CN108403699A

CN108403699A - 一种含mln4924和索拉菲尼的药物组合物及其应用

Info

Publication number: CN108403699A
Application number: CN201810398133.7A
Authority: CN
Inventors: 陆荫英; 王晶; 孙杰; 曾珍; 李茵茵; 陈刚; 杨新瑞; 卢珊珊; 董金珂; 董政; 陈艳; 程家敏
Original assignee: Chinese People's Liberation Army (pla) Third 0 Two Hospital
Current assignee: Chinese People's Liberation Army (pla) Third 0 Two Hospital
Priority date: 2018-04-28
Filing date: 2018-04-28
Publication date: 2018-08-17
Anticipated expiration: 2038-04-28
Also published as: CN108403699B

Abstract

本发明提供了一种药物组合物，包含MLN4924和索拉菲尼(Sorafenib)，所述MLN4924与索拉菲尼物质量比为1:160至16:5；本发明还提供了所述药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用，其效果明显优于索拉菲尼和MLN4924单独使用，说明二者在本发明特定配比下配合使用后具有协同增效的作用，在肝癌治疗领域具有潜在，良好的应用前景。

Description

一种含MLN4924和索拉菲尼的药物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种含MLN4924和索拉菲尼的药物组合物及其在制备抗肝癌药物中的应用。

背景技术

肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是肝癌中最常见的类型，占所有原位肝癌病例的90％以上。HCC恶性程度高，易于转移、复发，临床诊断时多数己为中晚期，失去根治性手术治疗的机会，同时大部分患者对放化疗不敏感，导致了HCC的治疗及预后均不乐观。NEDD8(neuralprecursor cell-expressed developmentally downregulated 8)分子是一类结构上与泛素相似的分子，参与蛋白质翻译后修饰，这一过程被称为Neddylation.Neddylation的发生机制与泛素化相似，需要E1、E2、E3介导的一系列酶促反应。大量研究表明Neddylaiton修饰在多种肿瘤中高度活化，并参与肿瘤的发生发展。

目前抑制Neddylation修饰已经成为治疗恶性肿瘤的重要手段，特异地阻断Neddylation修饰的小分子抑制剂MLN4924进入临床试验用于多种肿瘤的治疗。MLN4924可以导致肿瘤细胞S期DNA合成发生紊乱，从而引起肿瘤细胞发生凋亡。

索拉非尼(Sorafenib，简称Sora)是一种多激酶抑制剂，它通过抑制RAF/MEK/ERK介导的细胞信号传导通路而直接抑制肿瘤细胞的增殖，又通过作用于EGFR和PDGFR来阻断肿瘤新生血管的形成，间接抑制肿瘤生长。该药物对包括肝癌在内的多种恶性肿瘤均有明显的抑制作用，但却只能将肿瘤无进展期的基线控制在6个月内，且其对人体毒性较大，服用后容易导致皮疹、血压升高、手掌或足底部发红、疼痛、肿胀或出现水疱等不良症状。如何进一步提高索拉非尼抗肿瘤活性的同时保持较低的毒副作用，无疑也是目前临床试验急待研究解决的问题。

联合用药(Drug combination)是指为了达到治疗目的而采用的两种或两种以上药物同时或先后应用。联合用药往往会发生体内或体外药物的相互影响。对于某些药物组合，联合治疗还允许产生最佳组合剂量来使副作用最小化；两种化合物的联合治疗可揭示未预料到的协同作用和引发非由单一化合物诱导的效应。

目前，未见MLN4924与索拉非尼联合用药治疗肝癌的报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的主要目的在于提供一种含Sora和MLN4924的药物组合物及其在制备抗肝癌药物中的应用。

基于此，发明人将小分子抑制剂MLN4924与索拉非尼联合使用，以肝癌细胞HepG2和一种正常肝细胞LO2作为研究对象，考察药物体外对肝癌细胞的增殖抑制能力及对肝正常细胞的活性作用。结果表明，MLN4924与索拉非尼联合使用后，对上述肝癌细胞能产生明显的相加或协同抗癌作用，适当浓度对肝正常细胞活性抑制作用较小，提示其在抗肿瘤治疗特别是抗肝癌治疗中的高效低毒的作用潜力。

首先地，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含MLN4924和索拉非尼，所述MLN4924与索拉非尼物质量比为1:160至16:5。

优选的，所述MLN4924与索拉非尼物质量比1:5至16:5。

优选的，所述MLN4924与索拉非尼物质量比为1:5。

本发明通过药物对正常肝细胞LO2活性影响实验结合MLN4924与索拉非尼联合用药的预实验，筛选出对HepG2细胞起抑制作用的浓度范围为1:160至16:5。

优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。

优选的，所述药物组合物的使用方式为注射、口服、手术放置中的一种或多种医学上可接受的方式。

优选的，所述药物组合物的剂型为粉剂、注射制剂、胶囊、片剂、缓释剂或口服制剂中的一种或多种医学上可接受的剂型。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。根据制剂形式，本发明所述药物组合物在制剂中的含量可以以质量计为1～99％，优选为5～90％；制剂使用的辅料可采用本领域常规的辅料，以不和本发明药物组合物发生反应或不影响本发明药物的疗效为前提；制剂的制备方法可以采用本领域常规的制备方法进行制备。

本发明中的药物组合物的给药剂量根据给药对象、给药途径或药物的制剂形式不同可以进行适当的变化，但以保证该药物组合物在哺乳动物体内能够达到有效的血药浓度为前提。

进一步，本发明还提出了所述药物组合物在制备抗肝细胞癌药物中的应用。

优选的，所述药物组合物是指抑制肝癌细胞的生长或增殖的药物。

优选的，所述肝癌细胞包括人肝癌HepG2。

本发明的有益效果在于：本发明公开了一种含Sora和MLN4924的药物组合物及其在制备抗肝癌药物中的应用，其效果明显优于Sora和MLN4924单独使用，说明二者在本发明特定配比下配合使用后具有协同增效的作用，在肝癌治疗领域具有潜在，良好的应用前景。

附图说明

图1显示了0.4μmol/L和0.8μmol/L MLN4924分别与0.25-4μmol/L索拉非尼联合用药对肝癌细胞生长的影响；

图2显示了0.4μmol/L MLN4924与0.25-4μmol/L索拉非尼联合用药对正常肝细胞存活率的影响；

图3显示了0.8μmol/L MLN4924与0.25-4μmol/L索拉非尼联合用药对正常肝细胞存活率的影响。

其中，附图中的M代表MLN4924，S代表索拉非尼。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。

本发明所用的主要实验材料如下：

HepG2细胞购自美国模式培养物集存库(Americantypeculturecollection，ATCC，货号HB-806)；LO2细胞细胞购自上海纪宁生物科技(JN-1376)；DMED培养基(Gibco公司)、胎牛血清(HyClone公司)、青霉素和链霉素双抗购自赛默飞世尔科有限公司(15070063)；CCK-8试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司(CA1210)；MLN4924(C₂₁H₂₅N₅O₄S,分子量443.52Da)(纯度≥98％)，购自Selleck公司(S1208)；DMSO配制成50mM的母液储存于-80℃，使用时用完全培养基稀释至目标浓度；

Sorafenib(药品通用名：甲苯磺酸索拉非尼片)购自Selleck公司(S7397)。

实施例1HepG2和LO2细胞培养

1、HepG2细胞培养

1)细胞复苏

a.复苏细胞前的准备：DMEM细胞培养基配制、预热；

b.取细胞：将冻存的细胞悬液转移到含有DMEM培养基的离心管中；

c.离心、重悬，并转移到培养瓶中，进行培养，同时观察细胞生长情况。若细胞密度过高，及时传代，以备后续实验使用。

2)细胞传代培养

a.观察细胞生长情况：从培养箱中取出细胞，放在倒置的显微镜下观察细胞形态及细胞的多少，观察细胞是否需要传代及细胞传代所需要稀释的倍数；然后重新放入培养箱中。

b.取细胞：从培养箱中取出细胞，瓶盖处过酒精灯火焰后，拧开瓶盖，瓶口再次过酒精灯火焰，用移液管轻轻吹起沉底的细胞，并将其转入试管中，盖上胶塞；

c.离心、重悬：将离心管放入离心机中，然后以1200r/min的转速离心4分钟，弃去旧培养基上清，加入新鲜加有双抗及胎牛血清的DMEM培养基，然后按合适的比例分装到各个培养瓶中，每瓶的培养基终体积为8mL，细胞置于培养箱中37℃、5％CO₂培养。

2、LO2细胞培养

1)细胞复苏

a.复苏细胞前的准备：DMEM细胞培养基配制、预热；

2)细胞传代培养

b.取细胞：从培养箱中取出细胞，瓶盖处过酒精灯火焰后，拧开瓶盖，瓶口再次过酒精灯火焰，吸取出培养基，用生理盐水清洗贴在底部的细胞一遍并弃掉，加入0.25％的胰酶消化细胞5分钟，待细胞消化完全后加入完全培养基重悬用移液管轻轻吹起沉底的细胞，并将其转入试管中，盖上胶塞；

c.离心、重悬：将离心管放入离心机中，然后以1200r/min的转速离心4分钟，弃去旧培养基上清，加入新鲜加有双抗及10％胎牛血清的DMEM培养基，然后按合适的比例分装到各个培养瓶中，每瓶的培养基终体积为5mL，细胞置于培养箱中37℃、5％CO₂培养。

实施例2 MLN4924和Sora联用对HepG2细胞增殖的影响

本发明MLN4924与Sora物质量比范围为1:160至16:5，如表1所示，同体积下，0.025μmol/L MLN4924联合4μmol/L Sora用药，其比例范围为1:160；同体积下，0.8μmol/LMLN4924联合0.25μmol/L Sora用药，其比例范围为16:5。

同体积下，将MLN4924按照浓度为0.025μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L；将Sora按照浓度为0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L；MLN4924联合Sora用药浓度和比例按照表1中所示，进行联合用药。

取实施例1对数期的HepG2，用胰酶消化后，细胞计数，于96孔板中分别以每孔2×10³个细胞加入细胞悬液100μL进行接种，放于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。弃掉DMEM培养基，加入200μL按照上述比例配制好的含不同药物浓度的培养基继续培养72h，于每孔中加入10μL CCK8溶液，继续孵育4h后，将孔板置于酶标仪中，设置波长为450mm，检测每孔光密度值。该实验于不同日重复3次。

表1联合用药浓度

注：药物联用浓度均为μmol/L，如0.025+0.25表示0.025μmol/L MLN4924与0.25μmol/L Sora联用。

实验分三组进行：A组；B组；C组，MLN4924与Sora具体浓度参见表头；在同体积下，根据浓度可计算联合用药的比例关系；表中分别对三组MLN4924与Sora不同比例关系进行了标号，如A0-0、A0-1......B0-0、B0-1......C0-0、C0-1.....，具体如表2～4所示。

表2A组

表3B组

表4C组

根据光密度值计算细胞成活率，细胞成活率(％)＝(用药组平均OD值/空白对照组平均OD值)×100％，细胞成活率具体如表5-7所示。

根据细胞成活率结果可知，索拉非尼单独使用、MLN4924单独使用、索拉非尼与MLN4924联合使用对肝癌细胞HepG2有一定的抑制作用；其中，表7中两种药物浓度联用的抑制作用最强。用GraphPad Prism5.0软件处理数据作图分析，如图1所示。

表5 A组实验细胞存活率(％)

分组

A0-0

A0-1

A0-2

A0-3

A0-4

A0-5

存活率(％)

100％

90.68％

86.24％

79.01％

64.97％

21.61％

分组

A1-0

A1-1

A1-2

A1-3

A1-4

A1-5

存活率(％)

82％

76.65％

70.19％

67.16％

59.97％

28.72％

分组

A2-0

A2-1

A2-2

A2-3

A2-4

A2-5

存活率(％)

77.82％

75.33％

65.91％

61.41％

55.39％

15.84％

表6 B组实验细胞存活率(％)

分组

B0-0

B0-1

B0-2

B0-3

B0-4

B0-5

存活率(％)

100％

97.44％

85.16％

80.32％

61.60％

19.57％

分组

B1-0

B1-1

B1-2

B1-3

B1-4

B1-5

存活率(％)

92.91％

77.46％

75.72％

71.59％

59.22％

25.23％

分组

B2-0

B2-1

B2-2

B2-3

B2-4

B2-5

存活率(％)

78.56％

74.99％

74.67％

67.14％

57.65％

22.36％

表7 C组实验细胞存活率(％)

分组

C0-0

C0-1

C0-2

C0-3

C0-4

C0-5

存活率(％)

100％

88.84％

82.36％

68.47％

65.63％

21.58％

分组

C1-0

C1-1

C1-2

C1-3

C1-4

C1-5

存活率(％)

55.67％

48.72％

41.92％

36.42％

24.61％

16.78％

分组

C2-0

C2-1

C2-2

C2-3

C2-4

C2-5

存活率(％)

39.34％

32.47％

28.69％

23.67％

20.05％

14.74％

进一步地，本发明还采用金氏修正式评价两种药物联合用药时对肝癌细胞HepG2的联用效果，具体步骤为，按照生长抑制率(％)＝(1-用药组平均OD值/空白对照组平均OD值)×100％的公式，计算出A药在某种条件下对肝癌细胞的抑制率为EA，计算出B药在某种条件下对肝癌细胞的抑制率为EB，再计算出两者联合给药的抑制率为EC，通过以下公式计算联合用药指数q值，q＝EC/(EB+EA-EB*EA)，当q值>1.15为协同效应，0.85<q<1.15为相加效应，q<0.85为拮抗效应。通过上述联合用药指数的计算进一步判断两种药物联合用药的最终药效。

经过上述方法计算，其中0.025-0.1μmol/LMLN4924与0.25-4μmol/L索拉非尼联合用药指数在0.850071-3.000476之间，二者联合用药具有相加或协同效果；0.4-0.8μmol/LMLN4924与0.25-4μmol/L索拉非尼联合用药指数在0.931697-1.187922，二者联合用药具有相加或协同效果。

根据上述实验结果显示，0.4-0.8μmol/L MLN4924与0.25-4μmol/L索拉非尼联合用药时具有相加或协同效果，对肝癌细胞HepG2抑制作用最强。提示MLN4924与索拉非尼物质量比在1:10至16:5范围内，两种药物联合用药时具有相加或协同效果，对肝癌细胞HepG2增殖抑制作用更强。

实施例3不同剂量MLN4924和Sora联用对LO2细胞生长的影响

将MLN4924按照浓度为0.025μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L；将Sora按照浓度为0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L；MLN4924联合Sora用药浓度和比例按照表1中所示，进行联合用药。

取对数期的LO2细胞，用胰酶消化后，细胞计数，于96孔板中分别以每孔2×10³个细胞加入细胞悬液100μL进行接种，周围孔用无菌PBS填充。细胞置于培养箱中37℃、5％CO₂培养，待细胞融合约70％；弃掉DMEM培养基，加入200μL按照上述比例配制好的含不同药物浓度的培养基继续培养72h，于每孔中加入10μL CCK8溶液，继续孵育4h后，将孔板置于酶标仪中，设置波长为450mm，检测每孔光密度值。该实验于不同日重复3次。

根据光密度值计算细胞成活率，细胞成活率(％)＝(用药组平均OD值/空白对照组平均OD值)×100％；细胞抑制率(％)＝1-细胞成活率(％)。用GraphPadPrism5.0软件处理数据作图分析，如图2-3所示。

上述实验结果如图2-3所示，发现药物联用时，随着索拉菲尼给药浓度增加，抑制细胞活性增强，毒性增大。当0.4-0.8μmol/L的MLN4924与0.25-2μmol/L索拉非尼联合使用对正常肝细胞LO2活性抑制作用小(抑制率为5.27％-39.70％)。

实施例3结合实施例2的实验结果说明0.4-0.8μmol/L的MLN4924与0.25-2μmol/L索拉非尼联合使用具有相加或协同作用，比两者单独用药抑制肝癌细胞生长的效果更强，而且对正常肝细胞影响不大；因此，上述实验提示1:5至16:5范围内，两种药物联合用药时对肝癌细胞HepG2增殖抑制作用更强，且对正常肝细胞LO2毒性更小。

当0.4μmol/L MLN4924与2μmol/L索拉非尼联合使用协同效果最大，对正常肝细胞LO2活性抑制作用小；因此，发明人认为MLN4924与索拉非尼物质量比为1:5时，药物联用效果最好。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种药物组合物，其特征在于，包含MLN4924和索拉非尼，所述MLN4924与索拉非尼物质量比为1:160至16:5。

2.如权利要求1所述药物组合物，其特征在于，所述MLN4924与索拉非尼物质量比1:5至16:5。

3.如权利要求2所述药物组合物，其特征在于，所述MLN4924与索拉非尼物质量比为1:5。

4.如权利要求1-3任一项所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

5.如权利要求1-3任一项所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的使用方式为注射、口服、手术放置中的一种或多种医学上可接受的方式。

6.如权利要求1-3任一项所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为粉剂、注射液、胶囊、片剂、缓释剂或口服液中的一种或多种医学上可接受的剂型。

7.如权利要求1-3任一项所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的给药剂量以保证该药物组合物在哺乳动物体内能够达到有效的血药浓度。

8.权利要求1-3任一项所述药物组合物在制备抗肝细胞癌药物中的应用。

9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述药物组合物是指抑制肝癌细胞的生长或增殖的药物。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肝癌细胞包括人肝癌HepG2。