CN108409819A - 一种新型阿糖胞苷前药DA-Ara纳米组装体的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型阿糖胞苷前药纳米组装体制备方法和应用。本发明选取生物相容性的癸酸为疏水材料，与阿糖胞苷共价结合，合成一种新型阿糖胞苷两亲性小分子前药癸酸‑阿糖胞苷(DA‑Ara)，经纳米沉淀法，前药可在水中自组装形成纳米棒，用水重新分散，可得到稳定性好的纳米口服给药制剂。体外细胞毒性实验结果显示，前药DA‑Ara对人慢性细胞白血病细胞K562展现了较强的敏感性，抑制细胞起效快，作用持久，细胞毒性更强。前药口服制剂载药量高，纳米混悬液浓度高，保存时间长且稳定性好，更易于生产的储存与运输，安全性好，为阿糖胞苷口服给药形式提供广阔应用前景。

Description

一种新型阿糖胞苷前药DA-Ara纳米组装体的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种新型阿糖胞苷前药DA-Ara纳米组装体口服制剂的制备与应用，还涉及这种阿糖胞苷两亲性小分子前药及其制备方法及评价。

背景技术

急性髓细胞性白血病(AML)是一种以骨髓与外周血中原始和幼稚髓性细胞异常增生和正常造血功能受损为主要特征的恶性疾病。临床表现为贫血、出血、感染和发热、脏器浸润、代谢异常等。阿糖胞苷(cytarabine,Ara-C)是急性髓细胞性白血病的主要治疗药物，临床应用已有四十多年的历史。作为一种嘧啶核苷类似物，阿糖胞苷可经胞内磷酸激酶活化转变成三磷酸阿糖胞苷(Ara-CTP)，抑制DNA多聚酶，从而干扰DNA的合成；同时抑制核苷酸还原酶阻止胞嘧啶核苷酸还原为脱氧胞嘧啶核苷酸，影响DNA的复制导致细胞死亡，从而发挥良好的治疗效果。然而，阿糖胞苷在药物应用方面存在一定的局限性，主要体现在：分子结构中具有五元糖环，导致其分子极性大，透膜性差，生物利用度低；嘧啶环上的4位NH₂极易被胃肠道粘膜及肝脏部位的胞嘧啶脱氨酶代谢失活，导致其口服吸收少，故临床上无口服制剂。且在体内半衰期短，临床上主要以静脉滴注给药以维持有效血药浓度，但易产生耐药性，且病人的顺应性差。

很多研究者利用阿糖胞苷分子结构中的氨基和羟基进行酰化、醚化等化学修饰，合成了一系列阿糖胞苷的衍生物，从而提高脂溶性和化学稳定性，较大的提高了生物利用度。目前，对阿糖胞苷衍生物的研究主要集中在阿糖胞苷的胞嘧啶环上的4位氨基和阿拉伯糖上的3’5’位伯羟基进行酰化修饰，从而引入脂肪族或脂酰氨基酸基团，获得的阿糖胞苷衍生物可以实现增强脂溶性和活性，增加口服生物利用度，从而扩大临床使用范围。

前药是一类本身没有生物活性或活性很低，经过体内代谢后变为有活性的物质而发挥疗效。其中，两亲性小分子前药已逐渐成为人们的研究热点。针对药物分子结构、水溶性、药物代谢方面存在的缺陷在活性基团以化学键的方式连接上小分子载体材料，形成两亲性前药分子，大大改善药物的生物活性，其优势主要体现在以下几个方面：(1)增加脂溶性和膜通透性，有利于药物在小肠粘膜的吸收，增强在体内的生物利用度；(2)具有合适链长的亲脂性小分子材料，使前药分子可自组装形成纳米聚集体，实现药物的自递送过程；(3)药物作为载体的一部分，减少惰性材料的使用带来的潜在毒副作用，提高载药量；(4)NH₂作为前药反应的活性基团，屏蔽NH₂，抑制脱氨基反应，提高药物的血药浓度。

发明人前期也对阿糖胞苷两亲性小分子前药纳米聚集体的形态进行了研究，短链前药 (HA-Ara,正己酸-阿糖胞苷)自组装形成纳米粒，但经静脉注射给药时缓释效果不明显；长链前药(油酸-阿糖胞苷，OA-Ara，棕榈酸-阿糖胞苷，PA-Ara)可形成纳米螺旋结构，适用于口服给药。但发明人发现，目前研究的前药口服制剂稳定性很差，为了提高混悬液稳定性， HA-Ara和OA-Ara需要加入BSA稳定剂，但是BSA容易导致出现沉淀或絮状，且添加BSA稳定剂后，载药量降低，HA-Ara载药量为71％，OA-Ara载药量为61.32％，PA-Ara和LA-Ara不需要添加BSA，但是稳定性只能保持几天，所以不利于临床应用的推广。

发明内容

结合发明人前期研究和上述存在的问题，本发明选择针对一种脂肪酸-阿糖胞苷两亲性小分子前药以及前药口服制剂进行研究，尤其是两亲性小分子结构特性以及脂肪酸-阿糖胞苷前药作为整体的纳米组装体形态特性及稳定性进行研究，最终形成了本发明。

本发明的目的之一在于合成一种新型阿糖胞苷两亲性小分子前药DA-Ara，这种新型阿糖胞苷两亲性小分子前药可以自发形成纳米聚集体，纳米混悬液浓度高，载药量高，且稳定性好，保存时间长，更易于生产的储存与运输，安全性好，为阿糖胞苷口服给药形式提供广阔应用前景。

为实现该目的，具体的，本发明涉及以下技术方案：

首先，本发明公开了一种新型阿糖胞苷两亲性小分子前药(DA-Ara)，其结构式如下所示：

其次，本发明公开了上述阿糖胞苷两亲性小分子前药DA-Ara的制备方法，其制备方法为：

阿糖胞苷与癸酸催化反应，癸酸与阿糖胞苷以酰胺键结合，实现对阿糖胞苷4位氨基的化学修饰。

所述催化反应可以为酶促催化或化学催化。

优选的，所述催化反应为化学催化。

优选的，阿糖胞苷与癸酸催化反应过程为：癸酸，在加入三乙胺和氯甲酸乙酯条件下，与阿糖胞苷反应，生成上述阿糖胞苷两亲性小分子前药DA-Ara。

具体的反应步骤包括：(1)一定量的癸酸溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入三乙胺和氯甲酸乙酯，惰性气体保护、冰浴条件下反应；

(2)将一定量阿糖胞苷溶于无水DMF中，加入步骤(1)所述反应溶液中，制备获得上述阿糖胞苷两亲性小分子前药DA-Ara。

所述癸酸：三乙胺：氯甲酸乙酯：阿糖胞苷摩尔比为8-12:10-12:10-12:8-10；优选为癸酸：三乙胺：氯甲酸乙酯：阿糖胞苷摩尔比为12:11:11:10。

优选的实施方案中，在步骤(2)之后还包括这种阿糖胞苷两亲性小分子前药纯化的步骤 (3)。

具体的，纯化的步骤(3)为：减压旋蒸除去反应溶剂无水DMF，真空干燥，得到粗产物；将粗产物溶于乙酸乙酯中，硅胶柱色谱提纯，二氯甲烷和甲醇梯度洗脱(150:1-70:1)，得到 DA-Ara纯品为白色固体。

本发明的目的之二在于提供一种阿糖胞苷两亲性小分子前药DA-Ara口服制剂及其纳米组装体形态特性。该口服制剂可经纳米沉淀法获得，并且稳定性良好，易于保存，研究获得优异的体外抗白血病活性。

为实现该目的，具体的，本发明涉及以下技术方案：

首先，本发明公开了一种阿糖胞苷两亲性小分子前药DA-Ara口服纳米聚集体的制备方法及形态特性，包括：将DA-Ara前药溶于甲醇中，搅拌条件下倒入水中，利用前药分子两亲性自发形成DA-Ara前药纳米聚集体(混悬液)；将形成的混悬液离心，弃去上清，用水分散得到白色纳米聚集混悬液，将制备的纳米混悬液分别置于冰箱内4℃冷藏保存，在0天、3天、7天后观察制剂外观状态与微观形貌；此外，将得到的纳米混悬液分别滴在铜网上，将样品置于阴凉处挥去水分，经透射电子显微镜下观察微观形态，得到DA-Ara纳米棒形态，0天、3天和7天后用同上方法观察形态的改变情况。

为了更清晰反应本发明的效果，本发明设置对照组，将相同条件下制得的制剂LA-Ara 和PA-Ara混悬液分别置于冰箱内4℃冷藏保存，在0天、3天、7天后观察制剂外观状态与本发明进行比较对照；与此同时，我们对长期稳定性进行了考察，将以上三种制剂置于冰箱内4℃持续保存30天，观察外观形态。结果显示，与LA-Ara和PA-Ara相比，本发明DA-Ara 制剂形态基本无变化，说明稳定性很好，且聚集体尺度也适用于口服。

优选的实施方案中，甲醇：水的体积比为1:50-200；更优选的，甲醇：水的体积比为1:100。

优选的实施方案中，纳米混悬液保存3天后，形态保持原有状态；保存7天后的形态也无改变。

优选的实施方案中，本发明口服制剂可形成口服混悬液浓度可达8-10mg/mL。

其次，上述制备方法得到的阿糖胞苷两亲性小分子前药DA-Ara口服制剂也是本发明的保护范围。

本发明的目的之三在于提供上述阿糖胞苷两亲性小分子前药DA-Ara及其口服制剂的用途。具体的，该目的涉及的技术方案包括：

上述阿糖胞苷前药DA-Ara及其口服制剂在制备抗癌抗肿瘤药物中的用途，阿糖胞苷前药 DA-Ara可以用于治疗或缓解某一组织或器官的癌症，癌症包括但不限于白血病、固体瘤、肺癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、肾癌等。

所述抗肿瘤应用包括了DA-Ara及其口服制剂在抗肿瘤化疗的用途以及DA-Ara及其口服制剂与其他化疗药物联合在抗肿瘤化疗中的用途。可以联合应用的抗肿瘤药物包括但不限于烷化剂、生物碱类、抗菌抗肿瘤磺酰胺类药物、铂类药物、抗代谢类或其他的抗癌药物。

本发明取得了以下有益效果：

(1)本发明首次合成Ara-C两亲性前药分子DA-Ara，前药分子不仅解决了Ara-C极性大，膜通透性差，在体内易被代谢失活等缺点，还可在水中分别自组装形成结构均一的纳米棒和纳米纤维聚集体。

(2)本发明制得的纳米口服制剂为DA-Ara纳米棒，无需添加BSA稳定剂，载药量高，可稳定存在30天以上，无形态改变，且口服制剂易于运输和保存，为工业的贮存提供了有利条件。

(3)DA-Ara前药对白血病细胞均显示较强的细胞毒性，且DA载体材料生物相容性好，毒性低，为增强体内抗白血病选择性提供可能。

附图说明

图1是DA-Ara前药的核磁图谱；

图2是(A)0天、(B)3天、(C)7天和(D)30天LA-Ara、PA-Ara、DA-Ara制剂外观形态图；

图3是(A)0天、(B)3天和(C)7天DA-Ara聚集体形态；

图4是DA-Ara体外细胞毒性实验。

具体实施方式

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 DA-Ara前药分子合成

分析天平精密分别称取一定量的癸酸，溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)并置于双颈瓶中，搅拌条件下分别加入三乙胺和氯甲酸乙酯，氮气保护、冰浴条件下反应20min。称取一定量阿糖胞苷溶于5mL温热的无水DMF中，搅拌条件下缓慢滴入上述反应溶液，其中摩尔量为癸酸：三乙胺：氯甲酸乙酯：阿糖胞苷＝12:11:11:10，反应恢复至室温并在氮气保护条件下继续反应72h，利用薄层板监测反应进程。反应结束后，减压旋蒸除去无水DMF，真空干燥过夜，得到粗产物。将粗产物溶于乙酸乙酯中，少许柱层层析硅胶拌样，硅胶柱色谱提纯，二氯甲烷和甲醇梯度洗脱(150:1-70:1)，得到DA-Ara纯品为白色固体，产率分别为64.3％。

实施例2核磁共振氢谱(¹H-NMR)鉴定DA-Ara前药化学结构

分别称取DA-Ara前药约5mg，氘代二甲亚砜(DMSO-d6)溶解并置于核磁管内，采用400MHz核磁共振氢谱测定其核磁共振氢谱图，以四甲基硅烷为内标物，记录化合物的化学位移值(ppm)。结果如图1所示，核磁结果可以证实，新合成的分子中阿糖胞苷和癸酸的摩尔比值接近1:1，同时酰胺键上H的特征峰的出现，证明酰胺键的合成。通过¹H-NMR谱图可以证实DA-Ara前药的成功合成。

实施例3 DA-Ara前药口服制剂制备

精密称取DA-Ara前药分子约20mg，溶于0.1ml甲醇中，搅拌条件下倒入100倍体积的水中，纳米聚集体自发形成，将混悬液离心，弃去上清，用水重新分散得到白色口服纳米混悬液。

本发明的纳米聚集体口服制剂经测算和实验，其形成口服混悬液浓度可达10mg/mL，高于发明人前期研究的OA-Ara前药分子形成的纳米口服制剂混悬液浓度。

实施例4 DA-Ara纳米聚集体形态和稳定性观察

为更直观的观察与比较，将上述方法制备得到的DA-Ara制剂于4℃冰箱保存0天、3天、 7天和30天后的外观与月桂酸-阿糖胞苷(LA-Ara)和棕榈酸-阿糖胞苷(PA-Ara)制剂进行比较，在图2中，LA-Ara和PA-Ara 3天后即可看到有分层；7天后可以看到明显分层并有絮状沉淀现象产生，而DA-Ara外观均一，无分层且无絮凝产生；持续观察30天，DA-Ara制剂外观依然无明显改变。从直观分析得到，DA-Ara制剂可以稳定存在30天以上，稳定性好。吸取20μL纳米聚集体混悬液滴于碳膜铜网上，滤纸吸去多余液体，室温下干燥后置于透射电镜下观察DA-Ara纳米聚集体形态。电镜照片如图3，结果显示DA-Ara可在水中聚集成长度均匀的纳米棒结构，且(A)0天、(B)3天和(C)7天后的形态结构无区别，说明DA-Ara聚集体形态均匀，稳定性良好，聚集体尺度适用于口服。从微观角度进一步证实了DA-Ara纳米棒可以稳定存在数天，稳定性好。

实施例5 DA-Ara前药体外细胞毒性研究

1.细胞的培养

选取人慢性粒细胞白血病细胞株K562作为研究对象。取冻存细胞，用培养基于37℃、 5％CO₂条件下培养，待细胞生长至高密度时传代，按比例转移至培养瓶中继续培养并进行细胞计数。

2.细胞毒性实验

收集对数生长期的K562细胞，用培养基将细胞稀释为约1×10⁴个/100ml。用培养基将待测目标化合物Ara-C和DA-Ara各稀释至500μM、250μM、100μM、50μM、25μM、10μM。细胞以1×10⁴个/孔的浓度加入96孔板中，加入不同浓度的目标化合物溶液100μL,设3个复孔，设不加抑制剂的100％对照组和空白组，37℃分别培养24h和48h。孵育后，每孔加入 0.5％的MTT溶液10μL，继续孵育4h,然后弃去孔内液体，每孔加150μLDMSO溶解，用酶标仪测定490nm处吸光度，按以下公式计算抑制率：

根据目标化合物的浓度及相应的抑制率，利用Origin7.5软件拟合曲线，计算各化合物抑制细胞增殖活性IC₅₀值。

两种样品在不同浓度下的细胞抑制率实验结果如图4。由图我们可以看出，Ara-C、DA-Ara 分别展现出浓度依赖性和时间依赖性。当细胞培养时间为24h时，浓度大于50μM时，前药 DA-Ara抑制K562细胞作用均明显强于阿糖胞苷，类似的结果发生在48h后。当样品对细胞的作用时间增大至48h后，发现不同浓度下的阿糖胞苷对细胞的抑制作用都有了显著的增强，但强度较DA-Ara前药低。实验证明对于K562细胞，DA-Ara具有细胞毒性。

同时，不同样品在不同培养时间下的半数抑制浓度(IC₅₀值)显示，样品作用时间无论是24h还是48h时，DA-Ara的IC₅₀值均明显小于Ara-C,且24h的细胞毒性作用更强。

由此，我们得出结论，DA-Ara聚集体口服制剂对慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞有理想的抑制作用，起效快，杀伤力强。

表1.不同实验组对K562细胞的IC₅₀值(μM)

本发明首次合成Ara-C两亲性前药分子DA-Ara，这两种前药分子不仅解决了Ara-C极性大，透膜性差，在体内易被代谢失活等缺点，还可在水中自组装形成结构均一的纳米棒。制备得到的DA-Ara口服纳米聚集体制剂，不仅稳定性好，而且保存时间长，还可批量生产，易于储存与运输，为工业生产提供可能。DA-Ara口服纳米聚集体制剂对白血病细胞的杀伤力更强，选择性好，服用方便，为实现Ara-C口服给药提供可能。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种新型阿糖胞苷两亲性小分子前药DA-Ara，其结构式如下所示：

2.权利要求1所述阿糖胞苷两亲性小分子前药DA-Ara的制备方法，其特征在于，制备方法为：

阿糖胞苷与癸酸催化反应，癸酸与阿糖胞苷以酰胺键结合，实现对阿糖胞苷4位氨基的化学修饰。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述催化反应可以为酶促催化或化学催化；优选的，所述催化反应为化学催化；更优选的，阿糖胞苷与癸酸催化反应过程为：癸酸，在加入三乙胺和氯甲酸乙酯条件下，与阿糖胞苷反应，分别生成阿糖胞苷两亲性小分子前药DA-Ara。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，制备方法包括如下步骤：

(1)一定量的癸酸溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入三乙胺和氯甲酸乙酯，惰性气体保护、冰浴条件下反应；

(2)将一定量阿糖胞苷溶于无水DMF中，加入步骤(1)所述反应溶液中，制备获得阿糖胞苷两亲性小分子前药DA-Ara。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述癸酸：三乙胺：氯甲酸乙酯：阿糖胞苷摩尔比为8-12:10-12:10-12:8-10；优选为癸酸：三乙胺：氯甲酸乙酯：阿糖胞苷摩尔比为12:11:11:10；优选的，在步骤(2)之后还包括阿糖胞苷两亲性小分子前药DA-Ara纯化的步骤(3)：减压旋蒸除去反应液中无水DMF，真空干燥，得到粗产物；将粗产物溶于乙酸乙酯中，硅胶柱色谱提纯，二氯甲烷和甲醇梯度洗脱，得到DA-Ara纯品为白色固体。

6.一种阿糖胞苷两亲性小分子前药DA-Ara口服制剂的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述前药DA-Ara溶于甲醇中，搅拌条件下倒入水中，利用前药分子两亲性自发形成DA-Ara前药纳米聚集体混悬液；将形成的混悬液离心，用水重新分散，得到白色纳米聚集体口服制剂。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，甲醇：水的体积比为1:50-200；优选的，甲醇：水的体积比为1:100；优选的，口服制剂可形成的口服混悬液浓度达8-10mg/mL；优选的，纳米混悬液保存30天后，形态保持原有状态。

8.权利要求6或7任一项所述制备方法得到的阿糖胞苷两亲性小分子前药DA-Ara口服制剂。

9.权利要求1所述阿糖胞苷两亲性小分子前药DA-Ara和权利要求8所述口服制剂在制备抗肿瘤药物中的用途，其特征在于，阿糖胞苷两亲性小分子前药DA-Ara用于治疗或缓解某一组织或器官的癌症，癌症包括但不限于白血病、固体瘤、肺癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、肾癌等。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述用途包括DA-Ara及口服制剂与其他化疗药物联合在抗肿瘤化疗中的用途，优选的，联合应用的其他化疗药物包括但不限于烷化剂、生物碱类、抗菌抗肿瘤磺酰胺类药物、铂类药物、抗代谢类或其他抗癌药物。