CN108396059B - 一种检测乙肝病毒的试剂盒及乙肝病毒的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及乙肝病毒检测技术领域，特别涉及一种检测乙肝病毒的试剂盒及其检测方法。本发明的试剂盒包括：脂质体‑QD复合物标记的报告探针，磁珠修饰的捕获探针和缓冲液；所述报告探针核酸序列和所述捕获探针核酸序列分别与乙肝病毒DNA互补。本发明用脂质体包裹量子点，使荧光信号更加放大和集中，有利于检测灵敏度。本发明的试剂盒检测灵敏度高、特异性好，检测极限为10fmol，1个小时即可得到检测结果。

Description

一种检测乙肝病毒的试剂盒及乙肝病毒的检测方法
技术领域
本发明涉及乙肝病毒检测技术领域，特别涉及一种利用脂质体量子点定量检测乙肝病毒的方法。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)为一种流行十分广泛的部分双链DNA病毒，是导致急慢性肝炎和肝细胞癌变的致病因子，严重危害了人类公共卫生安全。慢性HBV感染者并不表现有任何临床症状，但具有较强的传染性并有可能发展为肝硬化及肝癌等严重疾病。因此检测筛查HBV是否感染、感染后的治疗效果评价以及免疫水平监测是一项艰巨的工程。
目前医院和实验室监测乙肝病毒的方法主要是荧光定量PCR和检测HBsAg为阳性作为HBV感染的标志。荧光定量PCR虽然灵敏度高，特异性强，但是费用较高，对于实验室要求也会较高，容易出现假阳性的现在，费用也会较高。在慢性感染的病人中有一部分人群针对HBsAg产生的细胞免疫很弱，而且有的几乎检测不到抗原及相应的抗体。这部分HBsAg阴性的HBV感染者可以用核酸定量的检测方法检出，这就需要有可靠的HBV DNA检测技术。因此，这些检测方法需要实验室特定的设备，及专业的实验人员，耗时较长，有时候出现假阳性的结果，给检测带来了一定的困难。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种用脂质体量子点和磁珠作为检测试剂对乙肝病毒进行检测的方法，可以对乙肝病毒进行快速检测，检测时间短，检测信号强，特异性好，灵敏度高。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种检测乙肝病毒的试剂盒，所述试剂盒包括：脂质体-QD复合物标记的报告探针，磁珠修饰的捕获探针和缓冲液；所述报告探针的核酸序列和所述捕获探针的核酸序列分别与乙肝病毒DNA互补；
所述脂质体-QD复合物为羧基官能化的脂质体量子点微球，所述脂质体-QD复合物的制备方法包括：将二硬脂酰基磷脂酰胆碱、磷脂-聚乙二醇-羧基、胆固醇和CdSe量子点按照摩尔比9～12:2～4:0.8～1.5:4～6.5，在氯仿中混合，用薄膜水化法制备得到脂质体-QD复合物。
优选的，所述脂质体-QD复合物标记报告探针的制备方法包括：在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺存在下催化所述脂质体-QD复合物与氨基修饰的报告探针核酸反应，得到脂质体-QD复合物标记的报告探针。
更优选的，所述脂质体-QD复合物与所述报告探针的摩尔比例为1～1.5:8～10，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与所述脂质体-QD复合物的质量比为5～6:1～1.5，所述N-羟基琥珀酰亚胺与所述脂质体-QD复合物的质量比为2.5～1.5:1～1.5。
本发明中，所述乙肝病毒优选为B型、C型或D型乙肝病毒。
进一步优选的，当乙肝病毒为B型乙肝病毒时，报告探针的核酸序列为5’-3’:GCACAGNACCGGTTTTAAGAAAAAAAAAA-Amino Modifier C3，捕获探针的核酸序列为5’-3’:Biotin–AAAAAAAAAACGTCAGGGTTTAGGTRAACGC；
当乙肝病毒为C型乙肝病毒时，报告探针的核酸序列为5’-3’:CAACGGGCAAACAGGAGCGGAAAAAAAAAA-Amino Modifier C3，捕获探针的核酸序列为5’-3’Biotin–AAAAAAAAAAATGAAGGTCCTTGTAGTTGC；
当乙肝病毒为D型乙肝病毒时，报告探针的核酸序列为5’-3’GGTTCCATACAACGGGCABG AAAAAAAAAA-Amino Modifier C3，捕获探针的核酸序列为5’-3’Biotin–AAAAAAAAAAAACAGGAGATTAAGGTCCNA。
优选的，所述磁珠修饰捕获探针的制备方法包括：在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺存在下催化羧基官能化的磁珠与氨基修饰的捕获探针核酸反应，得到磁珠修饰的捕获探针。
更优选的，所述羧基官能化的磁珠与所述捕获探针核酸的摩尔比为1～1.5:8～10，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与所述羧基官能化的磁珠的质量比为5～6:1～1.5，所述N-羟基琥珀酰亚胺与所述羧基官能化的磁珠的质量比为2.5～1.5:1～1.5。
优选的，所述缓冲液包括以下组分：80～100mM Tris-HCl，10～20mM(NH4)2SO4，2～10mM MgCl2，所述缓冲液的pH值为8.0。
优选的，所述CdSe量子点的发射波长为488nm、561nm或647nm。
本发明还提供了上述任意一项技术方案所述试剂盒检测乙肝病毒的方法，包括以下步骤：将所述脂质体-QD复合物标记的报告探针、所述磁珠修饰的捕获探针与待测样本DNA混合，在所述缓冲液中40～50℃孵育10～30分钟，离心后，观察沉淀物的荧光信号，根据荧光信号强弱对乙肝病毒进行定量测定。
优选的，所述报告探针和所述捕获探针的分子比为1～1.2:2～2.2。
现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明检测乙肝病毒的试剂盒包括：脂质体-QD复合物标记的报告探针，磁珠修饰的捕获探针和缓冲液；所述报告探针核酸序列和所述捕获探针核酸序列分别与乙肝病毒DNA互补。本发明用脂质体包裹量子点，使荧光信号更加放大和集中，有利于提高检测灵敏度。本发明的试剂盒检测无需pcr扩增可以达到高灵敏度，检测极限为10fmol。特异性好，成本低，检测更加快速。本发明的试剂盒制备方法简单，2小时即可完成制备。
本发明检测乙肝病毒的试剂盒中，脂质体-QD复合物的制备方法包括：将二硬脂酰基磷脂酰胆碱、磷脂-聚乙二醇-羧基、胆固醇和CdSe量子点按照摩尔比9～12:2～4:0.8～1.5:4～6.5在氯仿中混合，用薄膜水化法制备脂质体-QD复合物。本发明的试剂盒在检测乙肝病毒时，能够用普通荧光显微镜观察荧光信号，然后对脂质体量子点微球进行完全计数和分析。
本发明的试剂盒检测乙肝病毒不需要pcr扩增，减少气溶胶污染，更加敏捷和快速。将脂质体-QD复合物标记的报告探针、所述磁珠修饰的捕获探针与乙肝病毒DNA混合，在所述缓冲液环境下40～50℃孵育10～30分钟，离心后，观察沉淀物的荧光信号；当观察到荧光信号时，即为阳性，反之则为阴性；根据荧光信号强弱对乙肝病毒进行定量测定。本发明乙肝病毒检测方法，1个小时即可得到检测结果。作为一种可实施的方式，本发明的试剂盒中报告探针和捕获探针的核酸序列可以设置不同分型的乙肝病毒DNA互补序列，通过HBV靶序列的不同，鉴别不同型的HBV，比如b型和c型，实现定性定量分型检测HBV。
附图说明
图1为本发明检测乙肝病毒的示意图；其中，1、脂质体量子点微球；2、链霉素亲和素修饰磁珠；3、报告探针序列；4、捕获探针序列；5、乙肝病毒DNA靶序列；
图2为本发明检测乙肝病毒试剂盒的特异性实验结果；
图3为本发明检测乙肝病毒试剂盒的灵敏度实验结果。
具体实施方式
本发明提供了一种检测乙肝病毒的试剂盒，用该试剂盒对乙肝病毒进行检测，检测时间短，检测信号强，灵敏度高，特异性好。
本发明检测乙肝病毒的试剂盒包括：脂质体-QD复合物标记的报告探针，磁珠修饰的捕获探针和缓冲液；所述报告探针核酸序列和所述捕获探针核酸序列分别与乙肝病毒DNA互补。
本发明中，所述脂质体-QD复合物为羧基官能化的脂质体量子点微球。所述脂质体-QD复合物的制备方法包括：将二硬脂酰基磷脂酰胆碱、磷脂-聚乙二醇-羧基、胆固醇和CdSe量子点在氯仿中混合，用薄膜水化法制备脂质体-QD复合物。所述二硬脂酰基磷脂酰胆碱、磷脂-聚乙二醇-羧基和胆固醇为制作脂质体的膜材，所述二硬脂酰基磷脂酰胆碱、磷脂-聚乙二醇-羧基、胆固醇与所述量子点的摩尔比为9～12:2～4:0.8～1.5:4～6.5，优选为10～11:2.5～3.5:0.9～1.2:4.5～6。所述混合的温度优选为35～45℃，更优选为38～42℃。本发明中，所述CdSe量子点的发射波长为488nm、561nm或647nm。不同发射波长可以用相同的激发光激发，在不同的对应的滤光块观察，根据不同的荧光信号来判断，同时检测B、C、D型HBV。
本发明所述薄膜水化法具体包括：先减压蒸发除去二硬脂酰基磷脂酰胆碱、磷脂-聚乙二醇-羧基、胆固醇和CdSe量子点混合物中的氯仿；将形成的薄膜用惰性气体干燥；将所述干燥后的薄膜溶于PBS溶液中，得到薄膜溶液；采用聚碳酸酯薄膜滤器过滤所述薄膜溶液，得到羧基官能化的脂质体量子点微球。本发明优选在减压蒸发过程中出现薄膜后，用惰性气体干燥，所述惰性气体优选为氩气或氮气。用PBS溶解薄膜，本发明优选PBS的pH值为7.4，PBS的用量为1～3ml，溶解温度为28～32℃。溶解后的溶液用0.2μm的聚碳酸酯薄膜滤器过滤，优选过滤2～3次。
本发明中，所述脂质体-QD复合物标记报告探针的方法包括：在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺存在下催化所述脂质体-QD复合物与氨基修饰的报告探针核酸反应，得到脂质体-QD复合物标记的报告探针。
所述脂质体-QD复合物与所述报告探针的摩尔比例为1～1.5:8～10，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与所述脂质体-QD复合物的质量比为5～6:1～1.5，所述N-羟基琥珀酰亚胺与所述脂质体-QD复合物的质量比为2.5～1.5:1～1.5。
本发明中，所述催化反应在PBS缓冲液中进行，所述PBS缓冲液的pH值优选为7.0。所述脂质体-QD复合物先用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的偶联剂进行活化，所述活化的时间优选为10～20分钟，更优选为15分钟。所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐优选与所述脂质体-QD复合物的质量比为优选为5.5:1.25。
本发明将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与活化的脂质体-QD复合物混合，EDC和NHS催化氨基和羧基交联的酰胺反应20～40min，更优选为30min；在反应后的溶液中加入氨基修饰的报告探针核酸，室温温育，离心后重悬得到脂质体-QD复合物标记报告探针。本发明所述N-羟基琥珀酰亚胺优选与所述脂质体-QD复合物的质量比为更优选为2:1.25。本发明所述脂质体-QD复合物与所述报告探针核酸的摩尔比例优选为1.25:9。本发明室温温育的时间优选为1.5～3小时，更优选为2小时。本发明中所述重悬用的溶液优选为PBS缓冲液。
本发明所述磁珠修饰捕获探针的方法优选包括：在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺存在下催化羧基官能化的磁珠与氨基修饰的捕获探针核酸反应，得到磁珠修饰的捕获探针。本发明所述羧基官能化的磁珠与氨基修饰的捕获探针核酸催化反应实质为氨基与羧基的反应，具体方法同上述脂质体-QD复合物与氨基修饰的报告探针核酸的催化反应，在此不再赘述。在本发明具体实施例中，所述羧基官能化的磁珠优选购自苏州海狸生物医学公司。
本发明所述检测乙肝病毒的试剂盒中，所述缓冲液优选包括以下组分：80～100mMTris-HCl，10～20mM(NH4)2SO4，2～10mM MgCl2；更优选为85～95mM Tris-HCl，13～18mM(NH4)2SO4，3～8mM MgCl2；所述缓冲液的pH值优选为8.0。
本发明所述检测乙肝病毒的试剂盒中，所述报告探针核酸序列和所述捕获探针核酸序列分别与乙肝病毒DNA互补。本发明所述乙肝病毒可以为B型、C型或D型乙肝病毒，根据不同乙肝病毒的种类，报告探针与捕获探针的核酸序列不同。当乙肝病毒为B型乙肝病毒时，报告探针的核酸序列优选为5’-3’:GCACAGNACCGGTTTTAAGAAAAAAAAAA-Amino ModifierC3，捕获探针的核酸序列优选为5’-3’:Biotin–AAAAAAAAAACGTCAGGGTTTAGGTRAACGC；当乙肝病毒为C型乙肝病毒时，报告探针的核酸序列优选为5’-3’:CAACGGGCAAACAGGAGCGGAAAAAAAAAA-Amino Modifier C3，捕获探针的核酸序列优选为5’-3’Biotin–AAAAAAAAAAATGAAGGTCCTTGTAGTTGC；当乙肝病毒为D型乙肝病毒时，报告探针的核酸序列优选为5’-3’GGTTCCATACAACGGGCABG AAAAAAAAAA-Amino Modifier C3，捕获探针的核酸序列优选为5’-3’Biotin–AAAAAAAAAAAACAGGAGATTAAGGTCCNA。本发明所述氨基修饰的报告探针和捕获探针优选由上海生工公司合成。
本发明的试剂盒检测灵敏度高、特异性好，检测极限为10fmol。且试剂盒的制备方法简单，2小时即可完成制备。
本发明还提供了上述试剂盒检测乙肝病毒的方法，包括以下步骤：将所述脂质体-QD复合物标记的报告探针、所述磁珠修饰的捕获探针与待测样本DNA混合，在所述缓冲液环境中40～50℃孵育10～30分钟，离心后，观察沉淀物的荧光信号；当观察到荧光信号时，即为阳性，反之则为阴性；根据荧光信号强弱对乙肝病毒进行定量测定。
本发明待测样本优选为上海生工公司合成纯的DNA靶序列和阳性血清样品。
本发明检测乙肝病毒的方法中，所述报告探针和所述捕获探针的分子比为1:1。所述孵育温度优选为45℃，孵育时间优选为20min。
本发明中荧光信号优选用荧光显微镜观察荧光信号的强弱。本发明优选使用软件计算出荧光信号的强弱。根据荧光信号与乙肝病毒浓度之间的线性关系，确定待测样本中乙肝病毒的浓度。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种检测乙肝病毒的试剂盒，包括：脂质体-QD复合物标记的报告探针，磁珠修饰的捕获探针和缓冲液；所述报告探针核酸序列和所述捕获探针核酸序列分别与B型乙肝病毒DNA互补。其制备方法如下：
1、脂质体量子点微球的制备：
长颈烧瓶中加入5mL氯仿，然后加入0.1M二硬脂酰基磷脂酰胆碱100μl、0.1M磷脂-聚乙二醇-羧基36ul、50mM胆固醇22ul，58ul,0.1M发射波长为488nm CdSe量子点，在40℃的温度下混匀。用旋转蒸发仪减压蒸发除去氯仿，当长颈烧瓶的内壁出现薄膜后，用氩气干燥。然后加入2mLPBS(pH7.4)，在30℃下晃动溶解薄膜，溶解后的溶液用0.2μm的聚碳酸酯薄膜滤器过滤3次，得到羧基官能化脂质体-量子点微球，常温保存。
2、脂质体与核酸序列连接(报告探针的形成)：
羧基官能化脂质体-量子点微球溶于PBS缓冲液(pH 7.0)中，使用100mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)偶联剂140ul活化15分钟，轻轻摇动，并加入25mmolN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)140ul反应30分钟，再加入35nmol氨基修饰的B型HBV特异性报告核酸，并与活化的羧基官能化的脂质体–黄红色QD复合物温育2小时，离心后用PBS缓冲液重悬，得到报告探针。所述特异性报告核酸的序列为5’-3’:GCACAGNACCGGTTTTAAGAAAAAAAAAA-Amino Modifier C3。
3、磁珠与核酸序列连接(捕获探针形成)：
羧基官能化的磁珠溶于1ml PBS缓冲液(pH 7.0)中，随后使用100mmol1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的偶联剂140ul活化15分钟，轻轻摇动，并加入25mMol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)140ul再反应30分钟。加入35nmol氨基修饰的B型HBV特异性捕获核酸，并与活化的羧基官能化的磁珠室温孵育2小时，离心后用PBS缓冲液重悬，得到捕获探针。所述特异性捕获核酸的序列为5’-3’:Biotin–AAAAAAAAAACGTCAGGGTTTAGGTRAACGC。
4、制备缓冲液：
所述缓冲液包括以下组分：100mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，3mM MgCl2，所述缓冲液的pH值为8.0。
实施例2
一种检测乙肝病毒的试剂盒，包括：脂质体-QD复合物标记的报告探针，磁珠修饰的捕获探针和缓冲液；所述报告探针核酸序列和所述捕获探针核酸序列分别与B型乙肝病毒DNA互补。其制备方法如下：
1、脂质体量子点微球的制备：
长颈烧瓶中加入5mL氯仿，然后加入0.1M二硬脂酰基磷脂酰胆碱100μl、0.1M磷脂-聚乙二醇-羧基36ul、50mM胆固醇22ul，58ul,0.1M发射波长为561nm CdSe量子点，在40℃的温度下混匀。用旋转蒸发仪减压蒸发除去氯仿，当长颈烧瓶的内壁出现薄膜后，用氩气干燥。然后加入2mLPBS(pH7.4)，在30℃下晃动溶解薄膜，溶解后的溶液用0.2μm的聚碳酸酯薄膜滤器过滤3次，得到羧基官能化脂质体-量子点微球，常温保存。
2、脂质体与核酸序列连接(报告探针的形成)：
羧基官能化脂质体-量子点微球溶于PBS缓冲液(pH 7.0)中，使用100mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)偶联剂240ul活化15分钟，轻轻摇动，并加入25mMolN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)240ul反应30分钟，再加入35nmol氨基修饰的B型HBV特异性报告核酸，并与活化的羧基官能化的脂质体–黄红色QD复合物温育2小时，离心后用PBS缓冲液重悬，得到报告探针。所述特异性报告核酸的序列为5’-3’:GCACAGNACCGGTTTTAAGAAAAAAAAAA-Amino Modifier C3。
3、磁珠与核酸序列连接(捕获探针形成)：
羧基官能化的磁珠溶于1ml PBS缓冲液(pH 7.0)中，随后使用100mmol1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的偶联剂240ul活化15分钟，轻轻摇动，并加入25mMol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)240ul再反应30分钟。加入35nmol氨基修饰的B型HBV特异性捕获核酸，并与活化的羧基官能化的磁珠室温孵育2小时，离心后用PBS缓冲液重悬，得到捕获探针。所述特异性捕获核酸的序列为5’-3’:Biotin–AAAAAAAAAACGTCAGGGTTTAGGTRAACGC。
5、制备缓冲液：
所述缓冲液包括以下组分：100mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，3mM MgCl2，所述缓冲液的pH值为8.0。
实施例3
一种检测乙肝病毒的试剂盒，包括：脂质体-QD复合物标记的报告探针，磁珠修饰的捕获探针和缓冲液；所述报告探针核酸序列和所述捕获探针核酸序列分别与C型乙肝病毒DNA互补。其制备方法如下：
1、脂质体量子点微球的制备：
长颈烧瓶中加入5mL氯仿，然后加入0.1M二硬脂酰基磷脂酰胆碱100μl、0.1M磷脂-聚乙二醇-羧基36ul、50mM胆固醇22ul，58ul,0.1M发射波长为561nm CdSe量子点，在40℃的温度下混匀。用旋转蒸发仪减压蒸发除去氯仿，当长颈烧瓶的内壁出现薄膜后，用氩气干燥。然后加入2mLPBS(pH7.4)，在30℃下晃动溶解薄膜，溶解后的溶液用0.2μm的聚碳酸酯薄膜滤器过滤3次，得到羧基官能化脂质体-量子点微球，常温保存。
2、脂质体与核酸序列连接(报告探针的形成)：
羧基官能化脂质体-量子点微球溶于PBS缓冲液(pH 7.0)中，使用100mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)偶联剂340ul活化15分钟，轻轻摇动，并加入25mMolN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)340ul反应30分钟，再加入35nmol氨基修饰的B型HBV特异性报告核酸，并与活化的羧基官能化的脂质体–黄红色QD复合物温育2小时，离心后用PBS缓冲液重悬，得到报告探针。所述特异性报告核酸的序列为5’-3’:GCACAGNACCGGTTTTAAGAAAAAAAAAA-Amino Modifier C3。
3、磁珠与核酸序列连接(捕获探针形成)：
羧基官能化的磁珠溶于1ml PBS缓冲液(pH 7.0)中，随后使用100mmol1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的偶联剂340ul活化15分钟，轻轻摇动，并加入25mMol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)340ul再反应30分钟。加入35nmol氨基修饰的B型HBV特异性捕获核酸，并与活化的羧基官能化的磁珠室温孵育2小时，离心后用PBS缓冲液重悬，得到捕获探针。所述特异性捕获核酸的序列为5’-3’:Biotin–AAAAAAAAAACGTCAGGGTTTAGGTRAACGC。
6、制备缓冲液：
所述缓冲液包括以下组分：100mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，3mM MgCl2，所述缓冲液的pH值为8.0。
实施例4
一种检测乙肝病毒的试剂盒，包括：脂质体-QD复合物标记的报告探针，磁珠修饰的捕获探针和缓冲液；所述报告探针核酸序列和所述捕获探针核酸序列分别与D型乙肝病毒DNA互补。其制备方法如下：
1、脂质体量子点微球的制备：
长颈烧瓶中加入5mL氯仿，然后加入0.1M二硬脂酰基磷脂酰胆碱100μl、0.1M磷脂-聚乙二醇-羧基36ul、50mM胆固醇22ul，58ul,0.1M发射波长为647nm CdSe量子点，在40℃的温度下混匀。用旋转蒸发仪减压蒸发除去氯仿，当长颈烧瓶的内壁出现薄膜后，用氩气干燥。然后加入2mLPBS(pH7.4)，在30℃下晃动溶解薄膜，溶解后的溶液用0.2μm的聚碳酸酯薄膜滤器过滤3次，得到羧基官能化脂质体-量子点微球，常温保存。
2、脂质体与核酸序列连接(报告探针的形成)：
羧基官能化脂质体-量子点微球溶于PBS缓冲液(pH 7.0)中，使用100mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)偶联剂140ul活化15分钟，轻轻摇动，并加入25mMolN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)240ul反应30分钟，再加入35nmol氨基修饰的B型HBV特异性报告核酸，并与活化的羧基官能化的脂质体–黄红色QD复合物温育2小时，离心后用PBS缓冲液重悬，得到报告探针。所述特异性报告核酸的序列为5’-3’:GCACAGNACCGGTTTTAAGAAAAAAAAAA-Amino Modifier C3。
3、磁珠与核酸序列连接(捕获探针形成)：
羧基官能化的磁珠溶于1ml PBS缓冲液(pH 7.0)中，随后使用100mmol1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的偶联剂140ul活化15分钟，轻轻摇动，并加入25mMol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)240ul再反应30分钟。加入35nmol氨基修饰的B型HBV特异性捕获核酸，并与活化的羧基官能化的磁珠室温孵育2小时，离心后用PBS缓冲液重悬，得到捕获探针。所述特异性捕获核酸的序列为5’-3’:Biotin–AAAAAAAAAACGTCAGGGTTTAGGTRAACGC。
7、制备缓冲液：
所述缓冲液包括以下组分：100mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，3mM MgCl2，所述缓冲液的pH值为8.0。
实施例5
采用天根试剂盒从hbv阳性患者体内抽取血清，然后提取HBV-DNA，用实施例1试剂盒检测乙肝病毒。检测方法如下：
将24nmol脂质体-QD复合物标记的报告探针、24nmol磁珠修饰的捕获探针与HBVB型靶DNA的存在下在缓冲液中45℃孵育30分钟。报道探针与捕获探针的分子比保持在1:1。杂交后，将具有夹心杂交物的管置于磁力架上1分钟，小心地除去上清液，然后用缓冲液洗涤三次。用荧光显微镜观察脂质体量子点微球的荧光信号，发出荧光信号时，即为B型阳性+，反之则为其他型或阴性-，并用软件计算出荧光信号的强弱。
实施例6
采用天根试剂盒提取HBV-DNA，用实施例3试剂盒检测乙肝病毒。检测方法如下：
将24nmol脂质体-QD复合物标记的报告探针、24nmol磁珠修饰的捕获探针与HBV C型靶DNA的存在下在缓冲液中45℃孵育20分钟。报道探针与捕获探针的分子比保持在1:1。杂交后，将具有夹心杂交物的管置于磁力架上1分钟，小心地除去上清液，然后用缓冲液洗涤三次。用荧光显微镜观察脂质体量子点微球的荧光信号，发出荧光信号时，即为C型阳性+，反之则为其他型或阴性-，并用软件计算出荧光信号的强弱。
实施例7
采用以下公司合成的靶序列对实施例1所述试剂盒的特异性进行检测：乙肝b型特异性靶序列，含有一个错配碱基的b型特异性靶序列，含有两个错配碱基的b型特异性靶序列，含有三个错配碱基的b型特异性靶序列，以及非靶序列，将上述5中靶序列分别稀释成10μmol，用实施例1试剂盒对靶序列进行检测，然后用荧光显微镜进行观察计数，结果图2所示。
由图2可以看出，本发明检测乙肝病毒的试剂盒对b型HBV有很高的特异性，能够很大程度上减少假阳性的出现。
实施例8
将公司合成b型HBV靶序列用dd水稀释成不同倍数用实施例1的试剂盒进行检测。所述b型HBV靶序列分别稀释成10μmol、10nmol、10pmol、10fmol和空白对照组用DD水代替，加入到实施例1试剂盒中的报告探针和捕获探针，在缓冲液中进行杂交，洗脱，然后用荧光显微镜进行观察计数，结果如图3所示。表明本发明实施例1所述乙肝试剂盒的检测极限为10fmol，灵敏度高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种检测乙肝病毒的试剂盒及乙肝病毒的检测方法
<130> GW2017I2484
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcacagnacc ggttttaaga aaaaaaaaa 29
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaaaaaaaa cgtcagggtt taggtraacg c 31
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caacgggcaa acaggagcgg aaaaaaaaaa 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaaaaaaaaa atgaaggtcc ttgtagttgc 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggttccatac aacgggcabg aaaaaaaaaa 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaaaaaaaaa aacaggagat taaggtccna 30

Claims (7)

1.一种检测乙肝病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：脂质体-QD复合物标记的报告探针，磁珠修饰的捕获探针和缓冲液；所述报告探针的核酸序列和所述捕获探针的核酸序列分别与乙肝病毒DNA互补；
所述脂质体-QD复合物为羧基官能化的脂质体量子点微球，所述脂质体-QD复合物的制备方法包括：将二硬脂酰基磷脂酰胆碱、磷脂-聚乙二醇-羧基、胆固醇和CdSe量子点按照摩尔比9～12:2～4:0.8～1.5:4～6.5，在氯仿中混合，用薄膜水化法制备得到脂质体-QD复合物；
所述乙肝病毒为B型、C型或D型乙肝病毒；
当乙肝病毒为B型乙肝病毒时，报告探针的核酸序列为5’-3’:GCACAGNACCGGTTTTAAGAAAAAAAAAA-Amino Modifier C3，捕获探针的核酸序列为5’-3’:Biotin–AAAAAAAAAACGTCAGGGTTTAGGTRAACGC；
当乙肝病毒为C型乙肝病毒时，报告探针的核酸序列为5’-3’:CAACGGGCAAACAGGAGCGGAAAAAAAAAA-Amino Modifier C3，捕获探针的核酸序列为5’-3’Biotin–AAAAAAAAAAATGAAGGTCCTTGTAGTTGC；
当乙肝病毒为D型乙肝病毒时，报告探针的核酸序列为5’-3’GGTTCCATACAACGGGCABGAAAAAAAAAA-Amino Modifier C3，捕获探针的核酸序列为5’-3’Biotin–AAAAAAAAAAAACAGGAGATTAAGGTCCNA。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脂质体-QD复合物标记报告探针的制备方法包括：在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺存在下催化所述脂质体-QD复合物与氨基修饰的报告探针核酸反应，得到脂质体-QD复合物标记的报告探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述脂质体-QD复合物与所述报告探针的摩尔比例为1～1.5:8～10，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与所述脂质体-QD复合物的质量比为5～6:1～1.5，所述N-羟基琥珀酰亚胺与所述脂质体-QD复合物的质量比为2.5～1.5:1～1.5。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁珠修饰捕获探针的制备方法包括：在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺存在下催化羧基官能化的磁珠与氨基修饰的捕获探针核酸反应，得到磁珠修饰的捕获探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述羧基官能化的磁珠与所述捕获探针核酸的摩尔比为1～1.5:8～10，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与所述羧基官能化的磁珠的质量比为5～6:1～1.5，所述N-羟基琥珀酰亚胺与所述羧基官能化的磁珠的质量比为2.5～1.5:1～1.5。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括以下组分：80～100mMTris-HCl，10～20mM(NH4)2SO4，2～10mM MgCl2，所述缓冲液的pH值为8.0。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述CdSe量子点的发射波长为488nm、561nm或647nm。
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