CN108403685A - 羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤包括以下肿瘤的一种或几种：卵巢癌、肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、食管癌、乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌、脑瘤或胰腺癌。其中，所述抗肿瘤药物的作用在于体外用于抑制多种肿瘤细胞的增殖，在体内可以低毒、有效地抑制肿瘤的生长。本发明首先认识到羟基芫花素可以单独或与其他抗肿瘤成分联用，在体内可以低毒、有效地抑制肿瘤的生长，并能在体外用于抑制多种肿瘤细胞的增殖，因此，可以用于治疗或预防多种肿瘤的药物中。

Description

羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
肿瘤(tumor)是机体在错综复杂的因素下局部组织细胞无限增生形成。肿瘤包括了良性肿瘤和恶性肿瘤两种，良性肿瘤生长速度较为缓慢，恶性肿瘤的增长则非常迅速，肿瘤细胞与周围的组织粘连，侵袭机体状态良好的组织细胞，并可能发生转移，又称为癌症(cancer)。
癌症是世界范围内严重威胁人类生命健康的重大疾病，我国也是如此。肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、食管癌、女性乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌、脑瘤和胰腺癌是我国主要的恶性肿瘤，约占全部新发病例的75％。肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、脑瘤、白血病和淋巴瘤是主要的肿瘤死因，约占全部肿瘤死亡病例的80％。
手术、化疗和放疗是目前应对癌症的三大主要手段。手术后常常会加速癌细胞转移而离不开化疗药物的支持和配合，故化疗仍是现阶段癌症治疗的重器。但是，化疗存在毒副作用大、病人耐受性差、价格昂贵等问题。所以，发现新的高效低毒的抗癌药物是一项长期的任务。
黄酮类化合物是广泛存在于自然界中的一大类以中央三碳原子连接两个苯环(A环，B环)为母核的多酚类化合物，具有调节免疫、抗氧化、抗菌、抗肿瘤等广泛生物学活性。许多研究表明天然黄酮化合物具有抗乳腺癌、抗肺癌、前列腺癌等多种肿瘤的功效，有望能成为有效、低毒、价廉的抗癌药物，为改善患者生存质量提供选项。
近年来，对于芫花的抗肿瘤作用时有文献报道。以前普遍认为，二萜原酸酯是芫花中的主要抗肿瘤有效成分，后来发现芫花中的芹菜素、芫花素也有一定的抗肿瘤作用，但其抗肿瘤药效较弱，不具备成药性。羟基芫花素是来自芫花中的另一个黄酮类成分，关于羟基芫花素(hydroxygenkwanin,HGK) 的文献报道比较少，早期的报道主要集中提取分离和含量测定方法，活性研究仅少量关于抗氧化、抗血栓的报道。传统上认为，羟基芫花素是芫花中祛痰止咳的主要有效成分。目前已有的活性研究仅少量关于抗氧化、抗血栓的报道。目前关于羟基芫花素的单独抗肿瘤活性国内外未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供了羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，本发明所述的羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用中，所述肿瘤包括以下肿瘤的一种或几种：卵巢癌、肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、食管癌、乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌、脑瘤或胰腺癌。
优选地，本发明所述的羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用中，所述肿瘤为所述肿瘤为乳腺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠癌。
优选地，本发明所述的羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用中，所述抗肿瘤药物还包括药学上可接受的盐和/或药学上可接受的载体。
优选地，本发明所述的羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用中，所述抗肿瘤药物还包括其他中药或中药提取物或中药有效部位。
优选地，本发明所述的羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用中，所述抗肿瘤药物为口服制剂、注射剂、吸入制剂或外用制剂。
优选地，本发明所述的羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用中，所述抗肿瘤药物的注射剂量范围为1～150mg/kg；更优选地，所述抗肿瘤药物的注射剂量范围为10～80mg/kg。
优选地，本发明所述的羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用中，所述抗肿瘤药物的口服使用剂量范围是5～400mg/kg；更优选地，所述抗肿瘤药物的口服使用剂量范围是20～200mg/kg。
优选地，本发明所述的羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用中，所述抗肿瘤药物的作用在于体外用于抑制多种肿瘤细胞的增殖。
优选地，本发明所述的羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用中，所述抗肿瘤药物的作用在于体内可以低毒、有效地抑制肿瘤的生长。
本发明与现有技术相比，本发明首先认识到羟基芫花素可以单独或与其他抗肿瘤成分联用，在体内可以低毒、有效地抑制肿瘤的生长，并能在体外用于抑制多种肿瘤细胞的增殖。
附图说明
图1为羟基芫花素(QYHS)化学结构图；
图2为羟基芫花素体外对多种肿瘤细胞生长抑制的剂量-效应曲线图；
图3为本发明的一个实施方式中的羟基芫花素的纳米粒的平均粒径分布图；
图4为本发明的一个实施方式中的羟基芫花素的纳米粒粒子的形态图；
图5为本发明的一个实施方式中的HGK纳米粒在0.9％NaCl、5％Glu、PBS、血浆、人工胃肠液中粒径分布图；
图6为本发明的一个实施方式中的HGK纳米粒的溶血率示意图；
图7为本发明的一个实施方式中的HGK纳米粒的药物计算累计释放量图；
图8为本发明的一个实施方式中的羟基芫花素与羟基芫花素纳米粒体外抗肿瘤活性对比图；
图9为本发明的一个实施方式中的羟基芫花素对MCF-7荷瘤小鼠体重下降趋势图；
图10为本发明的一个实施方式中的羟基芫花素对MCF-7荷瘤小鼠肿瘤生长抑制情况。
具体实施方式
在本发明的一个或多个实施方式中，羟基芫花素(5,3',4'-三羟基-7-甲氧基黄酮；羟基芫花黄素；羟基芫花素/羟基芫花黄素)是指具有下述结构式(也参见图1)
分子式为C16H12O6，分子量为300.27的化合物，可以通过本领域公知的提取方法或合成方法获得，也可以通过商业渠道购买获得(本发明实施例中购自成都瑞芬思生物科技有限公司)。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述包括羟基芫花素的抗肿瘤药物的药学上可接受的盐包括碱加成盐或酸加成盐，例如无机碱盐(例如钠盐、钾盐等碱金属盐，钙盐、镁盐等碱土金属盐，铵盐)、有机碱盐(例如三乙胺盐、二异丙基乙胺盐、吡啶盐、甲基吡啶盐、乙醇胺盐、三乙醇胺盐、二环己基胺盐、N，N′-二苄基亚乙基二胺盐等有机胺盐)、无机酸加成盐(例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐等)、有机羧酸加成盐或磺酸加成盐(例如甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐等)、碱性氨基酸盐或酸性氨基酸盐(例如精氨酸盐、天冬氨酸盐、谷氨酸盐等)等。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述包括羟基芫花素的抗肿瘤药物的药学上可接受的载体是指常用于制备药物制剂的各种有机载体或无机载体，还包括制备本发明的抗肿瘤药物和抗肿瘤效果增强剂，所述载体例如赋形剂 (例如蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石粉、磷酸钙、碳酸钙等)、缩合剂(例如纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇、蔗糖、淀粉等)、崩解剂(例如淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙盐、羟丙基淀粉、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠、磷酸钙、柠檬酸钙等)、润滑剂(例如硬脂酸镁、earosil、滑石粉、十二烷基硫酸钠等)、矫味剂(例如柠檬酸、薄荷醇、甘氨酸、橙粉等)、防腐剂(例如苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等)、稳定剂(柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸等)、悬浮剂(例如甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸铝等)、分散剂(例如羟丙基甲基纤维素等)、稀释剂(例如水等)、蜡基物质(例如可可脂、聚乙二醇、白矿脂)等。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述包括羟基芫花素的抗肿瘤药物的的制剂包括固体、半固体或液体药物制剂的形式(片剂、弹丸剂、糖锭剂、胶囊剂、栓剂、乳膏剂、软膏剂、气雾剂、散剂、液体制剂、乳剂、混悬剂、糖浆剂、注射剂等)，使用本发明药物组合物、抗肿瘤药物，该制剂适于经直肠、鼻内、肺部、阴道内、外部(局部)、口服或肠胃外(包括皮下、植入、静脉内和肌内)给药。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述抗肿瘤药物的注射剂量范围为 1～150mg/kg；更优选地，所述抗肿瘤药物的注射剂量范围为10～80mg/kg。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述抗肿瘤药物的口服制剂的使用剂量范围是5～400mg/kg；更优选地，所述抗肿瘤药物的口服使用剂量范围是20～200mg/kg。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述抗肿瘤药物的作用在于体外用于抑制多种肿瘤细胞的增殖，和/或在于体内可以低毒、有效地抑制肿瘤的生长。
在本发明的一个或多个实施方式中，以羟基芫花素为研究对象，对Hela、 HepG2、BT474、SKBR-3、A549、MCF-7细胞系进行筛选，以MCF-7荷瘤小鼠为研究动物模型，确定了羟基芫花素对多种肿瘤细胞的细胞毒性及对人乳腺瘤的抑制作用。
在本发明一个实施例中，羟基芫花素对人肝癌细胞PLC/PRF/5、Hep3B、 SMMC-7721、SK-HEP-1、HepG2、HuCCT1和SNU-449有较强的生长抑制作用，半数抑制浓度IC50值分别为2.92、6.40、9.47、11.35、12.03、13.31μg/mL、 16.57μg/mL。
在本发明的另一个实施例中，羟基芫花素对人卵巢癌、人乳腺癌细胞的 MDA-MB-231也有较强的抑制作用(IC50值分别为为3.64μg/mL、6.73μg/mL)，对人宫颈癌、人结肠癌Colo205细胞株也有一定的抑制作用(IC50值分别为 13.24μg/mL、18.31μg/mL)，说明羟基芫花素抗瘤谱比较广。但羟基芫花素对对人肝癌细胞SiHa、MHCC97H、HCCLM3的抗肿瘤活性很弱，IC50值高达 25.79、51.29、78.43μg/mL；
在本发明的又一个实施例中，羟基芫花素对人胶质瘤细胞U87MG、人乳腺癌细胞BT474和SK-BR-3、人肺癌细胞A549的抑瘤作用也较弱，相应的 IC50值分别均大于20μg/mL。说明羟基芫花素对肿瘤的抑制具有一定的选择性。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1羟基芫花素体外抗肿瘤活性
分别调整表1与表2所示14种细胞(PLC/PRF/5、Hep3B、SMMC-7721、 SK-HEP-1、HuCCT1、SNU-449、SK-OV-3、MDA-MB-231、Colo205、U87MG、 SiHa、MHCC97H、HCCLM3)生长状态，待细胞处于对数生长期时收获所述细胞，消化洗涤后进行台盼蓝染色，并计数。使用完全培养基将贴壁细胞密度调整为5.56×104个/mL，接种到96孔细胞培养板，90μl/孔，保证贴壁细胞每孔细胞数量为5×103个。将接种好的细胞板置于37℃培养箱中孵育过夜，用DMSO溶解羟基芫花素，配制100mM储液，用培养基做9个浓度点的3.16 倍梯度稀释，配制终浓度分别为5mM、1.58mM、500μM、158μM、50μM、 15.8μM、5μM、1.58nM、0.5nM的工作液。取出细胞培养板，将上述羟基芫花素稀释液加入到细胞培养板中，10μl/孔，每个浓度做三个复孔，将细胞培养板置于培养箱中继续孵育72小时。72小时后，将CellTiter AQueous OneSolution试剂置于室温融化并平衡至室温，向细胞培养板中加入20μl/孔的 CellTiterAQueous One Solution试剂，将细胞培养板置于37℃培养箱中继续孵育3小时，使用酶标仪读取各孔490nm波长的吸光度(OD值)。采用 GraphPad Prism 5.0软件对数据进行图形化处理计算IC50，对数据进行“S”形非线性回归分析，匹配相适应的剂量-效应曲线。存活率的计式如下，IC50可在GraphPad Prism 5.0中自动计算得出。其中，所述“S”形非线性回归分析见图1。
存活率(％)＝(OD待测孔–OD空白对照)/(OD阴性对照-OD空白对照)x 100％
表-1羟基芫花素对6种人肝癌细胞的抗肿瘤活性比较
表-2羟基芫花素对人卵巢癌等SK-OV-3、人乳腺癌MDA-MB-231、人结肠癌Colo205、人胶质瘤U87-MG、人宫颈癌SiHa、人肝癌细胞MHCC97H和人高转移肝癌细胞HCCLM3
等7种癌细胞株的抗肿瘤活性比较
由图1与表1、表2可知，羟基芫花素对人肝癌细胞PLC/PRF/5、Hep3B、 SMMC-7721、SK-HEP-1、HepG2、HuCCT1和SNU-449有较强的生长抑制作用，半数抑制浓度IC50值分别为2.92、6.40、9.47、11.35、12.03、13.31μg/mL、 16.57μg/mL。对人卵巢癌、人乳腺癌细胞的MDA-MB-231也有较强的抑制作用(IC50值分别为为3.64μg/mL、6.73μg/mL)，对人宫颈癌、人结肠癌Colo205 细胞株也有一定的抑制作用(IC50值分别为13.24μg/mL、18.31μg/mL)，说明羟基芫花素抗瘤谱比较广。但羟基芫花素对人宫颈癌细胞SiHa、人肝癌细胞 MHCC97H和HCCLM3的抗肿瘤活性很弱，IC50值高达25.79、51.29、 78.43μg/mL；说明羟基芫花素对肿瘤的抑制具有一定的选择性。
实施例2羟基芫花素纳米粒的制备
制备例1
称取羟基芫花素(HGK)4mg，聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS) 4mg溶于0.4mL二甲基甲酰胺(DMF)中，常温，250Hz超声条件下将上述DMF溶液缓慢滴注至4mL去离子水中，随后透析除去DMF，室温，1500 bar条件下均质10次，即得HGK纳米粒。平均粒径为261.1nm(图3)，多分散性指数(PDI)为0.115,电位值-27.5mV。
制备例2
称取羟基芫花素4mg，mPEG2000-PCL2000 4mg溶于0.4mL DMSO中，常温，250HZ超声条件下将上述DMSO溶液缓慢滴注至4mL去离子水中，随后透析除去DMSO，室温，1500bar条件下均质10次，即得HGK纳米粒。平均粒径为274.1nm，多分散性指数(PDI)为0.172,电位值-22.3mV。
制备例3
称取4mg羟基芫花素、4mg的Puronic 188溶于0.4mL DMSO中，室温、250HZ超声条件下将上述DMSO溶液缓慢滴注至4mL去离子水中，随后透析除去DMSO，室温、1500bar条件下均质10次，即得HGK纳米粒。平均粒径为357.1nm，多分散性指数(PDI)为0.212,电位值-20.3mV。
制备例4
称取羟基芫花素4mg，TPGS 4mg溶于0.4mL DMF中，常温，250Hz 超声条件下将上述DMF溶液缓慢滴注至4mL去离子水中，随后透析除去 DMF，室温，1500bar条件下均质10次，即得HGK纳米粒。平均粒径为298.1nm，多分散性指数(PDI)为0.155,电位值-26.5mV。
制备例5
称取羟基芫花素4mg，mPEG2000-PCL2000 4mg溶于0.4mL DMSO中，常温，250HZ超声条件下将上述DMSO溶液缓慢滴注至4mL去离子水中，随后透析除去DMSO，室温，1500bar条件下均质10次，即得HGK纳米粒。平均粒径为274.1nm，多分散性指数(PDI)为0.172,电位值-22.3mV。
制备例6
称取4mg羟基芫花素、4mg的Puronic 188溶于0.4mL DMSO中，室温、250HZ超声条件下将上述DMSO溶液缓慢滴注至4mL去离子水中，随后透析除去DMSO，室温、1500bar条件下均质10次，即得HGK纳米粒。平均粒径为357.1nm，多分散性指数(PDI)为0.212,电位值-20.3mV。
制备例7
制备浓度1mg/mL的制备例1中HGK纳米粒，稀释至100μg/mL，吸取6 μL滴到300目的铜网上，空气中自然晾干，后用0.1％醋酸铀染色10min，透射电镜下观察粒子的形态(图4)。
制备例8制备例1中HGK纳米粒在0.9％NaCl、5％Glu、PBS、血浆、人工胃肠液中的稳定性考察
配制1.8％NaCl、10％Glu的溶液；随后将此溶液和PBS分别与实例1中的HGK纳米粒(1mg/mL)1:1等体积混合，37℃孵育并在特定的时间点测其粒径的变化。
HGK纳米粒与大鼠血浆混合后(1:4，v/v)，37℃孵育并在特定的时间点测其粒径的变化。
人工胃液的配置：取浓度为1mol/L的稀盐酸16.4mL，加800mL蒸馏水， 10g胃蛋白酶，混匀，加水稀释至1000mL。
人工肠液的配置：6.8g磷酸二氢钾，加水500mL,用0.1mol/L氢氧化钠调pH6.8,另取胰蛋白酶10g，加水溶解，两液混合后加水稀释至1000mL。
分别取0.5mL过膜后的配置好的人工胃肠液，与实例1中的HGK纳米粒等体积混合，37℃孵育，并在特定时间点测其粒径的变化。
结果：HGK纳米粒在0.9％NaCl、5％Glu、PBS、血浆、人工胃肠液中基本稳定，孵育12h之内未发现明显沉淀或粒径增大的现象(图5)。
实施例3 HGK纳米粒的溶血考察
大鼠眼眶取血后，于5000rpm离心10min，收集沉淀。随后用0.9％的NaCl 溶于洗涤几遍，直至上清无明显红色。随后血细胞沉淀用0.9％的NaCl的溶液稀释至4％红细胞悬浮液(v/v)。取此悬浮液0.5mL与0.5mL的已调等渗的制备例1中的纳米粒混合，37℃孵育4h后，5000rpm离心10min,取上清于酶标仪540nm处测吸光度值。同时将4％的红细胞悬浮液与0.9％的NaCl 混合作为阴性对照，4％的红细胞悬浮液与去离子水混合作为阳性对照。
溶血率(％)＝(OD样品-A阴性对照)/(A阳性对照-A阴性对照)×100
结果：HGK纳米粒的溶血率很降低，2mg/mL的HGK纳米粒溶血率低于 5％(图6),体内静脉给药时所需的浓度完全不溶血，满足静脉注射的条件。
实施例4 HGK纳米粒的体外释放
取制备例1中的HGK纳米粒计4mL或HGK原料药(分散于水)使其 HGK含量为350μg，于1L含5％吐温的PBS(w/v)中进行释放，分别在 0min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h……取50μL释放内液，并补充相应体积释放介质，所取样品用450μL甲醇稀释破坏后离心进液相，测药物浓度，根据内液减少的药物计算累计释放度。
羟基芫花素纳米粒在含5％吐温的PBS中168h的累计释放率达到 83.88％，前8h有一定的突释，可能是包覆在纳米粒表面的游离药物所致，之后缓慢释放；原料药的累积释放量为0％(见图7)。
实施例5羟基芫花素与羟基芫花素纳米粒体外抗肿瘤活性对比
将对数生长期的人乳腺癌MCF-7、人乳腺癌BT474、人肺腺癌A549、人宫颈癌Hela、人肝癌HepG2、人乳腺癌SKBR-3细胞以8000个/孔接种于96 孔板，37℃、5％CO2培养24h后，弃去培养基；分别加入羟基芫花素纳米粒 (HGK-NPs)、羟基芫花素的DMSO溶液150μL，每个样品的药物浓度设为 0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20μg/mL(用含1％双抗的培养基稀释)；继续培养48h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，孵育4h；弃去上清液，每孔加入150μL DMSO，于微孔板振荡器上振荡10min，使结晶物溶解均匀，用酶标仪读数(测定波长为570nm)。采用GraphPad Prism 5.0软件对数据进行图形化处理计算IC50，对数据进行“S”形非线性回归分析，匹配相适应的剂量——效应曲线。存活率的计式如下，IC50可在GraphPad Prism 5.0中自动计算得出。见图8。
存活率(％)＝(OD待测孔–OD空白对照)/(OD阴性对照-OD空白对照)x 100％
表-3羟基芫花素游离药物和纳米粒对几种癌细胞的IC50值比较
实施例6羟基芫花素和纳米粒对MCF-7荷瘤小鼠肿瘤生长抑制情况
将对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7以1.2×107个皮下接种于Nu/Nu裸鼠(20±2g)右侧腋下，待肿瘤体积长到100mm3左右时(视为0d)，筛选肿瘤体积比较接近的小鼠28只，随机分成4组(n＝7)，分别尾静脉注射制备例1 中的羟基芫花素纳米粒(HGK-NPs，20mg/kg)，灌胃给予羟基芫花素纳米粒 (60mg/kg)，同时设立阳性药对照组(尾静脉注射给予市售紫杉醇注射液 8mg/kg)和生理盐水阴性对照组。隔天给药，共实验10天。
考察指标：每两天上午9点至10点，用电子秤称量小鼠体重；用游标卡尺测量肿瘤体积。实验结束后，脱颈椎处死小鼠，完整剥离腋下肿瘤组织称重，计算抑瘤率。
抑瘤率(％)＝(1－治疗组平均瘤重/生理盐水组平均瘤重)×100。
结果：阳性药组小鼠体重呈现下降趋势，而羟基芫花素给药组的最终体重变化与生理盐水组类似，没有明显下降(见图9)，说明在给药剂量范围内无明显的毒性作用。羟基芫花素静脉注射时表现出卓越的抗肿瘤疗效(见图 10)，20mg/kg尾静脉给药的肿瘤抑制率较紫杉醇(Paclitaxel,PTX)市售注射剂(8mg/kg)(71.70％vs.62.18％，P<0.05)以及高剂量(60mg/kg)灌胃给药的羟基芫花素纳米粒(71.70％vs.47.63％，P<0.05)有显著性增强，证明羟基芫花素纳米粒在抗肿瘤方面非常好的有效性，是一种很有前途的抗癌药物。羟基芫花素及阳性药PTX对MCF-7荷瘤小鼠的抑瘤率如下表(n＝7，mean± SD)。结果见图9，图10及表-4。
表-4羟基芫花素纳米粒对人乳腺癌MCF-7荷瘤小鼠的抑瘤率
实施例7羟基芫花素及其纳米粒对肝癌PLC/PRF/5荷瘤鼠的药效实验
将对数生长期的人肝癌细胞PLC/PRF/5以5×106个皮下接种于雄性 BalB/C裸鼠(20±2g)右侧背部，待肿瘤体积长到100mm3左右时(视为0d)，筛选肿瘤体积比较接近的小鼠40只，随机分成5组(n＝8)，分别尾静脉注射制备例1中的羟基芫花素纳米粒(40mg/kg)，灌胃给予制备例1中的羟基芫花素纳米粒(40mg/kg)和羟基芫花素原料药纳米粒(40mg/kg，原料药均匀分散于1％的羧甲基纤维素钠中)，同时设立阳性药对照组(尾静脉注射给予市售紫杉醇注射液8mg/kg)和生理盐水阴性对照组，隔天给药，共实验10 天。
考察指标：每两天上午9点至10点，用电子秤称量小鼠体重；用游标卡尺测量肿瘤体积。实验结束后，脱颈椎处死小鼠，完整剥离腋下肿瘤组织称重，计算抑瘤率。
抑瘤率(％)＝(1－治疗组平均瘤重/生理盐水组平均瘤重)×100。同时剖取小鼠肝脏和脾脏，称重，按照下式计算肝脾指数
肝指数＝肝脏重量/小鼠体重
脾指数＝脾脏重量/小鼠体重
结果：羟基芫花素静脉注射时表现出显著的抗肿瘤疗效(见表-5)，40mg/kg 尾静脉给药的肿瘤抑制率68.7％，口服给药时抑瘤率只有31％，与原料药物理混悬液的抑瘤率(25％)很接近，说明用于治疗肝癌时，需要以纳米粒的形式静脉注射给药。同时，静脉注射时的肝脾指数和紫杉醇注射液相当，提示具有较好的安全性。
表5羟基芫花素及其纳米粒对人肝癌PLC/PRF/5荷瘤小鼠的抑瘤率和肝脾指数
剂量mg/kg 抑瘤率(％) 肝指数 脾指数
生理盐水 0.045 0.0023
紫杉醇注射液 8 80.6 0.052 0.0032
羟基芫花素纳米粒(iv) 40 68.7 0.050 0.0032
羟基芫花素纳米粒(ig) 40 31 0.040 0.0027
羟基芫花素(ig) 40 25 0.043 0.0028
实施例8羟基芫花素纳米粒对小鼠的急性毒性实验
10只昆明小鼠，♀♂各半。动物给药前禁食不禁水12小时，给药组动物按350mg/kg剂量静脉注射制备例1中的羟基芫花素纳米粒(HGK-NPs)，观察单次给药后动物中毒反应及死亡情况，记录中毒反应症状、出现时间、表现程度及死亡时间，连续观察14天。
结果：羟基芫花素纳米粒单次静脉注射350mg/kg后，5只雌鼠均自由活动，未见明显异常。三只雄鼠于给药后立刻出现四肢抽搐、尾巴直立、翻身现象，30s至1min后，两只老鼠以上现象消失，静卧于鼠笼，半小时后恢复正常；一只死亡。其余小鼠给药后，主要表现为静卧、少动，稍有呼吸急促现象，半小时后恢复正常。其后直到第15天，小鼠未再有死亡现象，各组小鼠均比较活泼，期间未发现异常现象。在急性毒性研究中，羟基芫花素纳米粒在最大给药剂量350mg/kg时，也只有10％的小鼠死亡，即其半数致死量 LD50大于350mg/kg。这样看来，羟基芫花素纳米粒的LD50为其有效剂量的至少9倍以上，显示具有非常好的安全性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤包括以下肿瘤的一种或几种：卵巢癌、肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、食管癌、乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌、脑瘤或胰腺癌。
3.根据权利要求1所述的羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠癌。
4.根据权利要求1所述的羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物还包括药学上可接受的盐和/或药学上可接受的载体。
5.根据权利要求1所述的羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物还包括其他中药或中药提取物或中药有效部位。
6.根据权利要求1所述的羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为口服制剂、注射剂、吸入制剂或外用制剂。
7.根据权利要求1所述的羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物的注射剂量范围为1～150mg/kg；优选10～80mg/kg。
8.根据权利要求1所述的羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物的口服使用剂量范围是5～400mg/kg；优选20～200mg/kg。
9.根据权利要求1所述的羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物的作用在于体外用于抑制多种肿瘤细胞的增殖。
10.根据权利要求1所述的羟基芫花素在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物的作用在于体内可以低毒、有效地抑制肿瘤的生长。
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SIMENG LI ET AL.: ""Isolation of anticancer constituents from flos genkwa (Daphne genkwa Sieb.et Zucc.) through bioassay-guided procedures"", 《CHEMISTRY CENTRAL JOURNAL》 *
李思蒙等: ""芫花提取物及单体化合物体外抗肿瘤活性的初步筛选研究"", 《中药与天然药高峰论坛暨第十二届全国中药和天然药物学术研讨会 论文集》 *

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