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一种原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料的制备方法，属于医用材料技术领域。所述方法为：将氧化再生纤维素止血材料浸渍到血浆中1~30 min，然后取出沥干；使用蒸馏水配制浓度为5~100mM的氯化钙水溶液；将负载有凝血酶原的氧化再生纤维素止血材料放入氯化钙水溶液中，在20~37℃温度下孵育1~10 h；将孵育后的止血材料在‑10℃~‑20℃预冻10~20 h，预冻完成后在温度为‑56℃~‑20℃、真空度为10~20Pa的条件下，处理20~40 h，得到原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料。本发明的优点是：本发明中止血材料的制备过程无需特殊设备，反应条件温和，易于工业化，具有广阔的应用前景、社会效益和经济价值。

Description

一种原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料的制 备方法
技术领域
本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料的制备方法。
背景技术
止血是个体创伤院前救治和暴发性群体创伤抢救的重要手段。目前，临床上广泛使用的止血材料是美国强生（Johnson&Johnson）公司生产的Surgicel，在国内又称“速即纱”。速即纱的主要成分是氧化再生纤维素，即将纤维素中的C6伯羟基高度选择性氧化成羧基，近而得到一种纤维素衍生物。虽然氧化再生纤维素具有止血、抗菌、促愈以及可完全降解等优异特性，但其止血过程主要依赖于人体自身凝血机制，对于肝素化、低温、血友病以及严重创伤等导致的凝血功能障碍出血情况作用有限。
表面改性是提高氧化再生纤维素止血材料止血性能的常用方法。目前，在一些公开或授权的发明专利中，已经使用有机或无机材料，如藻酸盐（ZL201410280617.3）、壳聚糖（CN201710418865.3）、纳米纤维素（CN201510482719.8）、胶原蛋白（CN201510581018.X）、RGD-M13噬菌体（CN201510953638.1）、单壁碳纳米管（ZL 201410718699.5）、多壁碳纳米管（CN201710418865.3）、纳米金（ZL 201410718663.7）、石墨烯（ZL201410675529.3）、氧化石墨烯（ZL201410718718.4）、富勒烯（ZL 201410718679.8）等，通过共混、复合、浸渍或涂覆的方法来改善氧化再生纤维素的止血性能。虽然上面这些专利能使氧化再生纤维素材料的止血性能得到一定程度的提升，但对于氧化再生纤维素止血材料在凝血功能障碍出血状况中的止血效果则没有显著的改善作用。
凝血酶可作用于生理性凝血级联反应的最后一步，将血液中的纤维蛋白原迅速转变为纤维蛋白连结成网状并沉积，在创伤部位形成富含纤维蛋白的稳定血凝块，达到快速止血的目的。因此，当患者的凝血系统由于肝素化、轻度凝血功能障碍或严重创伤等因素受损时，可使用凝血酶止血材料（剂）进行局部快速止血。Doub等人制备了凝血酶浸渍的碳酸氢钠中和的氧化再生纤维素并用作外科手术止血材料。Saferstein等人首先使用弱酸盐的醇水溶液对氧化再生纤维素进行中和，然后负载类凝血酶用以提高氧化再生纤维素材料的止血性能。虽然已有专利将凝血酶负载于氧化纤维素止血材料表面，但使用的都是经提纯以后的凝血酶，价格高，限制了此类材料的推广。此外，现有方法只是简单浸渍负载凝血酶，负载牢固度较差。
发明内容
本发明的目的是为了解决纯氧化再生纤维素止血材料无法用于凝血功能障碍出血状况以及纯凝血酶成本太高的问题，提供一种原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料的制备方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料的制备方法，所述方法的具体步骤为：
步骤一：将氧化再生纤维素止血材料浸渍到血浆中1~30 min，然后取出沥干，制备出负载有凝血酶原的氧化再生纤维素止血材料，其中，氧化再生纤维素止血材料和血浆的质量比为100：1~5；
步骤二：使用蒸馏水配制浓度为5~100mM的氯化钙水溶液；
步骤三：将步骤一制备的负载有凝血酶原的氧化再生纤维素止血材料放入步骤二制备的氯化钙水溶液中，在20~37℃温度下孵育1~10 h，其中，负载有凝血酶原的氧化再生纤维素止血材料和氯化钙水溶液的质量比是0.5~2:100；
步骤四：将步骤三孵育后的止血材料在-10℃~-20℃预冻10~20 h，预冻完成后在温度为-56℃~-20℃、真空度为10~20Pa的条件下，冷冻干燥20~40 h，得到原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料。
本发明相对于现有技术的有益效果是：
（1）通过Ca2+对凝血酶原的诱导作用在氧化再生纤维素表面原位生成凝血酶，凝血酶可作用于生理性凝血级联反应的最后一步，对凝血功能障碍出血状况同样有效，因此，原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料弥补了纯氧化再生纤维素止血材料不适用于凝血功能障碍出血状况的缺陷。
（2）由于原位生成的凝血酶是由血浆中的凝血酶原转变而来，因此其还被血浆中的其它组分如血浆蛋白、无机盐、脂类、非蛋白含氮化合物等包裹，起到物理“牢笼”效应，因此比简单浸渍负载的凝血酶牢固度更高，稳定性更好。
（3）本发明制备的原位诱导负载凝血酶氧化再生纤维素止血材料含有羧基、凝血酶、Ca2+以及血浆中的纤维蛋白等各种凝血因素，具有多重止血性能，可使止血时间大大缩短，进一步提高氧化再生纤维素的快速止血效果，可将止血时间降低18.7～31.1%。
（4）通过原位诱导直接在氧化再生纤维素表面生成凝血酶，无需使用昂贵的纯化凝血酶及其类似物，大大降低了凝血酶的使用成本，有望解决凝血酶价格高的问题。
（5）本发明中止血材料的制备过程无需特殊设备，反应条件温和，易于工业化，具有广阔的应用前景、社会效益和经济价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
具体实施方式一：本实施方式记载的是一种原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料的制备方法，所述方法的具体步骤为：
步骤一：将氧化再生纤维素止血材料浸渍到血浆中1~30 min，然后取出沥干，制备出负载有凝血酶原的氧化再生纤维素止血材料，其中，氧化再生纤维素止血材料和血浆的质量比为100：1~5；
步骤二：使用蒸馏水配制浓度为5~100mM的氯化钙水溶液；
步骤三：将步骤一制备的负载有凝血酶原的氧化再生纤维素止血材料放入步骤二制备的氯化钙水溶液中，在20~37℃温度下孵育1~10 h，其中，负载有凝血酶原的氧化再生纤维素止血材料和氯化钙水溶液的质量比是0.5~2:100；
步骤四：将步骤三孵育后的止血材料在-10℃~-20℃预冻10~20 h，预冻完成后在温度为-56℃~-20℃、真空度为10~20Pa的条件下，冷冻干燥20~40 h，得到原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料。
具体实施方式二：具体实施方式一所述的一种原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料的制备方法，步骤一中，所述的氧化再生纤维素是以短丝、长丝或织物形式存在。
具体实施方式三：具体实施方式一所述的一种原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料的制备方法，步骤一中，所述的血浆为健康人血浆或动物血浆；所述的动物血浆为猪血浆、牛血浆、羊血浆或兔血浆。
具体实施方式四：具体实施方式一所述的一种原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料的制备方法，步骤一中，所述的浸渍时间为10min。
具体实施方式五：具体实施方式一所述的一种原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料的制备方法，步骤二中，所述的氯化钙水溶液的浓度为10mM。
具体实施方式六：具体实施方式一所述的一种原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料的制备方法，步骤三中，所述的孵育温度为28℃，孵育时间为3 h。
本发明的原理是血浆中的凝血酶原吸附在氧化再生纤维素止血材料的表面，然后在Ca2+的诱导作用下原位生成凝血酶，得到原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料。
实施例1：
一种原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料的制备方法按照以下步骤进行：
（1）将2g的氧化再生纤维素止血材料浸渍到20mg的牛血浆中2分钟，然后取出沥干。
（2）使用蒸馏水配制浓度为5mM的氯化钙水溶液。
（3）将步骤（1）制备的负载有凝血酶原的氧化再生纤维素止血材料放入步骤（2）制备的氯化钙水溶液中，25℃下孵育2小时。
（4）向步骤（3）原位生成负载凝血酶的氧化再生纤维素止血材料在-10℃~-20℃预冻10~20 h，预冻完成后在温度为-56℃~-20℃、真空度为10~20Pa的条件下，处理20~40h，得到成型的原位生成负载凝血酶的氧化再生纤维素止血材料，即产品C。
实施例2：本实施例与实施例1不同之处在于：步骤一中，氧化再生纤维素止血材料的用量为1g，最终得到成型的原位生成负载凝血酶的氧化再生纤维素止血材料，即产品B。
实施例3：
步骤一：将1g氧化再生纤维素止血材料浸渍到50g健康成人来源血浆中5 min，然后取出沥干，制备出负载有凝血酶原的氧化再生纤维素止血材料；
步骤二：使用蒸馏水配制浓度为5 mM的氯化钙水溶液；
步骤三：将步骤一制备的1g负载有凝血酶原的氧化再生纤维素止血材料放入步骤二制备的100g氯化钙水溶液中，在30℃温度下孵育2 h；
步骤四：将步骤三孵育后的止血材料在-10℃~-20℃预冻10~20 h，预冻完成后在温度为-56℃~-20℃、真空度为10~20Pa的条件下，冷冻干燥20~40 h，得到原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料，即产品A。
本发明止血效果的评价：
选取体重2.5 kg~3.2 kg的新西兰兔分为若干组，每组10只，按30 mg/kg剂量静脉缓慢注射戊巴比妥钠溶液麻醉，根据GB/T 16886.2-2011规定饲养和管理动物。
正常动物创伤模型实验
待兔麻醉后，分离腹腔动脉，然后分别用大三角皮针在腹腔动脉上针刺10秒钟，将实施例1制备的止血材料和对照样品（纯氧化再生纤维素）敷在创口表面并使用推拉力计施加3N的压力，每隔10s观察止血情况，直至最终完全止血后记录止血时间，取6组平均值为最终结果。
肝素化动物创伤模型实验
按1 mg/kg剂量经耳缘静脉注入肝素，使实验动物肝素化。待兔麻醉后，分离腹腔动脉，然后分别用大三角皮针在腹腔动脉上针刺10秒钟，将实施例样品和对照样品（纯氧化再生纤维素）敷在创口表面并使用推拉力计施加3N的压力，每隔10 s观察止血情况，直至最终完全止血后记录止血时间，取6组平均值为最终结果。
表1不同材料在不同止血模型中的平均止血时间和平均出血量
由表1试验结果证明，本发明制备的原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料的止血时间比氧化再生纤维素止血材料在正常动物创伤模型和肝素化动物创伤模型中分别至少快18.7%和20%，证明原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料具有更优异的止血性能，能使止血时间大大缩短，达到快速止血的效果。

Claims (6)

1.一种原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料的制备方法，其特征在于：所述方法的具体步骤为：
步骤一：将氧化再生纤维素止血材料浸渍到血浆中1~30 min，然后取出沥干，制备出负载有凝血酶原的氧化再生纤维素止血材料，其中，氧化再生纤维素止血材料和血浆的质量比为100：1~5；
步骤二：使用蒸馏水配制浓度为5~100mM的氯化钙水溶液；
步骤三：将步骤一制备的负载有凝血酶原的氧化再生纤维素止血材料放入步骤二制备的氯化钙水溶液中，在20~37℃温度下孵育1~10 h，其中，负载有凝血酶原的氧化再生纤维素止血材料和氯化钙水溶液的质量比是0.5~2:100；
步骤四：将步骤三孵育后的止血材料在-10℃~-20℃预冻10~20 h，预冻完成后在温度为-56℃~-20℃、真空度为10~20Pa的条件下，冷冻干燥20~40 h，得到原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料。
2.根据权利要求1所述的一种原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料的制备方法，其特征在于：步骤一中，所述的氧化再生纤维素是以短丝、长丝或织物形式存在。
3.根据权利要求1所述的一种原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料的制备方法，其特征在于：步骤一中，所述的血浆为健康人血浆或动物血浆；所述的动物血浆为猪血浆、牛血浆、羊血浆或兔血浆。
4.根据权利要求1所述的一种原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料的制备方法，其特征在于：步骤一中，所述的浸渍时间为10min。
5.根据权利要求1所述的一种原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料的制备方法，其特征在于：步骤二中，所述的氯化钙水溶液的浓度为10mM。
6.根据权利要求1所述的一种原位诱导生成凝血酶负载氧化再生纤维素止血材料的制备方法，其特征在于：步骤三中，所述的孵育温度为28℃，孵育时间为3 h。
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