地，步骤3)中，纳豆激酶溶液干燥方法为真空冷冻干燥。
优选地，步骤3)中，是将湿的纳豆杆菌饲料在40～60℃下烘干至含水量不超过5％，制得纳豆杆菌饲料。
本发明还公开了采用上述的方法制得的纳豆激酶干粉。
本发明还公开了上述的纳豆激酶干粉在制备溶栓药物和/或保健品中的应用。
本发明还公开了采用上述的方法制得的纳豆杆菌饲料。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1、本发明选择的发酵原料主要为豆粕，作为纳豆杆菌生长的碳源和氮源，比起现用的常规原料(黄豆粉、豆粕粉和大豆蛋白胨等)，大大降低了原料成本的同时不会影响纳豆杆菌的生长和纳豆激酶的产量。
2、在发酵后采用了固液分离技术，去除了发酵残渣和纳豆杆菌等大部分杂质，所得上清液制成干粉后，比起之前报道的不进行固液分离的产品，纳豆激酶的纯度和单位活力均有大幅度提高。
3、本发明采用固液分离后，可以选择性地留下大分子γ-多聚谷氨酸“杂质”在上清液酶溶液中。因此获得的“纳豆激酶干粉”中含有γ-多聚谷氨酸，而γ-多聚谷氨酸正好作为纳豆激酶的保护剂，延长纳豆激酶的货架期。
4、通过本发明的方法可获得两部分产品，尚未见类似报道。不仅获得纳豆激酶，而且获得纳豆杆菌饲料；纳豆激酶作为溶栓保健品和/或药品原料使用，纳豆杆菌饲料可供动物食用，减少动物的肠道疾病。
附图说明
图1为固体发酵和液体发酵方式下纳豆激酶的产率，即每克原料产生的纳豆激酶单位。说明纳豆激酶产率在液体发酵下是固体方式下的20倍左右。
图2为不同培养基添加物对纳豆激酶产量的影响比较结果；说明镁离子对纳豆激酶产率影响最大。
图3为发酵时间对纳豆激酶产量的影响结果；说明36小时左右最合适。
图4为不同离心力条件下所获产品中纳豆激酶的纯度和回收率；综合考虑纳豆激酶的纯度(比活力)和回收率，说明在离心力500g-2000g范围内进行离心是最合理的。
图5为离心前后制备的纳豆激酶干粉纯度比较；说明离心后纳豆激酶纯度是不离心时纯度的2.75倍以上。
图6γ-pGA延长NK货架期的加速实验；即在50℃下放置4小时，测定本发明产品和标准纳豆激酶酶活力的失活速度。表明纯品纳豆激酶失活更快，而含有γ-pGA的纳豆激酶失活速度慢很多。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
一、具体实施例
实施例1
将豆粕研磨粉碎，过200目筛。配制液体培养基：豆粕粉2％，MgSO4 0.1％，自然pH，每个三角瓶分装100mL，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却到室温。在每个三角瓶中接种1OD的纳豆杆菌溶液各1mL。将三角瓶置于恒温摇床在30℃和150rpm/min转速条件下培养30小时终止发酵。发酵完成后得到纳豆激酶发酵液，此发酵液于500g离心力条件下离心30分钟，收取上清液即为纳豆激酶溶液，收取沉淀即为湿的纳豆杆菌饲料。将纳豆激酶溶液-50℃条件下冷冻12小时后转移到冷冻干燥机中冻干15小时，即得纳豆激酶干粉，经纤维蛋白原平板检测，纳豆激酶干粉酶活为15300Fu/g。将所得湿的纳豆杆菌饲料装入浅盘，置于干燥箱调节温度为40℃，维持36小时，检测得纳豆杆菌饲料含水量为3％。
实施例2
将豆粕研磨粉碎，过200目筛。配制液体培养基：豆粕粉5％，MgSO4 0.5％，自然pH，每个三角瓶分装100mL，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却到室温。在每个三角瓶中接种1OD的纳豆杆菌溶液3mL。将三角瓶置于恒温摇床在35℃和200rpm/min转速条件下培养35小时终止发酵。发酵完成后得到纳豆激酶发酵液，此发酵液于2000g离心力条件下离心10分钟，收取上清液即为纳豆激酶溶液，收取沉淀即为湿的纳豆杆菌饲料。将纳豆激酶溶液-70℃条件下冷冻12小时后转移到冷冻干燥机中冻干25小时，即得纳豆激酶干粉，经纤维蛋白原平板检测，纳豆激酶干粉酶活为16130Fu/g。将所得湿的纳豆杆菌饲料装入浅盘，置于干燥箱调节温度为50℃，维持30小时，检测得纳豆杆菌饲料含水量为3％。
实施例3
将豆粕研磨粉碎，过200目筛。配制液体培养基：豆粕粉8％，MgSO4 0.3％，自然pH，每个三角瓶分装100mL，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却到室温。在每个三角瓶中接种1OD的纳豆杆菌溶液5mL。将三角瓶置于恒温摇床在40℃和250rpm/min转速条件下培养40小时终止发酵。发酵完成后得到纳豆激酶发酵液，将此发酵液用8层纱布过滤，收取滤液即为纳豆激酶溶液，收取滤渣即为湿的纳豆杆菌饲料。将纳豆激酶溶液-80℃条件下冷冻12小时后转移到冷冻干燥机中冻干36小时，即得纳豆激酶干粉，经纤维蛋白原平板检测，纳豆激酶干粉酶活为17010Fu/g。将所得湿的纳豆杆菌饲料装入浅盘，置于干燥箱调节温度为60℃，维持24小时，检测得纳豆杆菌饲料含水量为2％。
实施例4
豆粕研磨粉碎过200目筛。配制豆粕质量百分比为5％，加入MgSO4 0.3％，调节pH为7.0。
50L发酵罐管路经锅炉压力为0.20Mpa蒸汽消毒30min，发酵罐罐体1.0MPa空消30min后，发酵培养液上罐，1.0MPa实消30min，待培养液冷却为37℃左右时，按照每100mL培养液接种1.0OD纳豆杆菌进行接种。发酵罐进气口压力为0.25MPa，出气口压力为0.05MPa。发酵过程中，溶氧控制在40％，温度为37℃，通气量维持在15m3/h，发酵时间为36h。发酵结束后，发酵液自然沉降48小时。收取上清液即为纳豆激酶溶液，收取沉淀即为湿的纳豆杆菌饲料。将纳豆激酶溶液-80℃条件下冷冻12小时后转移到冷冻干燥机中冻干30小时，即得纳豆激酶干粉，经纤维蛋白原平板检测，纳豆激酶干粉酶活为14285Fu/g。将所得湿的纳豆杆菌饲料进行沸腾干燥后，检测得纳豆杆菌饲料含水量为4.5％。
注：本发明所用的纳豆杆菌采用市面上能够购买得到的普通纳豆粉按一般培养方法即可制得，具体制备方法如下：
从市面上购买的普通纳豆粉，均可作为纳豆激酶分离纯化的原材料。称取1g的纳豆粉溶于10mL无菌水中，充分混匀，制得纳豆粉悬液。移取纳豆粉悬液，并稀释成10-1-10-8浓度，吸取不同稀释度的该纳豆粉悬液200μL涂布于LB培养基，倒置培养皿于37℃培养12h，发现在10-6浓度时，菌落的生长状态最佳，挑选培养皿中的单菌落进行斜面保存。接种该单菌落于3％的豆粕培养基，37℃、200rpm/min摇床发酵36h，发酵完成后，发酵液于2000g条件下离心10min，上清液为待检测溶液。利用纤维蛋白平板法测定上述的待检测溶液的酶活，发现纤维蛋白原平板有明显的纤溶透明圈，说明所分离的菌株为纳豆杆菌，利用此纳豆杆菌作为发酵菌株。
二、制备工艺参数条件及效果验证实验
1、纳豆激酶活性测定方法：
纳豆激酶的酶活目前借用标准的尿激酶酶活来标定。尿激酶可以将乳白色的纤维蛋白原降解为无色透明的片段与小肽，根据纤维蛋白原平板上透明纤溶圈的大小(直径d的平方)，来表征尿激酶的纤溶活性，从而制作标准曲线。回归曲线为y＝259.23x+45.264，R2＝0.9966(x为d2，y为所对应的尿激酶酶活)。
纳豆激酶测定中，取待测定的纳豆激酶溶液10μL于纤维蛋白原平板的孔中，37℃恒温静置18小时取出，立即用游标卡尺测各纤溶圈的直径d，根据尿激酶酶活的标准曲线公式计算对应酶活。
2、固体发酵与液体发酵后的纳豆激酶产率比较实验
固体发酵：首先称取豆粕20g，用水浸泡12小时，再高压蒸煮豆粕20min，待温度降至室温，接种1.0OD纳豆杆菌搅拌均匀，37℃条件下发酵36小时即为一般市售纳豆胶囊类产品。称取10g发酵豆粕，用研钵研碎后加入5mL、0.05mol/L pH 10的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液搅拌均匀。混合溶液于2000g条件下离心10min，上清液为从固体发酵产品中提取的纳豆激酶溶液，用于后续测试。
液体发酵：首先将豆粕研磨粉碎，过200目筛即得豆粕粉。配制3％豆粕粉的发酵用液体培养基，自然pH，121℃高压蒸汽灭菌20min。冷却到室温后接种。纳豆杆菌种子液的接种量为每100mL培养液中加入1.0OD纳豆杆菌。采用三角瓶摇床发酵，装液量为三角瓶体积的1/3，恒温在37℃，摇床转速200rpm/min，发酵时间36小时。发酵完成后，发酵液于2000g条件下离心10min，上清液为液体发酵的纳豆激酶溶液，用于后续测试。
分别取上述的两种发酵方式获得的纳豆激酶溶液测定酶活。
测定结果如图1所示，液体发酵每克豆粕的产酶量为固体发酵豆粕产酶量的20倍左右，说明液体发酵产纳豆激酶量更高。因此，固体发酵很难实现工业化，而液体发酵是纳豆激酶必然的生产方式。
3、不同培养基添加物对纳豆激酶产量的影响比较
发酵用液体培养基，其组成为豆粕粉3％，分别添加0.2％的氯化铜、酵母浸粉、氯化钙、甘油、谷氨酸、硫酸镁，自然pH，121℃高压蒸汽灭菌20min。冷却到室温后接种。纳豆杆菌种子液的接种量为每100mL培养液中加入1.0OD纳豆杆菌。采用三角瓶摇床发酵，装液量为三角瓶体积的1/3，恒温在37℃，摇床转速200rpm/min，发酵时间36小时。发酵完成后，发酵液于2000g条件下离心10min，上清液为纳豆激酶溶液。
取上述的纳豆激酶溶液测定酶活表征不同添加物对纳豆激酶产量的影响。测定结果如图2，MgSO4的添加使纳豆激酶的产量比豆粕培养基提高了23％，说明在发酵过程中加入一定量的MgSO4可促进发酵过程中纳豆激酶的分泌，进而提高酶产量。
4、发酵时间对纳豆激酶产量影响
发酵用液体培养基，其组成为豆粕粉3％，MgSO4 0.3％，自然pH，121℃高压蒸汽灭菌20min。冷却到室温后接种。纳豆杆菌种子液的接种量为每100mL培养液中加入1.0OD纳豆杆菌。采用三角瓶摇床发酵，装液量为三角瓶体积的1/3，恒温在37℃，摇床转速200rpm/min，发酵时间36小时。发酵完成后，发酵液于2000g条件下离心10min，上清液为纳豆激酶溶液。
取上述纳豆激酶溶液测定对应酶活表征发酵时间对纳豆激酶产量的影响。
测定结果如图3，当发酵时间控制在30-40小时之间，获得的纳豆激酶溶液产量较大。但最佳发酵时间为36小时。
5、离心力条件的选择
发酵用液体培养基，其组成为豆粕粉3％，MgSO4 0.3％，自然pH，121℃高压蒸汽灭菌20min。冷却到室温后接种。纳豆杆菌种子液的接种量为每100mL培养液中加入1.0OD纳豆杆菌。采用三角瓶摇床发酵，装液量为三角瓶体积的1/3，恒温在37℃，摇床转速200rpm/min，发酵时间40小时。发酵完成后，发酵液于500g、1000g、2000g、4000g、6000g、8000g条件下离心10min，上清液为含有纳豆激酶的溶液，沉淀为豆渣和纳豆杆菌。
分别测定各样品纳豆激酶纯度(比活)、纳豆激酶回收率以及γ-聚谷氨酸含量，依此判断合理的离心力条件。
将不同离心力下的上清液，在-50℃下预冻12小时后，转入冷冻干燥机中冻干36小时，即得离心后的纳豆激酶干粉。纳豆激酶干粉0.5g溶于5mL 0.05mol/L pH 10的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，充分震荡混匀用于测定酶活，依此计算酶的纯度即比活。
回收率的计算方法为：回收率＝(离心后单位体积酶活×离心后酶溶液体积)/(离心前单位体积酶活×离心前酶溶液体积)。
采用CTAB比浊法测定γ-聚谷氨酸的含量。配制50-200μg/mL的γ-聚谷氨酸溶液，以及以1％NaOH为溶剂的10g/L的CTAB溶液，分别取1mL的γ-聚谷氨酸标准液于试管中，准确加入1mL的CTAB溶液，充分震荡。静置消泡后在350nm下测定吸光度，依据所测定数据制做工作曲线方程为y＝284.9x-4.7523,R2＝0.9928(x为350nm下的吸光度，y为γ-pGA的浓度μg/mL)。样品测定时，首先稀释样品溶液后用待测酶溶液替换标准γ-聚谷氨酸，使所测吸光度在标准曲线范围内即可，若超出范围重新稀释测定。
实验结果如图4，随着离心力的提高，虽然所获上清液产品中纳豆激酶的纯度越来越高，但回收率却越来越低。当离心力小于500g时，虽然纳豆激酶回收率很高，但纳豆激酶的纯度较低，因为上清液中含有一些纳豆杆菌；当离心力大于2000g时，纳豆激酶的纯度很高但回收率较低。
测定上清液中γ-多聚谷氨酸含量，发现随着离心力的提高，γ-多聚谷氨酸的含量逐渐下降，与纳豆激酶回收率的变化趋势一致。由此推测，带有负电荷的γ-多聚谷氨酸大分子的沉降导致带有正电荷的纳豆激酶共沉，致使上清液中的纳豆激酶含量逐渐减少，回收率逐渐降低。
考虑到γ-多聚谷氨酸对纳豆激酶活性的保护作用，我们进行固液分离的目的并不是要去除γ-多聚谷氨酸，我们只要去除溶液中的豆渣和纳豆杆菌即可。
综合考虑生产成本，为了既能保证纳豆激酶较高的回收率也能保证其较高的纯度，选择500g-2000g的离心力比较合理。在此条件下，所获上清液中无豆渣、基本不含纳豆杆菌、纳豆激酶的纯度较高且回收率也较高；沉淀中含有全部豆渣和大量纳豆杆菌，可作为益生菌饲料材料。
6、离心前后纳豆激酶干粉纯度比较
发酵用液体培养基，其组成为豆粕粉3％，MgSO4 0.3％，自然pH，121℃高压蒸汽灭菌20min。冷却到室温后接种。纳豆杆菌种子液的接种量为每100mL培养液中加入1.0OD纳豆杆菌。采用三角瓶摇床发酵，装液量为三角瓶体积的1/3，恒温在37℃，摇床转速200rpm/min，发酵时间12小时。
发酵完成后，将发酵液分为两部分，一部分直接进行冷冻干燥，另一部分在2000g条件下离心10min，收集上清液再进行冷冻干燥。具体方法同前述。
取离心前后的两种纳豆激酶干粉各0.5g溶于5mL pH 10的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，充分震荡混匀后测定纳豆激酶酶活，计算单位质量对应的酶活(比活)表征酶纯度。
实验结果如图5，发现离心后纳豆激酶冻干粉比活是离心前的2.75倍，表明离心后的纳豆激酶干粉纯度高很多。
7、γ-pGA延长纳豆激酶货架期的加速实验
发酵用液体培养基组成为豆粕粉3％，MgSO4 0.3％，自然pH，121℃高压蒸汽灭菌20min。冷却到室温后接种。纳豆杆菌种子液的接种量为每100mL培养液中加入1.0OD纳豆杆菌。采用三角瓶摇床发酵，装液量为三角瓶体积的1/3，恒温在37℃，摇床转速200rpm/min，发酵时间48小时。发酵完成后，发酵液先于1000g条件下离心10min，收集上清液。然后在-80℃下的条件下预冻上清液12小时，在冷冻干燥机种冻干36小时，即得自制纳豆激酶冻干品待用。
预实验中，取自制纳豆激酶冻干品0.5g溶于5mL 0.05mol/L pH 10的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，充分震荡混匀。按说明书配制购自Sigma公司的纳豆激酶标准品，并稀释到跟自制纳豆激酶相当的酶浓度。
取自制的含有γ-pGA的酶溶液和纯酶溶液各100μL于相同规格的离心管中，同时放置在55℃恒温箱中温育，4小时后取出测定其纤溶活性。
实验结果如图6，含有γ-多聚谷氨酸的自制纳豆激酶比活从最初的6792Fu/mL下降到4488Fu/mL，失活量为2304Fu/mL，失活速率为576Fu/mL·h-1；而纯的纳豆激酶标准品从最初的6900Fu/mL下降到2750Fu/mL，失活量为4150Fu/mL，失活速率为1038Fu/mL·h-1，可见γ-多聚谷氨酸的存在可以有效延长纳豆激酶货架期。
效果对比例：
1、与专利号为200710164632.1的专利相比，已公开的上述专利所用的主要发酵原材料为黄豆粉，成本高，而本发明选择的发酵主要原材料为豆粕，大大降低原料成本；已公开的上述专利发酵后直接冷冻干燥，无固液分离步骤，此方法获得的纳豆激酶中会有黄豆粉，导致纳豆激酶的纯度和单位酶活较低，本发明发酵后首先离心，去除了大量豆渣，所得纳豆激酶的纯度，即单位酶活大幅度提高；已公开的上述专利通过发酵只获得了含有纳豆杆菌的纳豆激酶溶液，产品形式单一，而本发明可获得两部分产品，纳豆激酶和纳豆杆菌饲料。
2、从市场调查可知，黄豆单价为10元/kg左右，而豆粕单价为8元/kg左右。豆粕也被称为脱脂大豆，除过脂肪含量比黄豆减少外，其余营养成分毫无损失。实验结果表明材料的替换并不影响纳豆杆菌的生长和纳豆激酶的产量。依此估算原材料由黄豆粉替换为豆粕粉，可以为企业节省20％的原料成本。
3、以往在纳豆或纳豆激酶生产中，无论通过固体发酵或液体发酵，在发酵完成后，都是直接将发酵体系中的物质全部进行干燥，并未进行残渣分离。本发明技术在发酵完成后，增加了固液分离步骤，和固体发酵相比，将纳豆激酶纯度从2200Fu/g提高到16281Fu/g，提高了6倍多。和不进行固液分离的液体发酵产品相比，将纳豆激酶纯度从5923Fu/g提高到16281Fu/g，提高了2倍多。可见本发明技术大大提高了纳豆激酶产品的纯度和单位酶活；
4、获得的纳豆激酶含有保护剂(γ-多聚谷氨酸)，可延长纳豆激酶的货架期；加速实验表明，在50℃恒温条件下温育4小时，含有γ-多聚谷氨酸的纳豆激酶失活速率为576Fu/mL·h-1，而纯的纳豆激酶标准品失活速率为1038Fu/mL·h-1，可见γ-多聚谷氨酸的存在可以有效延长纳豆激酶货架期。
5、本发明技术可以同时获得纳豆杆菌饲料，提高生产效率。
本发明首次采用固液分离(离心法、沉降法或过滤法)将发酵体系制备为两大部分，上清液主要含有纳豆激酶，而沉淀中主要含有发酵残渣和纳豆杆菌。上清液经过冻干获得很纯的纳豆激酶干粉，而沉淀经过低温干燥后获得含有活菌的益生菌饲料。本研究不产生废气废渣，环保节排，实现了洁净生产。更因为纳豆激酶纯度的提高给食用者带来更好的溶栓保健效果，益生菌饲料也给顾客创造了利润增长点。
综上所述，本发明公开的纳豆激酶干粉和纳豆杆菌饲料的联合制备方法，具体包括培养基的配制、纳豆杆菌的接种发酵、纳豆激酶溶液和纳豆杆菌饲料的分离、纳豆激酶溶液的干燥和纳豆杆菌饲料的干燥。与现有技术相比，本发明方法采用豆粕作为原料进行液体发酵，大大降低了成本提高了纳豆激酶产量；增加了固液分离步骤，大大提高了纳豆激酶纯度和单位酶活；获得的纳豆激酶含有保护剂(γ-多聚谷氨酸)，可延长纳豆激酶的货架期；同时获得纳豆杆菌饲料，提高生产效率。所获纳豆激酶可以作为降脂溶栓保健品或药品原料使用，还能获得纳豆杆菌饲料，可供动物食用，减少动物的肠道疾病。
Claims (4)
1.一种基于液体发酵法制备纳豆激酶干粉及纳豆杆菌饲料的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）培养液配制：以豆粕为原料，将豆粕研磨粉碎后过200目筛，制得豆粕粉；以质量百分比计，取2%~8%的豆粕粉，0.1%~0.5%的MgSO4，余量为水，自然pH值，灭菌处理后，冷却至室温，制得培养液；
2）接种发酵：将纳豆杆菌接种至步骤1）制得的培养液中，于30~40 ℃下进行液体发酵，液体发酵时间为30~40 h，制得纳豆激酶发酵液；
3）固液分离：将纳豆激酶发酵液进行固液分离，从纳豆激酶发酵液中沉淀豆粕残渣和纳豆杆菌，收集上清液为纳豆激酶溶液，沉淀为湿的纳豆杆菌饲料；固液分离以从发酵液中去除全部豆粕残渣和纳豆杆菌为准，固液分离采用离心分离，离心力介于500-2000 g，离心时间为10-30分钟；
4）干燥：分别将纳豆激酶溶液和湿的纳豆杆菌饲料进行干燥，同时获得纳豆激酶干粉和纳豆杆菌饲料；
将湿的纳豆杆菌饲料在40~60 ℃下烘干至含水量不超过5%，使饲料中的纳豆杆菌为活菌，制得纳豆杆菌饲料。
2.根据权利要求1所述的基于液体发酵法制备纳豆激酶干粉及纳豆杆菌饲料的方法，其特征在于，步骤2）接种发酵中，液体发酵采用摇床发酵或发酵罐有氧发酵。
3.根据权利要求2所述的基于液体发酵法制备纳豆激酶干粉及纳豆杆菌饲料的方法，其特征在于，若采用摇床发酵，摇床转速为150~250 rpm/min；若采用发酵罐有氧发酵，通过调整通气量和搅拌转速使溶氧保持在30%~50%。
4.根据权利要求1所述的基于液体发酵法制备纳豆激酶干粉及纳豆杆菌饲料的方法，其特征在于，步骤4）中，纳豆激酶的干燥采用真空冷冻干燥以保证纳豆激酶的活性。
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