CN108410829B - 蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶AmFAD7编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供提高植物抗旱性和抗寒性的蒙古沙冬青叶绿体ω‑3脂肪酸脱饱和酶基因AmFAD7及其获得方法，以及AmFAD7在提高植物抗旱性和抗寒性中的应用。本发明通过实验证实AmFAD7基因参与了植物响应干旱和低温胁迫的应答反应，将该基因在拟南芥中进行异源超表达可以显著提高转基因株系的抗旱性和抗冻性。因此，AmFAD7基因可用于植物抗旱性和抗寒性的基因工程改良。

Description

蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶AmFAD7编码基因与 应用

【技术领域】

本发明属于生物工程技术领域，涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及来源于强抗逆植物蒙古沙冬青的叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶(fatty aciddesaturase,FAD)AmFAD7编码基因及其在提高植物抗旱性和抗寒性中的应用。

【背景技术】

干旱和低温是影响植物生长发育的主要非生物胁迫因素。细胞膜系统是植物细胞与外界环境以及细胞器与细胞质之间的界膜。因此，细胞膜系统成为植物感受水分胁迫和低温的关键或原初部位。当植物遭受干旱胁迫时，细胞主动感知干旱信号并转换为细胞内信号，然后通过调控干旱相关基因的表达和蛋白质合成而改变植物生理生化代谢和形态结构，形成各种防御机制来抵御干旱胁迫。植物抗旱的生理基础是在水分胁迫条件下植物通过限制水分丧失和保持一定的吸水能力等途径，维持体内较高水势，使细胞处于正常的微环境中，从而进行正常的生理生化代谢过程。植物抗旱主要体现在基因表达、生理生化和形态结构等方面的变化，是一个复杂的过程。低温胁迫分为冷害(0℃以上)和冻害(0℃以下)两种。当冷害发生时，细胞膜脂的流动性会趋于降低甚至会损伤膜系统，细胞内蛋白质的合成和酶系统的活性以及基因表达等均会发生改变，从而影响细胞代谢等生命活动过程。冻害来袭时会导致植物细胞严重脱水，甚至会造成细胞内外结冰而使膜系统受到机械损伤，直接导致细胞死亡。生长于北半球的越冬植物随着秋季气温日渐降低，其细胞内会发生基因表达、生理生化代谢和膜脂组成等一系列变化，即低温驯化过程，从而增强其抗冻性以抵御冬季严寒。

大量研究表明，细胞膜的相变温度与植物的抗寒性(抗冷、抗冻性)密切相关。细胞膜的相变温度越低，植物的抗寒性越强。增加细胞膜脂中不饱和脂类或不饱和脂肪酸的含量可降低膜脂的相变温度，从而提高植物的抗寒性。因此，膜脂中的不饱和脂肪酸指数，即不饱和脂肪酸在总脂肪酸中的比值是衡量植物抗寒性的重要生理指标。抗寒性强的植物在长期的低温胁迫过程中，其细胞膜脂中多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)的含量会增多，从而降低膜脂的相变温度，利于维持细胞膜的流动性和完整性，获得在低温环境中进行生长发育的能力。较高的PUFA含量对于植物在干旱和高盐等逆境下的生存也有重要作用。

植物细胞膜脂中PUFA的组成主要包括二烯脂肪酸酸(C16:2和C18:2)和三烯脂肪酸(C16:3和C18:3)，其中亚麻酸(C18:3)和亚油酸(C18:2)、尤其是C18:3在大多数植物膜脂中的相对含量与抵抗低温和干旱等逆境胁迫关系最为密切。C18:3由一类膜结合型FAD在C18:2的ω-3(Δ-15)位置引入一个双键而生成，这类FAD被称为ω-3FAD。在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中共有三个ω-3FAD编码基因，即AtFAD3、AtFAD7和AtFAD8。其中前者编码产物分布于内质网膜上，而后两者编码产物均定位于叶绿体被膜中。这些基因以及它们在水稻(Oryza sativa)、番茄(Solanum lycopersicum)和大豆(Glycine max)等植物中的同源基因已被克隆，其中FAD7和FAD8型基因在抵抗低温和干旱等非生物胁迫中的作用已基本得到证实。将拟南芥AtFAD7和AtFAD8基因在烟草中超表达，可以增加转基因株系中三烯酸的含量并能分别提高其耐冷性和抗旱性，但却降低了其耐热性。番茄LeFAD7和水稻OsFAD8也具有类似的功能。在有些植物中FAD7和FAD8的编码基因成对存在甚至数目更多，这些基因在响应逆境胁迫上存在差异。例如，马齿苋(Portulaca oleracea)PoleFAD7和陆地棉(Gossypium hirsutum)GhiFAD7/8-1均受低温胁迫的诱导，而这些植物的PoleFAD8以及GhiFAD7/8-2和GhiFAD7/8-3却对低温胁迫无响应。这些研究结果表明FAD7和FAD8在植物抗逆性中起重要作用，而且来自不同植物或同一种植物的同源基因在功能上可能存在分化。

蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)是古老的第三纪濒危物种，为豆科蝶形花亚科沙冬青属仅有的两个种之一，主要分布在我国西北部海拔1000至1200米低山地带的沙漠、荒漠区，是这一地区唯一的常绿阔叶灌木。蒙古沙冬青可在冬寒夏热、年降水量不足200mm而年蒸发量在3000mm以上、土壤砾质或沙质且盐碱含量高的恶劣条件下生存，特别是能在-30℃甚至更严寒的冬季保持绿色而不死，具有非常强的抗寒、抗旱和耐热、耐盐碱等抗逆特性，是很难得的挖掘抗逆基因的宝贵遗传资源。发明人前期通过对该物种进行转录组分析，获得了AmFAD7基因的部分cDNA序列及其寒旱胁迫RNA-Seq表达谱。本发明利用半定量RT-PCR方法分析了AmFAD7基因在低温和干旱胁迫处理2～48h的表达模式以及在不同季节野外自然复合逆境下的表达变化，并通过3’RACE获得其全长cDNA序列，进而通过PCR技术克隆到该基因的gDNA和cDNA编码区、构建了其植物表达载体，然后通过转基因植物进行功能验证，证明了AmFAD7基因在抵抗干旱和低温逆境中起重要作用。

【发明内容】

本发明属于生物工程技术领域，涉及一个克隆自强抗逆植物蒙古沙冬青的叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶基因AmFAD7及其在提高转基因植物抗旱、抗寒性中的应用。其目的是提供该基因的编码序列、工程菌株及其在提高转基因植物抗旱性和抗寒性中的应用体系。

为了实现上述目的，本发明提供提高植物抗逆性的蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶基因AmFAD7的编码序列。

进一步地，本发明还提供含有上述蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶基因AmFAD7的克隆载体与植物表达载体。

另一方面，本发明提供蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶基因AmFAD7在提高植物抗旱性和抗寒性中的应用。

根据一种实施方式，所述蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶基因AmFAD7的序列是如SEQ No.2所示的全长cDNA序列。

根据另一种实施方式，所述蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶基因AmFAD7的序列是如SEQ No.4所示的gDNA序列。

根据另一种实施方式，所述蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶基因AmFAD7的序列是如SEQ No.5所示cDNA编码区序列。

可选地，在前述应用中，将所述AmFAD7基因或与其具有90％以上同源性且编码相同蛋白的cDNA或gDNA序列构建到植物表达载体上，通过转化方法导入植物细胞或组织，获得具有抗旱和抗寒特性的转基因植物。

根据一种优选的技术方案，所述植物为拟南芥，所述植物表达载体为p3300-35S-AmFAD7，所用转化方法为根癌农杆菌介导法。

本发明还提供蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶基因AmFAD7的编码蛋白序列，如SEQ No.3所示。

此外，本发明还提供蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶基因AmFAD7的全长cDNA序列的获得方法，包括如下步骤：

(1)总RNA提取：取蒙古沙冬青叶片为样品，用改进的Trizol法(Trizol试剂加2％的β-巯基乙醇和pH 4.8的3M KAc，后同)提取总RNA并进行纯化，保存于-76℃。

(2)3’RACE：根据如SEQ No.1所示的AmFAD73’-端缺失的cDNA序列设计基因特异性引物，取步骤(1)冻存的总RNA做模板，按照TaKaRa公司的3’RACE试剂盒说明书操作步骤扩增AmFAD7基因cDNA序列的3’-端；将所得3’-端序列与序列表中SEQ No.1所示的序列进行拼接，获得如序列表中SEQ No.2所示的AmFAD7基因的全长cDNA序列。

所述3’RACE引物为：

AmFAD7-Outer：5’-GATAATCAATGAGGCTAATGGGG-3’

AmFAD7-Inner：5’-AGAATCC TTGGAAGTCCATGAGC-3’。

其中，在上述步骤(2)中包括：

①反转录获得cDNA：

10μL反应体系中含：总RNA(500ng·μL^-1)1μL，5×PrimerScript Buffer 2μL，dNTP(10mM)1μL，RNase Inhibitor(40U·μL^-1)0.25μL，3’RACEAdaptor1μL，PrimerScript RTase(200U·μL^-1)0.25μL，RNase Free ddH₂O 4.5μL。反转录条件为：42℃60min；70℃15min。反应结束后将反转录反应液用于巢式PCR或者保存于-20℃备用。

②巢式PCR：

Outer PCR：25μL反应体系中含：反转录反应液1μL，1×cDNADilution BufferⅡ4μL，3’RACE Control Outer Primer(10μM)1μL，3’RACE Outer Primer(10μM)1μL，10×LAPCRBuffer 2.5μL，dNTP mixture(2.5mM)4μL，TaKaRa LA Taq(5U·μL^-1)0.25μL，用ddH₂O补足到25μL。PCR程序为：94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃保存。

Inner PCR：25μL反应体系中含：Outer PCR反应产物0.5μL，3’RACE Inner Primer(10μM)1μL，10×LAPCR Buffer 2.5μL，dNTP mixture(2.5mM)4μL，TaKaRa LATaq(5U·μL^-1)0.25μL，用ddH₂O补足到25μL。PCR程序为：94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃保存。

本发明还提供蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶基因AmFAD7基因的gDNA序列的获得方法，包括如下步骤：

(1)蒙古沙冬青基因组DNA提取：用常规CTAB法提取基因组DNA，然后保存于-20℃。

(2)蒙古沙冬青AmFAD7基因gDNA的扩增：以步骤(1)获得的蒙古沙冬青基因组DNA为模板，用特异性引物AmFAD7-F1和AmFAD7-R1进行PCR扩增。扩增反应体系为50μL，其中含5×TransStart Fast Pfu Buffer 10μL，dNTP(2.5mM)4μL，上下游引物各1μL(10μM)，基因组DNA 1μL，TransStart Fast Pfu DNAPolymerase(2.5U·μL^-1)1μL，用ddH₂O补足至50μL。反应程序为：95℃2min；95℃20sec，55℃20sec，72℃45sec，30个循环；72℃5min；4℃保存。

(3)目的片段克隆与测序：将步骤(2)获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的DNA片段，然后与pEASY-Simple-Blunt克隆载体连接并转化E.coli TOP10感受态细胞；用特异性引物AmFAD7-F1和AmFAD7-R1进行菌落PCR检测并进行测序验证；经测序确认的序列为所述AmFAD7基因的gDNA序列(SEQ No.4)。

步骤(2)和(3)所用特异性引物序列为：

AmFAD7-F1：5’-TGGATCCTGGGTTTCAATGGCAAGT-3’(BamHⅠ酶切点)

AmFAD7-R1：5’-ACCCGGGCTTATTTCTTAATCTGATG-3’(SmaⅠ酶切点)。

本发明还提供蒙古沙冬青AmFAD7基因的cDNA编码区的获得方法，包括以下步骤：

(1)cDNA合成：取蒙古沙冬青叶片为样品，用改进的Trizol法提取总RNA并进行纯化，然后保存于-76℃；以所得总RNA为模板，用Promega公司M-MLV逆转录酶合成cDNA第一链，向反应体系中加入以下成分：总RNA4μL，Oligo dT(40μM)1μL，用DEPC·ddH₂O补足至6μL，混匀，70℃下10min，冰上静置2min；加入5×M-MLVbuffer 2μL，dNTPmixture(10mM)0.5μL，RNase Inhibitor(200U·μL^-1)0.25μL，M-MLVReverse Transcriptase(200U·μL^-1)0.25μL，用DEPC·ddH₂O补足至10μL，混匀，42℃1h，70℃15min，-20℃保存。

(2)蒙古沙冬青AmFAD7cDNA编码区的PCR扩增：以步骤(1)合成的cDNA做模板进行PCR扩增，以获取AmFAD7基因的cDNA编码区片段。

AmFAD7cDNA编码区扩增引物序列为：

AmFAD7-F1：5’-TGGATCCTGGGTTTCAATGGCAAGT-3’(BamHⅠ酶切点)

AmFAD7-R1：5’-ACCCGGGCTTATTTCTTAATCTGATG-3’(SmaⅠ酶切点)。

50μL反应体系中含：步骤(1)中获得的cDNA 1μL，5×TransStart Fast PfuBuffer 10μL，dNTP mixture(2.5mM)4μL，AmFAD7-F1(10μM)1μL，AmFAD7-R1(10μM)1μL，TransStart Fast Pfu DNAPolymerase(2.5U·μL^-1)1μL，用ddH₂O补足至50μL。反应程序为：95℃2min；95℃20sec，55℃20sec，72℃45sec，30个循环；72℃5min；4℃保存。

(3)目的片段克隆与测序：将步骤(2)获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的DNA片段，然后与pEASY-Simple-Blunt克隆载体连接并转化E.coli TOP10感受态细胞；用AmFAD7cDNA编码区引物进行菌落PCR检测并进行测序验证；将测序确认的单克隆菌液及其载体质粒DNA保存于-76℃；经测序验证的AmFAD7cDNA编码区序列如SEQ No.5所示(1,368bp)。

本发明通过实验证实AmFAD7基因参与了植物响应低温和干旱胁迫的应答反应，将AmFAD7基因在野生型拟南芥中超表达可以显著提高转基因株系的抗旱性和抗寒性，因此AmFAD7基因可用于植物抗旱、抗寒性的基因工程改良。

【附图说明】

图1为AmFAD73’RACE产物的电泳图谱。其中M为Trans2K Plus DNAMarker，1为3’RACE产物。

图2为AmFAD7基因gDNA编码区片段的PCR扩增图谱。其中1为扩增产物，M为Trans2KPlus DNAMarker。

图3为AmFAD7cDNA编码区的RT-PCR扩增图谱。其中1为扩增产物，M为Trans2KPlusDNAMarker。

图4为AmFAD7蛋白与AmFAD8(蒙古沙冬青另一个叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶)和拟南芥及大豆FAD7及FAD8蛋白的氨基酸序列比对图。其中▲代表组氨酸簇。

图5为AmFAD7蛋白与AmFAD8以及其他植物ω-3FAD蛋白的进化树。其中括号内为蛋白序列在Genbank中的接收号。

图6为AmFAD7基因在低温和干旱胁迫处理的蒙古沙冬青幼苗中的RNA-Seq表达谱。其中CK为正常生长条件，C2、C8、C24和D2、D8、D24分别为低温和干旱处理2h、8h和24h。

图7为AmFAD7在不同胁迫处理的蒙古沙冬青幼苗中的半定量RT-PCR检测结果。

图8为AmFAD7在不同季节野外自然条件下生长的蒙古沙冬青植株嫩叶中的表达变化。

图9为AmFAD7植物表达载体构建的菌落PCR检测和质粒酶切鉴定图谱。其中A为菌落PCR检测图谱，B为质粒酶切鉴定图谱；A中的1为PCR产物，M为Trans2K Plus DNAMarker，B中的1为质粒酶切产物，M为D15000+2000DNAMarker。

图10为AmFAD7转基因拟南芥T1代植株中AmFAD7的PCR检测图谱。其中1～8为8个T1代植株，WT为野生型，M为Trans2K Plus DNAMarker。

图11为野生型拟南芥和AmFAD7转基因拟南芥在甘露醇培养基上的生长情况。其中A为1/2MS培养基上萌发6d，B为1/2MS+300mM甘露醇培养基上萌发6d；WT为野生型，T3-2、T3-3、T3-4为3个T3代转基因株系。

图12为干旱处理前后野生型拟南芥和AmFAD7转基因拟南芥的生长情况。其中A为停水前，B为停水后第19天，C为复水后第11天；A～C中WT为野生型，T3-3为T3代转基因株系。

图13为野生型拟南芥和AmFAD7转基因拟南芥的离体叶片含水率。其中WT为野生型，T3-2、T3-3和T3-4为T3代转基因株系。

图14为低温处理前后野生型拟南芥和AmFAD7转基因拟南芥的生长情况。其中A、B、C分别为低温处理前和处理后第10天与第20天；A～C中WT为野生型，T3-3为T3代转基因株系。

图15为低温处理后野生型拟南芥和AmFAD7转基因拟南芥的株高。

【具体实施方式】

在本发明中，涉及以下培养基：

YEB固体培养基：胰蛋白胨10g·L^-1，蔗糖5g·L^-1，酵母提取物1g·L^-1，MgSO₄·7H₂O0.5g·L^-1，琼脂粉15g·L^-1，高压灭菌。

YEB液体培养基：胰蛋白胨10g·L^-1，蔗糖5g·L^-1，酵母提取物1g·L^-1，MgSO₄·7H₂O0.5g·L^-1，高压灭菌。

1/2MS培养基：10×MS大量元素母液5mL，100×MS微量元素母液1mL，100×MS有机物母液1mL，100×MS铁盐母液1mL，蔗糖1g，琼脂粉0.55g(水平放置)或0.65g(垂直放置)，用蒸馏水溶解并用NaOH调pH至5.8，最后用蒸馏水定容至100mL，高压灭菌。

本发明所涉及的引物序列见表1。

表1本发明所涉及的引物及其序列

*下划线部分为酶切位点。

以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。

实施例1 AmFAD7基因的克隆与序列分析

1.1 AmFAD7基因全长cDNA序列的获取

本发明申请人前期通过对蒙古沙冬青进行转录组测序和表达谱分析，获得一个受低温和干旱胁迫诱导的编码FAD的cDNA序列，其长度为900bp，序列如SEQ No.1所示。根据基因注释信息，该序列与拟南芥和大豆叶绿体型FAD7有较高同源性，故此将其命名为AmFAD7。利用Omiga软件分析其编码区并在GenBank数据库中进行同源序列搜索与比对，发现AmFAD7的编码区在3’-端不完整。为此，首先对其进行了如下3’RACE反应。

(1)取蒙古沙冬青叶片为样品，用改进的Trizol法提取总RNA并进行纯化，保存于-76℃。

(2)根据AmFAD7基因3’-端缺失的cDNA序列(如SEQ No.1所示)设计基因特异性3’RACE引物AmFAD7-3’Outer和AmFAD7-3’Inner，以冻存的总RNA做模板，按照TaKaRa公司的3’RACE试剂盒说明书操作步骤扩增AmFAD7基因cDNA序列的3’-端，结果获得一条1,346bp的序列(图1，泳道1)；将该序列与AmFAD7原序列(900bp，如SEQ No.1所示)进行拼接，获得全长为2,187bp的序列(如SEQ No.2)，它含有1,368bp的完整编码区(序列如SEQ No.5所示)和474bp的5’UTR与345bp的3’UTR，故此确认其为AmFAD7基因的全长cDNA序列(SEQ No.2)。

其中，在上述步骤中包括：

①反转录获得cDNA：10μL反应体系中含：总RNA(500ng·μL^-1)1μL，5×PrimerScript Buffer 2μL，dNTP(10mM)1μL，RNase Inhibitor(40U·μL^-1)0.25μL，3’RACEAdaptor 1μL，PrimerScript RTase(200U·μL^-1)0.25μL，RNase Free ddH₂O 4.5μL。反转录条件为：42℃60min；70℃15min。反应结束后反转录反应液用于巢式PCR或者保存于-20℃备用。

②巢式PCR：

Outer PCR：25μL反应体系中含：反转录反应液1μL，1×cDNADilution BufferⅡ4μL，3’RACE Control Outer Primer(10μM)1μL，3’RACE Outer Primer(10μM)1μL，10×LAPCRBuffer 2.5μL，dNTP mixture(2.5mM)4μL，TaKaRa LA Taq(5U·μL^-1)0.25μL，用ddH₂O补足到25μL。PCR程序为：94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃保存。

Inner PCR：25μL反应体系中含：Outer PCR反应产物0.5μL，3’RACE Inner Primer(10μM)1μL，10×LAPCRBuffer 2.5μL，dNTP mixture(2.5mM)4μL，TaKaRa LATaq(5U·μL^-1)0.25μL，用ddH₂O补足到25μL。PCR程序为：94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃保存。

巢式PCR所用引物序列为：

AmFAD7-Outer：5’-GATAATCAATGAGGCTAATGGGG-3’

AmFAD7-Inner：5’-AGAATCC TTGGAAGTCCATGAGC-3’

1.2 AmFAD7基因gDNA的克隆

(1)蒙古沙冬青基因组DNA提取：用常规CTAB法提取蒙古沙冬青幼苗基因组DNA，保存于-20℃备用。

(2)AmFAD7基因gDNA的扩增：以蒙古沙冬青基因组DNA为模板，用AmFAD7基因编码区特异性引物AmFAD7-F1和AmFAD7-R1进行PCR扩增。扩增反应体系为50μL，其中含5×TransStart Fast Pfu Buffer 10μL，dNTP(2.5mM)4μL，上下游引物各1μL(10μM)，基因组DNA 1μL，TransStart Fast Pfu DNA Polymerase(2.5U·μL^-1)1μL，用ddH₂O补足至50μL。反应程序为：95℃2min；95℃20sec，55℃20sec，72℃45sec，30个循环；72℃5min；4℃保存。经电泳检测，获得预期大小(2,278bp)的扩增产物(图2，泳道1)。

(3)将此片段回收、克隆并测序，证明获得了AmFAD7基因编码区gDNA序列，其长度为2,247bp，序列如SEQ No.4所示。

(4)AmFAD7基因内含子分析：将AmFAD7基因的gDNA编码区序列(SEQ No.4)与其cDNA编码区序列(SEQ No.5)进行比对，发现在其gDNA编码区中含有8个外显子和7个内含子。这些外显子和内含子所在的具体位置和大小见表2。

表2 AmFAD7基因gDNA编码区中外显子与内含子所在位置和大小

1.3 AmFAD7基因cDNA编码区的克隆

(1)cDNA合成：以上述1.1中步骤(1)所获得的总RNA(-76℃冻存)做模板，用Promega公司M-MLV逆转录酶合成cDNA第一链。具体操作按照说明书进行。向反应体系中加入以下成分：总RNA4μL，Oligo dT(40μM)1μL，用DEPC·ddH₂O补足至6μL，混匀，70℃10min，冰上静置2min；加入5×M-MLV buffer 2μL，dNTP mixture(10mM)0.5μL，RNase Inhibitor(200U·μL^-1)0.25μL，M-MLV Reverse Transcriptase(200U·μL^-1)0.25μL，用DEPC·ddH₂O补足至10μL，混匀，42℃1h，70℃15min，-20℃冰箱保存。

(2)AmFAD7cDNA编码区的PCR扩增：在AmFAD7基因全长cDNA序列(SEQNo.2)的编码区两侧设计引物AmFAD7-F1和AmFAD7-R1，以上一步获得的cDNA做模板进行PCR扩增。扩增体系为：50μL反应体系中含：步骤(1)中获得的cDNA1μL，5×TransStart Fast Pfu Buffer 10μL，dNTP mixture(2.5mM)4μL，AmFAD7-F1(10μM)1μL，AmFAD7-R1(10μM)1μL，TransStartFast Pfu DNA Polymerase(2.5U·μL^-1)1μL，用ddH₂O补足至50μL。反应程序为：95℃2min；95℃20sec，55℃20sec，72℃45sec，30个循环；72℃5min；4℃保存。经电泳检测，获得预期大小为1,399bp的片段(图3，泳道1)。将该片段与克隆载体连接后转化E.coli，经菌落PCR检测获得了阳性克隆。将阳性克隆进行测序，证明获得了序列正确的AmFAD7基因的cDNA编码区片段，其大小为1,368bp，序列如SEQ No.5所示。

1.4 AmFAD7蛋白序列分析与进化树构建

用ProParam、TMHMM Serverv2.0、TargetP1.1Server和ChloroP 1.1Server等软件对AmFAD7的编码蛋白进行分析，结果显示该蛋白含455个氨基酸残基，相对分子质量为51.76KDa，等电点为7.84；在其第139～161位、第288～310位和第317～339位具有3个跨膜结构域；在其N末端含有由76个氨基酸残基组成的叶绿体导肽序列。用Clustal-X和GeneDoc程序将AmFAD7蛋白与模式植物拟南芥和大豆的叶绿体型ω-3FAD(即FAD7和FAD8)蛋白进行多序列比对(图4)，发现在AmFAD7的第174～178位、第210～214位和第377～381位分别存在FAD家族酶活性所必须的三个保守的组氨酸簇，即HXXXH、HXXHH和HXXHH。这些序列特征表明AmFAD7可能编码一种定位于叶绿体的具有FAD酶活性的蛋白。

用MEGA7.0软件通过邻接法(Neighbor-Joining,NJ)对AmFAD7蛋白与拟南芥、大豆、油菜和播娘蒿的ω-3FAD蛋白序列构建进化树，结果如图5所示：AmFAD7与这些植物的叶绿体型FAD7聚在一类，而所有内质网型ω-3FAD，即FAD3聚在另一类。在叶绿体型ω-3FAD中，AmFAD7与大豆GmFAD7-1/-2距离较近，而与拟南芥、油菜和播娘蒿的FAD7距离较远。这与蒙古沙冬青和大豆同属于豆科植物相一致，同时表明AmFAD7可能编码一种叶绿体型的ω-3脂肪酸脱饱和酶。

实施例2 AmFAD7基因的表达分析

2.1 AmFAD7基因在干旱和低温胁迫下的RNA-Seq表达谱

本发明申请人在前期通过对蒙古沙冬青进行转录组分析，获得了AmFAD7基因的cDNA序列(SEQ No.1)，同时发现该基因的转录水平在干旱和低温胁迫下显著上调(表达变化倍数≥2)。其具体的RNA-Seq表达谱数据如图6所示。从图6可见，在正常生长条件下(CK，对照)，AmFAD7在蒙古沙冬青幼苗中低水平表达[其RPKM(reads per kilobase permillion reads)值为0.78]；在干旱胁迫2、8和24h后，其表达水平分别增加到对照的155.2、25.1和2.4倍；在低温处理2、8和24h后，其表达量分别为对照的6.5、12.1和7.4倍。这些数据表明AmFAD7可能在蒙古沙冬青应答干旱和低温胁迫中起重要作用。

其中，RNA-Seq表达谱分析及数据统计方法参见《武雅琪，利用RNA-Seq技术分析蒙古沙冬青低温胁迫表达谱及其AmNAC2基因的克隆，内蒙古农业大学硕士学位论文，2014.6》。

2.2 AmFAD7在不同胁迫条件下的半定量RT-PCR分析结果

2.2.1蒙古沙冬青胁迫处理与取样

采用沙培法将蒙古沙冬青幼苗培养至一个月，然后进行如下胁迫处理。

干旱处理：将幼苗从法土盆中取出并用自来水漂洗干净，然后放在滤纸上于25℃、弱光照下进行自然干燥，分别在处理前(0h)和处理后2、6、12、24和48h取幼苗、冻存。

低温处理：将沙培苗放入低温光照培养箱(Percival LT-36VL,Percival,USA)中进行4℃24h、0℃12h和-6℃12h(共48h)的低温处理，分别在处理前(0h)和处理后2、6、12、24和48h取出幼苗并用4℃预冷的自来水漂洗沙子，冻存。

此外，取不同季节野外自然条件下生长的蒙古沙冬青植株嫩叶为样品，冻存，用于RNA提取和表达分析。取样于2015年7月至2016年5月、在每个月的1～5号上午进行，取样地点位于呼和浩特市南郊蒙草抗旱公司野生植物园区。

所有样品的冻存方法均为先在液氮中速冻，然后保存于-76℃。

2.2.2半定量RT-PCR分析方法

利用改进的Trizol法从各组冻存样品中提取总RNA，再用RNase-Free DNaseⅠ(Promega公司)进行纯化；取1.5μg纯化的RNA做模板，用M-MLV逆转录酶(TaKaRa公司)合成cDNA第一链；以蒙古沙冬青AmACTIN(序列如SEQNo.6所示)作为内参基因(引物为AmACTIN-F和AmACTIN-R，序列见表1)，以稀释10倍的cDNA第一链做模板，用AmFAD7基因表达引物AmFAD7-F2和AmFAD7-R2(序列见表1)进行半定量RT-PCR分析。15μL反应体系中含：10×PCR缓冲液1.5μL，dNTP(2.5mM)1.2μL，上下游引物各0.3μL(10μM)，cDNA模板XμL，rTaq酶(5U·μL^-1)0.15μL，剩余体积用ddH₂O补足。PCR程序为：94℃3min；94℃30sec，60℃30sec，72℃45sec，32个循环；72℃10min；4℃保存。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据条带的亮度估计基因的表达量。每个样品至少进行3次独立PCR实验。

2.2.3 AmFAD7在干旱和低温胁迫下的表达变化

按照2.2.2中所述方法，对AmFAD7在干旱和低温胁迫下的表达变化进行了分析，结果如图7所示。在胁迫处理前正常条件下(0h，对照)，AmFAD7基因有明显的基础表达；在干旱处理2h后其表达量明显增加，在此后继续处理6～48h期间，其表达量基本维持在与处理后2h类似的水平；在低温处理2h后其表达量比处理前略有降低，但在处理6～48h之后其表达量逐渐升高且明显高于处理前水平。这一结果表明AmFAD7的表达受干旱和低温胁迫的诱导，该基因有可能在抵抗这些逆境胁迫中发挥功能。

2.2.4 AmFAD7在不同季节野外自然条件下的表达变化

基因在野外自然条件下的表达变化更能反映其响应复杂自然环境的真实情况。蒙古沙冬青作为中亚荒漠区唯一的常绿阔叶植物，其在适应分布地秋、冬季气温大幅度降低和春季气温迅速回升过程中AmFAD7的表达变化值得探究。分析结果表明(图8)，在初夏(7月初)天气较热时，AmFAD7有少量表达；在进入秋季(9～11月)后随着气温降低，AmFAD7的表达量逐渐升高，尤其在11月初升高更为明显；在进入初冬即12月初时，其表达量基本维持不变(与11月初接近)，但在进入翌年1月份更寒冷时期，该基因的表达量又明显大幅升高且达到全年最高；之后随着春季(3～5月初)气温回暖，其表达量又呈现出先大幅明显降低而后略有回升的变化趋势，但均低于其在1月份的表达水平。总体而言，AmFAD7的转录水平与一年四季温度的高低呈负相关(图8)，因此可能在蒙古沙冬青度过漫长的寒冷季节中起重要作用。

实施例3 AmFAD7转基因拟南芥的获得与抗逆功能验证

3.1 AmFAD7植物表达载体的构建

根据实施例1中所述方法克隆到AmFAD7基因的编码区cDNA片段，定向连接到植物双元表达载体pCAMBIA3300(p3300)-35ST的35S启动子之后，构建成超表达载体p3300-35S-AmFAD7。在其构建过程中转化E.coli DH5α感受态细胞后的菌落PCR检测结果见图9A，其质粒DNA酶切鉴定结果(用BamHⅠ和SmaⅠ双酶切)见图9B，均得到预期大小的目的片段，表明获得了插入序列和位置正确的AmFAD7植物表达载体。

3.2 AmFAD7转基因拟南芥的获得

3.2.1植物表达载体转化农杆菌

取3.1中获得的表达载体(p3300-35S-AmFAD7)质粒DNA约1μg，用常规冻融法转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞，涂布于YEB固体培养基平板上(含125μg·mL^-1Rif和75μg·mL^-1Kan)，在28℃培养36～48h；挑取单菌落到YEB液体培养基中(含125μg·mL^-1Rif和75μg·mL^-1Kan，后同)，在28℃、170rpm摇菌；用AmFAD7基因cDNA编码区引物AmFAD7-F1和AmFAD7-R1(序列见表1)进行菌落PCR检测，结果获得了被成功转化的GV3101阳性克隆，保存于-76℃。

3.2.2农杆菌介导法转化拟南芥

将3.2.1中获得的农杆菌阳性克隆接种于YEB液体培养基中摇菌，然后通过离心收集菌体细胞；将菌体沉淀用附加5％蔗糖的1×MS培养基大量元素溶液悬浮，然后添加0.3‰的表面活性剂silwet，用沾花法转化野生型拟南芥(Columbia0)；待转化植株成熟时混合收种，得到T1代种子；将T1代幼苗用0.5‰草丁瞵(Phosphinothricin,PPT)进行喷雾筛选，存活下来的绿苗为转基因T1代阳性植株；取T1代阳性植株的嫩叶用SDS法提取基因组DNA，然后用AmFAD7基因cDNA编码区引物AmFAD7-F1和AmFAD7-R1(序列见表1)进行PCR检测，有目的条带(大小1399bp)者即被确定为转基因植株，可用于繁殖T2和T3代株系。

本发明共获得18株T1代PPT抗性植株，对其基因组DNA进行PCR扩增全部都检测到清晰的AmFAD7转基因目的条带，而对照野生型(WT)中未检测到任何条带。图10所示为部分检测结果。

3.3 AmFAD7转基因拟南芥的抗逆性鉴定

3.3.1 AmFAD7转基因株系的抗旱性鉴定

(1)转基因株系种子萌发期抗旱性的鉴定

将野生型拟南芥(WT)和3.2.2中得到的三个转基因植株的T3代纯合株系(T3-2、T3-3和T3-4)的种子分别点种在1/2MS固体培养基(对照)和附加250或300mM甘露醇的1/2MS固体培养基上，观察种子萌发和幼苗生长状况。结果表明，在1/2MS培养基上，三个转基因株系与野生型在种子萌发率和幼根及子叶生长方面无明显差别(见表3和图11A)，但在附加250或300mM甘露醇的1/2MS培养基上，三个转基因株系的种子萌发率(平均分别为37.9±4.8％和22.6±2.9％)显著高于野生型(分别为20.7±4.2％和10.7±2.5％)(P<0.05)，其幼苗生长也比野生型好(如图11B所示)，表明异源超表达AmFAD7能够提高转基因植物在种子萌发期对水分胁迫的耐受性。

表3野生型拟南芥和AmFAD7转基因拟南芥在水分胁迫下的种子萌发率(％)

注：萌发第6天统计；*表示转基因株系与野生型在P<0.05水平上差异显著。

(2)转基因株系植株生长发育期抗旱性的鉴定

将野生型(WT)和转基因株系T3代纯合体(T3-2、T3-3和T3-4)幼苗栽种于营养钵中(含1:1的蛭石与营养土)，于正常条件下(22℃，每天光照16h)培养两周，然后停止浇水19天(停水前一天浇足水分)，观察比较二者的生长和受损伤情况。结果表明，在停水处理两周后转基因株系和野生型植株的叶片均出现萎蔫且变成深绿色，其生长均受到抑制且逐渐停滞；在停水后第19天，野生型植株几乎全部枯黄甚至出现死亡，而转基因株系枯黄程度较轻，其部分叶片仍保持生活状态(如图12B所示)；此时恢复浇水，转基因株系大部分植株能较快恢复绿色生长状态，而野生型恢复较慢并有部分植株不能恢复而枯死(如图12C所示)。在复水后第10天进行统计，三个转基因株系的存活率平均为75.4±3.3％，而野生型为50.2±3.2％，显著低于前者。这一结果表明异源超表达AmFAD7能够提高转基因植物对于干旱逆境的耐受能力，尤其是能够提高其在干旱解除后的恢复生长能力。

表5野生型拟南芥和AmFAD7转基因拟南芥在干旱处理后的存活率(％)

注：复水后第10天统计；*表示转基因株系与野生型在P<0.05水平上差异显著。

(3)转基因株系离体叶片保水力的估测

叶片保水力是衡量植物抗旱性的一项重要指标，可用离体叶片含水率的变化来衡量，为此对AmFAD7转基因拟南芥的该项指标进行了测定。

从营养钵中(含1:1的蛭石与营养土)正常培养四周龄的植株上剪取莲座叶约0.5g，置于锡箔纸上并称重(0h，初始鲜重A)，然后在室温(24℃)、散射光下放置9h，期间每隔0.5h称鲜重一次(某一时间点鲜重B)。当最后一次(9h)称量鲜重后将样品放于85℃烘干至恒重，记录此时干重(C)，计算每个时间点相对于0h的含水率。某一时间点叶片含水率(％)＝(B-C)/(A-C)×100％。实验重复三次，平均结果如表4和图13所示。

表4野生型拟南芥和AmFAD7转基因拟南芥离体叶片含水率(％)的变化

注：*表示转基因株系与野生型在P<0.05水平上差异显著。

从表4和图13可见，野生型和转基因拟南芥离体叶片的含水率在测定期间均逐渐降低，但转基因株系在几乎每个时间点(只有0.5h例外)的降低幅度均小于野生型，而且随着时间延长这种差异逐渐加大并达到显著水平。例如，在离体4h后，野生型含水率为63.5±1.2％，而三个转基因株系的含水率在65.7±1.0～70.0±1.4％之间，平均为67.9±1.1％，高于前者4.4％；而在离体9小时后，野生型的含水率为35.2±1.0％，而三个转基因株系的含水率在41.0±0.8～46.0±0.7％之间，平均为44.0±1.1％，高于前者8.8％。由此可见，异源超表达AmFAD7能够显著提高转基因植物叶片的保水能力，这对于耐受大气与土壤干旱非常重要。

3.3.2 AmFAD7转基因株系的抗冻性鉴定

脂肪酸脱饱和酶与植物抗寒性关系密切，为此对AmFAD7转基因株系抗冻性的变化进行了鉴定。鉴定方法与结果如下。

将实施例3.3.1中的转基因株系(T3-2、T3-3和T3-4)和野生型拟南芥(WT)幼苗栽种于营养钵中(含1:1的蛭石与营养土)，于正常条件下(22℃，每天光照16h)培养两周，然后放入低温光照培养箱(Percival LT-36VL,Percival,USA)中进行-6℃5h(冰冻)和4℃24h(解冻)的低温处理，处理结束后将幼苗放回培养室在正常条件下继续培养。

在低温处理结束后观察到野生型拟南芥的幼苗几乎全部受冻萎蔫，当放回到正常培养条件后有部分幼苗不能恢复而死亡，其余幼苗虽能存活但生长缓慢，而转基因株系除有个别叶片受冻萎蔫外，其余绝大部分幼苗外观正常，能够很快恢复生长。这些材料在处理前后的具体表型如图14(图中A、B、C分别为低温处理前和处理后第10天与第20天拍照)和图15所示。

在恢复正常培养后第20天统计存活率并测量株高，结果转基因株系这两项指标的平均值分别为83.7±4.9％和7.2±0.3cm，均显著高于野生型(分别为61.0±1.5％和3.0±0.4cm)(表6)。这些数据证实，异源超表达AmFAD7可以显著提高转基因植物在冰冻条件下的存活率及其在升温后的恢复生长能力。

表6野生型拟南芥和AmFAD7转基因拟南芥在低温处理后的存活率(％)和株高(cm)

注：低温处理后第20d统计；*表示转基因株系与野生型在P<0.05水平上差异显著。

综上所述，AmFAD7基因参与了植物响应干旱和低温胁迫的应答反应，将其进行异源超表达能够显著提高转基因植物在寒旱逆境下的存活率及其在逆境解除后的恢复生长能力，从而显著提高其对寒旱逆境的抗性。因此，AmFAD7基因可作为植物抗旱、抗寒性基因工程改良的重要基因资源。

序列表

<110> 内蒙古农业大学

<120> 蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶AmFAD7编码基因与应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 900

<212> DNA

<213> 蒙古沙冬青AmFAD7 3’-端缺失的cDNA序列(人工序列)

<400> 1

cttccacttc catgataggt caaaaacacg gcaaagaatc agaggaatta tattccacaa 60

ttctacacat gagaatcaac atcaattcaa ttcatcacaa tataataaaa ctaaacacgg 120

attggtttgg tcacttccac actaaacaca caacaaatca caacacagta cacgtatgac 180

caaattcaca acaaccatcg ccacctcctt caccctctta tatttaactt ctatctccaa 240

attccaaaac cataacacaa acacaacgag actctttttt cttcctaccc tttaaaccct 300

tttggcttca cttattctta aagccttaaa gctaagattt ttatcactga agcttaagaa 360

cttcagagaa atatagagta acaacgttgg tgtgtgtggt tggtgtgtga agttgaagaa 420

acacaaagct tctagccaaa gatccttttg gtccaaaatt ccatctgggt ttcaatggca 480

agttgggttt tatcagaatg tggcttaaag cctcttcctc caatgtttgc aagacccaga 540

attggtgctg tgttatcaaa gtcctcaaag gttagatttt ttaacacaaa caagggagtg 600

gcagatctga actttcaagg aagaaacttt tcaagttttg gcattaggga gagaaactgg 660

ggtttgaaag tgagtgtccc tttaagggtt gaccctattg aaggagaaga ggaagaaagt 720

aaaaagataa tcaatgaggc taatggggtt aaactggaat tgccagaatt tgaccctggt 780

gcaccaccac cattcaattt ggctgatatt agagcagcta ttccaaagca ttgttgggtg 840

aagaatcctt ggaagtccat gagctatgtt gttagagatg tcattgtggt ttttgggttg 900

<210> 2

<211> 2187

<212> DNA/RNA

<213> 蒙古沙冬青AmFAD7 cDNA序列(人工序列)

<400> 2

cttccacttc catgataggt caaaaacacg gcaaagaatc agaggaatta tattccacaa 60

ttctacacat gagaatcaac atcaattcaa ttcatcacaa tataataaaa ctaaacacgg 120

attggtttgg tcacttccac actaaacaca caacaaatca caacacagta cacgtatgac 180

caaattcaca acaaccatcg ccacctcctt caccctctta tatttaactt ctatctccaa 240

attccaaaac cataacacaa acacaacgag actctttttt cttcctaccc tttaaaccct 300

tttggcttca cttattctta aagccttaaa gctaagattt ttatcactga agcttaagaa 360

cttcagagaa atatagagta acaacgttgg tgtgtgtggt tggtgtgtga agttgaagaa 420

acacaaagct tctagccaaa gatccttttg gtccaaaatt ccatctgggt ttcaatggca 480

agttgggttt tatcagaatg tggcttaaag cctcttcctc caatgtttgc aagacccaga 540

attggtgctg tgttatcaaa gtcctcaaag gttagatttt ttaacacaaa caagggagtg 600

gcagatctga actttcaagg aagaaacttt tcaagttttg gcattaggga gagaaactgg 660

ggtttgaaag tgagtgtccc tttaagggtt gaccctattg aaggagaaga ggaagaaagt 720

aaaaagataa tcaatgaggc taatggggtt aaactggaat tgccagaatt tgaccctggt 780

gcaccaccac cattcaattt ggctgatatt agagcagcta ttccaaagca ttgttgggtg 840

aagaatcctt ggaagtccat gagctatgtt gttagagatg tcattgtggt ttttgggttg 900

gctgctgcag ctgcttatct caacaattgg ttggtttggc ctttgtattg ggctgctcaa 960

ggaaccatgt tttgggctct gtttgttctt ggacatgatt gtggacatgg aagcttctca 1020

aatgatcata agctgaacag tgttgttggg catctgcttc attcttcaat tcttgttcct 1080

tatcatggat ggagaattag tcataggact catcaccaaa accatggtca tgtagaaaat 1140

gatgaatctt ggcatccgtt gtctgagaaa atcttcaaga gcttggacac tgtaacacgt 1200

ggtttaagat ttacattacc ttttccaatg cttgcatatc cagtgtacct ttttagcagg 1260

agtcctggga agaccggttc tcactttcac cctgacagtc ccttgtttgt tcctaatgag 1320

agaaacgata ttattacttc tacagcttgt tggtcagcta tggtggcatt gcttgtaggc 1380

ttggggtttg taatgggtcc aggtcaattg tttatgcttt atggtgttcc ctattggatt 1440

tttgttatgt ggttggattt ggtgacttat ttgcatcatc atggtcatga agacaaatta 1500

ccatggtatc gtggaaaggc atggaactac cttaggggtg gacttacaac tctagatcgt 1560

gactatggat ggatcaataa cattcaccat gatattggaa ctcatgtcat tcatcacctt 1620

ttccctcaaa tcccacacta tcacttaatt gaagcaactg aagcagctaa acctgtgctt 1680

ggaaaatatt accatgagcc aaagaaatct ggtcctattc catttcacct cattggggac 1740

ttgttaagaa gcttacggag agaccatttt gttagtgaca ctggggatgt tgtgtactat 1800

caaactgaac ctgagctctt tggatcatcc acatcagatt aagaaataag gaagtcttgg 1860

aattgtttgg catgacacat tgcttttact ttgaaggttg tctcagcttc ttactaagtt 1920

actatcatat agtttactta ttcttagcta aagggaatgg atgcatgata aaaaattgtc 1980

attaatgcct gctatttagg catgtgcagg caattgcaat tttttccttt atgaagagtg 2040

aattatctgt aaattgatta ttcttcatga aggaagtgac attttgatca aaaaaaaaaa 2100

cctatagtga aatcactagt ggaggatccg cgaatctcta gaggatcccc gggtaccgag 2160

ctcgaatcac tgccgtcgaa aaccccg 2187

<210> 3

<211> 455

<212> PRT

<213> AmFAD7蛋白氨基酸序列(人工序列)

<400> 3

Met Ala Ser Trp Val Leu Ser Glu Cys Gly Leu Lys Pro Leu Pro Pro

1 5 10 15

Met Phe Ala Arg Pro Arg Ile Gly Ala Val Leu Ser Lys Ser Ser Lys

20 25 30

Val Arg Phe Phe Asn Thr Asn Lys Gly Val Ala Asp Leu Asn Phe Gln

35 40 45

Gly Arg Asn Phe Ser Ser Phe Gly Ile Arg Glu Arg Asn Trp Gly Leu

50 55 60

Lys Val Ser Val Pro Leu Arg Val Asp Pro Ile Glu Gly Glu Glu Glu

65 70 75 80

Glu Ser Lys Lys Ile Ile Asn Glu Ala Asn Gly Val Lys Leu Glu Leu

85 90 95

Pro Glu Phe Asp Pro Gly Ala Pro Pro Pro Phe Asn Leu Ala Asp Ile

100 105 110

Arg Ala Ala Ile Pro Lys His Cys Trp Val Lys Asn Pro Trp Lys Ser

115 120 125

Met Ser Tyr Val Val Arg Asp Val Ile Val Val Phe Gly Leu Ala Ala

130 135 140

Ala Ala Ala Tyr Leu Asn Asn Trp Leu Val Trp Pro Leu Tyr Trp Ala

145 150 155 160

Ala Gln Gly Thr Met Phe Trp Ala Leu Phe Val Leu Gly His Asp Cys

165 170 175

Gly His Gly Ser Phe Ser Asn Asp His Lys Leu Asn Ser Val Val Gly

180 185 190

His Leu Leu His Ser Ser Ile Leu Val Pro Tyr His Gly Trp Arg Ile

195 200 205

Ser His Arg Thr His His Gln Asn His Gly His Val Glu Asn Asp Glu

210 215 220

Ser Trp His Pro Leu Ser Glu Lys Ile Phe Lys Ser Leu Asp Thr Val

225 230 235 240

Thr Arg Gly Leu Arg Phe Thr Leu Pro Phe Pro Met Leu Ala Tyr Pro

245 250 255

Val Tyr Leu Phe Ser Arg Ser Pro Gly Lys Thr Gly Ser His Phe His

260 265 270

Pro Asp Ser Pro Leu Phe Val Pro Asn Glu Arg Asn Asp Ile Ile Thr

275 280 285

Ser Thr Ala Cys Trp Ser Ala Met Val Ala Leu Leu Val Gly Leu Gly

290 295 300

Phe Val Met Gly Pro Gly Gln Leu Phe Met Leu Tyr Gly Val Pro Tyr

305 310 315 320

Trp Ile Phe Val Met Trp Leu Asp Leu Val Thr Tyr Leu His His His

325 330 335

Gly His Glu Asp Lys Leu Pro Trp Tyr Arg Gly Lys Ala Trp Asn Tyr

340 345 350

Leu Arg Gly Gly Leu Thr Thr Leu Asp Arg Asp Tyr Gly Trp Ile Asn

355 360 365

Asn Ile His His Asp Ile Gly Thr His Val Ile His His Leu Phe Pro

370 375 380

Gln Ile Pro His Tyr His Leu Ile Glu Ala Thr Glu Ala Ala Lys Pro

385 390 395 400

Val Leu Gly Lys Tyr Tyr His Glu Pro Lys Lys Ser Gly Pro Ile Pro

405 410 415

Phe His Leu Ile Gly Asp Leu Leu Arg Ser Leu Arg Arg Asp His Phe

420 425 430

Val Ser Asp Thr Gly Asp Val Val Tyr Tyr Gln Thr Glu Pro Glu Leu

435 440 445

Phe Gly Ser Ser Thr Ser Asp

450 455

<210> 4

<211> 2247

<212> DNA

<213> AmFAD7基因gDNA序列(人工序列)

<400> 4

atggcaagtt gggttttatc agaatgtggc ttaaagcctc ttcctccaat gtttgcaaga 60

cccagaattg gtgctgtgtt atcaaagtcc tcaaaggtta gattttttaa cacaaacaag 120

ggagtggcag atctgaactt tcaaggaaga aacttttcaa gttttggcat tagggagaga 180

aactggggtt tgaaagtgag tgtcccttta agggttgacc ctattgaagg agaagaggaa 240

gaaagtaaaa agataatcaa tgaggctaat ggggttaaac tggaattgcc agaatttgac 300

cctggtgcac caccaccatt caatttggct gatattagag cagctattcc aaagcattgt 360

tgggtgaaga atccttggaa gtccatgagc tatgttgtta gagatgtcat tgtggttttt 420

gggttggctg ctgcagctgc ttatctcaac aattggttgg tttggccttt gtattgggct 480

gctcaaggaa ccatgttttg ggctctgttt gttcttggac atgattggta attgctttgt 540

cacttttatg ttttctaatt attgtcattc atatgtagtt gcagcaattg gctctttgag 600

gggtgctgaa ttgggtttta atttgtgtgt tgatgagttt aattgttgtt ttggttcttt 660

cagtggacat ggaagcttct caaatgatca taagctgaac agtgttgttg ggcatctgct 720

tcattcttca attcttgttc cttatcatgg atggtatact actaatattc ttttaccttt 780

tattcttttt tctagtttca gactcatctt tgaaactgat attttgcgga attatgcagg 840

agaattagtc ataggactca tcaccaaaac catggtcatg tagaaaatga tgaatcttgg 900

catccggtga gatgataatt actgtttatt ttctatgaga tactatttgt ctccaatatt 960

ttttccggac aaaacttacg ttttgttctt taggtacttg tggtattgtt tgccaatgaa 1020

aataggacat atgtaacagt tattacacat gttacaattt cattgataag ccattacact 1080

tgtattcttt taattggaaa acagtaccat aagcacctat gaaactgtac ctaggttttt 1140

ttctattttt ccaagcaatc taagtttcta acatatgatg tttaatgaca atcttgcagt 1200

tgtctgagaa aatcttcaag agcttggaca ctgtaacacg tggtttaaga tttacattac 1260

cttttccaat gcttgcatat ccagtgtacc ttgtaagttt tagtgcaaaa aagttttgac 1320

cattaattga aattttattg ctggtagatt tggtagagtg attgacttgg ttgttgttga 1380

tctttgaatt cagtttagca ggagtcctgg gaagaccggt tctcactttc accctgacag 1440

tcccttgttt gttcctaatg agagaaacga tattattact tctacagctt gttggtcagc 1500

tatggtggca ttgcttgtag gcttggggtt tgtaatgggt ccaggtcaat tgtttatgct 1560

ttatggtgtt ccctattggg taagttactc ctcattttct tgctttagtt tttcttttgg 1620

aataaaaaat gaattcctta tttgactttg attggaattg cagatttttg ttatgtggtt 1680

ggatttggtg acttatttgc atcatcatgg tcatgaagac aaattaccat ggtatcgtgg 1740

aaggtatcat tttatttatt tttcttgttt attggggctt tattgttttt tagttcaatt 1800

tttttaacat cttatttttt atcatgttct gcaaggcatg gaactacctt aggggtggac 1860

ttacaactct agatcgtgac tatggatgga tcaataacat tcaccatgat attggaactc 1920

atgtcattca tcaccttttc cctcaaatcc cacactatca cttaattgaa gcagtaagtg 1980

tctattttct ttttatataa tgggggatga tattttccat gagctttaga gttttgattg 2040

ttgtccttac ttaacttgca gactgaagca gctaaacctg tgcttggaaa atattaccat 2100

gagccaaaga aatctggtcc tattccattt cacctcattg gggacttgtt aagaagctta 2160

cggagagacc attttgttag tgacactggg gatgttgtgt actatcaaac tgaacctgag 2220

ctctttggat catccacatc agattaa 2247

<210> 5

<211> 1368

<212> DNA

<213> 蒙古沙冬青AmFAD7 cDNA编码区序列(人工序列)

<400> 5

atggcaagtt gggttttatc agaatgtggc ttaaagcctc ttcctccaat gtttgcaaga 60

cccagaattg gtgctgtgtt atcaaagtcc tcaaaggtta gattttttaa cacaaacaag 120

ggagtggcag atctgaactt tcaaggaaga aacttttcaa gttttggcat tagggagaga 180

aactggggtt tgaaagtgag tgtcccttta agggttgacc ctattgaagg agaagaggaa 240

gaaagtaaaa agataatcaa tgaggctaat ggggttaaac tggaattgcc agaatttgac 300

cctggtgcac caccaccatt caatttggct gatattagag cagctattcc aaagcattgt 360

tgggtgaaga atccttggaa gtccatgagc tatgttgtta gagatgtcat tgtggttttt 420

gggttggctg ctgcagctgc ttatctcaac aattggttgg tttggccttt gtattgggct 480

gctcaaggaa ccatgttttg ggctctgttt gttcttggac atgattgtgg acatggaagc 540

ttctcaaatg atcataagct gaacagtgtt gttgggcatc tgcttcattc ttcaattctt 600

gttccttatc atggatggag aattagtcat aggactcatc accaaaacca tggtcatgta 660

gaaaatgatg aatcttggca tccgttgtct gagaaaatct tcaagagctt ggacactgta 720

acacgtggtt taagatttac attacctttt ccaatgcttg catatccagt gtaccttttt 780

agcaggagtc ctgggaagac cggttctcac tttcaccctg acagtccctt gtttgttcct 840

aatgagagaa acgatattat tacttctaca gcttgttggt cagctatggt ggcattgctt 900

gtaggcttgg ggtttgtaat gggtccaggt caattgttta tgctttatgg tgttccctat 960

tggatttttg ttatgtggtt ggatttggtg acttatttgc atcatcatgg tcatgaagac 1020

aaattaccat ggtatcgtgg aaaggcatgg aactacctta ggggtggact tacaactcta 1080

gatcgtgact atggatggat caataacatt caccatgata ttggaactca tgtcattcat 1140

caccttttcc ctcaaatccc acactatcac ttaattgaag caactgaagc agctaaacct 1200

gtgcttggaa aatattacca tgagccaaag aaatctggtc ctattccatt tcacctcatt 1260

ggggacttgt taagaagctt acggagagac cattttgtta gtgacactgg ggatgttgtg 1320

tactatcaaa ctgaacctga gctctttgga tcatccacat cagattaa 1368

<210> 6

<211> 2248

<212> DNA

<213> 蒙古沙冬青肌动蛋白基因AmACTIN基因序列(人工序列)

<400> 6

aaatgattcc ctctccttca gatccaattt caattatctt caattttggt cccattatct 60

caaattatct caattccaat tccaatttca atttcattgc attacacacg ctcactctct 120

ctctgtccgt gtgtatatat acccttctcc ttcatctttt cccttctctc ttgtcatatc 180

gtctttctgt gggcctccat cacagaagag agagagagtg ccaaagccat tttctttttc 240

ttcgagcttg gctttggtta tacacgatcc attttctctc tacttcaagg ttgataaaaa 300

atggctgatg ctgaggatat tcaacccctt gtttgtgaca atggaactgg aatggtgaag 360

gcgggatttg ctggtgatga tgcccctagg gctgtgtttc ccagtattgt tggccgacct 420

cgtcatactg gtgttatggt tgggatgggt caaaaggatg cctatgtcgg tgatgaagcc 480

caatcaaaaa gaggtattct tactctgaag taccccattg agcatggtat agtcagcaac 540

tgggacgaca tggaaaagat ctggcatcac acattttaca atgaattgcg tgttgctccc 600

gaggagcacc cagtgctttt aactgaggct cctctcaacc caaaggccaa cagagaaaag 660

atgactcaaa tcatgtttga gaccttcaat gtgcctgcca tgtatgtggc aatccaggct 720

gtcctctccc tgtatgcaag tggtcgcaca actggtattg ttttggactc tggtgatggt 780

gtgagtcaca ctgtgccaat ctatgagggg tatgcgctcc ctcatgccat cctccgtttg 840

gatcttgctg gccgtgatct aactgattct ttgatgaaga tcctcactga gagggggtac 900

atgttcacta cctcagctga gcgggaaatt gttcgtgaca tgaaggaaaa gcttgcatat 960

gttgccttag attatgagca agaacttgag actgcaaaga gcagttcgtc agttgagaaa 1020

aactatgagc ttcctgatgg acaagttatc acgattggag ctgaaagatt ccgttgccca 1080

gaagttcttt tccagccatc tatgattgga atggaagctg ctggaattca tgagaccacc 1140

tacaactcta tcatgaagtg tgatgtggat atcagaaagg atctgtatgg caacattgtt 1200

cttagtggtg gttctactat gttccctggc attgcagacc ggatgagcaa ggagatcact 1260

gctcttgctc ctagcagcat gaagattaag gttgtggctc caccagagag aaaatatagt 1320

gtctggattg gaggatcaat ccttgcatcc ctcagcacct tccagcagat gtggatatct 1380

aagggtgaat atgatgagtc tggtccatcc attgtccaca ggaagtgctt ctaagtccag 1440

aatatgtttt attggtgagt tatttttgct gtggttgctt tttttgtgtc tgtgtcatgt 1500

catgtgaact atgttgccat ggataagagg tgagatagga tcattggagg gtatattttg 1560

agctcgatgt atcatctttt gtgtgcggcc ctctggatgc ggcgggcaca gagttgtgaa 1620

gaggcttttc ttgccttgga cttcgttctt gccttcttaa gtaggttgtt tgtagcaagg 1680

aagtgattgt gatgcttatt ttatttccat tttcccacat ttgaaggctt ttttcacctt 1740

ggaacattaa tgtctatagt tatatgcatc tgagaatttt tataatatta ttgaaagttc 1800

gcggtcataa attcacacta cagataattt agggtgttta ttatgggtgg cgtaagttct 1860

ttcatgaata gatattagat agatcgcagt tagttcccac tgttttgtta cttggtgacg 1920

cctactagtt gtaataactg gaacttggat caagaatgtt cttggaaagg gttggcttag 1980

ctgtggacgt tttaatcaca tgcaatcatc tagtatattc gaacctactg gacaaaagaa 2040

accgtaaaaa tgaagaagat tgtcactgta tgttgaacaa atgccaagaa ctggaaaaaa 2100

aaatcggtgc actgaacatt atgcgttgtt aactattagt agcaaattgg gagggggatg 2160

aaaatggaag gcatataaga ggaaagacag aatgtagagt tgcactcttc ggatatgatt 2220

aaaatgggag gtatgaaaat aatgcggg 2248

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> AmFAD7 -3'Outer(人工序列)

<400> 7

gataatcaat gaggctaatg ggg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> AmFAD7 -3'Inner(人工序列)

<400> 8

agaatccttg gaagtccatg agc 23

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> AmFAD7编码区扩增引物AmFAD7-F1(人工序列)

<400> 9

tggatcctgg gtttcaatgg caagt 25

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> AmFAD7编码区扩增引物AmFAD7-R1(人工序列)

<400> 10

acccgggctt atttcttaat ctgatg 26

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> AmFAD7的表达引物AmFAD7-F2(人工序列)

<400> 11

aatagggaac accataaagc ataaac 26

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> AmFAD7的表达引物AmFAD7-R2(人工序列)

<400> 12

tgacactggg gatgttgtgt actat 25

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> AmACTIN表达引物AmACTIN-F(人工序列)

<400> 13

tgtttccggg tattgctgac 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> AmACTIN表达引物AmACTIN-R(人工序列)

<400> 14

acccagagcc atcaaataag 20

Claims (11)

1.提高植物抗旱性和抗寒性的蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶基因AmFAD7，所述蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶基因AmFAD7 的全长cDNA序列如SEQ ID No. 2所示。

2.含有权利要求1所述蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶基因AmFAD7的载体。

3.蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶基因AmFAD7在提高植物抗旱性和抗寒性中的应用，所述蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶基因AmFAD7 的全长cDNA序列如SEQID No. 2所示，所述植物是拟南芥。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶基因AmFAD7的序列是如SEQ ID No. 4所示的gDNA序列。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶基因AmFAD7的序列是如SEQ ID No. 5所示cDNA编码区序列。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于将所述AmFAD7基因构建到植物表达载体上，通过转化方法导入植物细胞或组织，获得具有抗干旱和抗寒特性的转基因植物。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述植物表达载体为p3300-35S-AmFAD7；所用转化方法为根癌农杆菌介导法。

8.蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶基因编码的AmFAD7蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。

9.蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶基因AmFAD7的全长cDNA序列的获得方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

（1）总RNA提取：取蒙古沙冬青叶片为样品，用改进的Trizol法提取总RNA并进行纯化，然后保存于-76℃；其中，所述改进的Trizol法中，Trizol试剂加2%的β-巯基乙醇和pH 4.8的3 M KAc；

（2）3’RACE：根据如SEQ ID No.1所示的蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶基因AmFAD7 3’-端缺失的cDNA序列设计基因特异性3’RACE引物，取步骤（1）冻存的总RNA做模板，按照TaKaRa公司的3’RACE试剂盒说明书操作步骤扩增AmFAD7基因cDNA序列的3’-端；将所得3’-端序列与序列表中SEQ ID No.1所示的序列进行拼接，获得如序列表中SEQ IDNo.2所示的AmFAD7基因全长cDNA序列，

所述3’RACE引物为：

AmFAD7-Outer：5’-GATAATCAATGAGGCTAATGGGG-3’

AmFAD7-Inner：5’-AGAATCC TTGGAAGTCCATGAGC-3’。

10.蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶基因AmFAD7的gDNA序列的获得方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

（1）蒙古沙冬青基因组DNA提取：用常规CTAB法提取基因组DNA，然后保存于-20℃；

（2）蒙古沙冬青AmFAD7基因gDNA的扩增：以蒙古沙冬青基因组DNA为模板，用特异性引物AmFAD7-F1和AmFAD7-R1进行PCR扩增；扩增反应体系为50 µL，其中含5×TransStartFast Pfu Buffer 10 µL，2.5 mmol·L^-1/mM dNTP 4 µL，10 μmol·L^-1/μM上下游引物各1µL，基因组 DNA 1 µL，2.5 U·µL^-1 TransStart Fast Pfu DNA Polymerase 1 µL，用ddH₂O补足至50 µL；反应程序为：95℃ 2 min；95℃ 20 sec，55℃ 20 sec，72℃ 45 sec，30个循环；72℃ 5 min；4℃保存；

（3）目的片段克隆与测序：将步骤（2）获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的DNA片段，然后与pEASY-Simple-Blunt克隆载体连接并转化大肠杆菌TOP10感受态细胞；用特异性引物AmFAD7-F1和AmFAD7-R1进行菌落PCR检测并进行测序验证；将测序确认的序列作为所述AmFAD7基因的gDNA序列，所述gDNA序列如SEQ ID No. 4所示；

步骤（2）和（3）所用特异性引物序列为：

AmFAD7-F1：5’-TGGATCCTGGGTTTCAATGGCAAGT-3’

AmFAD7-R1：5’-ACCCGGGCTTATTTCTTAATCTGATG-3’。

11.蒙古沙冬青AmFAD7基因的cDNA编码区序列的获得方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

（1）cDNA合成：取蒙古沙冬青叶片为样品，用改进的Trizol法提取总RNA并进行纯化，保存于-76℃；以所得总RNA为模板，用Promega公司M-MLV逆转录酶合成cDNA第一链，向反应体系中加入以下成分：总RNA 4 µL，40 µM Oligo dT 1 µL，用DEPC·ddH₂O补足至 6 µL，混匀，70℃下10 min，冰上静置2 min；加入5×M-MLV buffer 2 µL，10 mM dNTP mixture 0.5µL，200 U·µL^-1 RNase Inhibitor 0.25 µL，200 U·µL^-1 M-MLV Reverse Transcriptase0.25 µL，用DEPC·ddH₂O补足至10 µL，混匀，42℃ 1 h，70℃ 15 min，-20℃保存；

（2）蒙古沙冬青AmFAD7 cDNA编码区的PCR扩增：以步骤（1）合成的cDNA做模板进行PCR扩增，以获取蒙古沙冬青AmFAD7 cDNA编码区片段；

AmFAD7 cDNA编码区扩增引物为：

AmFAD7-F1：5’-TGGATCCTGGGTTTCAATGGCAAGT-3’

AmFAD7-R1：5’-ACCCGGGCTTATTTCTTAATCTGATG-3’

50 µL反应体系中含：步骤（1）中获得的cDNA 1 µL，5×TransStart Fast Pfu Buffer10 µL，2.5 mM dNTP mixture 4 µL，10 μM AmFAD7-F1 1 µL，10 μM AmFAD7-R1 1 µL，2.5U·µL^-1 TransStart Fast Pfu DNA Polymerase 1 µL，用ddH₂O补足至50 µL；反应程序为：95℃ 2 min；95℃ 20 sec，55℃ 20 sec，72℃ 45 sec，30个循环；72℃ 5 min；4℃保存；

（3）目的片段克隆与测序：将步骤（2）获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的DNA片段，然后与pEASY-Simple-Blunt克隆载体连接并转化TOP10感受态细胞；用AmFAD7 cDNA编码区扩增引物进行菌落PCR检测并进行测序验证；将测序确认的单克隆菌液及其质粒DNA保存于-76℃；经测序验证的AmFAD7 cDNA编码区序列如SEQ ID No. 5所示。

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