CN108374040A - 转基因水稻pa110-15品系特异性的lamp检测方法 - Google Patents

转基因水稻pa110-15品系特异性的lamp检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108374040A
CN108374040A CN201810349209.7A CN201810349209A CN108374040A CN 108374040 A CN108374040 A CN 108374040A CN 201810349209 A CN201810349209 A CN 201810349209A CN 108374040 A CN108374040 A CN 108374040A
Authority
CN
China
Prior art keywords
paddy rice
transgenic paddy
lamp
primer
detection method
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810349209.7A
Other languages
English (en)
Inventor
张大兵
石建新
李�荣
王亚楠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Jiaotong University
Original Assignee
Shanghai Jiaotong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Jiaotong University filed Critical Shanghai Jiaotong University
Publication of CN108374040A publication Critical patent/CN108374040A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种转基因水稻PA110‑15品系特异性的LAMP检测方法，包括以下步骤：A、设计合成引物；B、配置LAMP反应体系；C、将待检测转基因水稻PA110‑15的DNA稀释液加入反应体系中，进行LAMP反应，所得扩增产物进行凝胶电泳即可。本发明的方法具有快速、高效、灵敏、准确、方便等优点，满足田间实时快速和日常实验室准确监测转基因水稻PA110‑15的要求。

Description

转基因水稻PA110-15品系特异性的LAMP检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因植物品系的检测方法，具体涉及LAMP检测转基因水稻PA110-15品系特异性的引物和方法，尤其涉及一种转基因水稻PA110-15品系特异性的LAMP检测方法。
背景技术
随着农业转基因生物技术的快速发展，全球转基因作物的种植面积迅猛增加。截至2016年，有26个国家种植了1.815亿公顷的转基因作物。我国一直大力投入转基因作物研发，目前转基因棉花和转基因番木瓜已商业化，转植酸酶玉米和转基因抗虫水稻也获得了安全证书，一大批转基因作物正处于申报安全证书的评价过程中。转基因作物在解决粮食危机的同时，也带来了人们对食品安全和环境安全的担忧。许多国家和地区纷纷开始实施转基因标签制度，对转基因产品实施限量标识和进口，目前国际上对于转基因标识管理主要分为4类：一是自愿标识，如美国对转基因食品标识与否和如何标识联邦均不作强制性规定(致敏性除外)；二是定量全面强制标识，即对所有产品只要其转基因成分含量超过阈值就必须标识，如欧盟规定转基因成分超过0.9％、巴西规定转基因成分超过1％必须标识；三是定量部分强制性标识，即对特定类别产品只要其转基因成分含量超过阈值就必须标识，如日本规定对豆腐、玉米小食品、纳豆等24种由大豆或玉米制成的食品进行转基因标识，设定阈值为5％；四是定性按目录强制标识，即凡是列入目录的产品，只要含有转基因成分或者是由转基因作物加工而成的，必须标识。我国属于第四种。我国政府高度重视转基因生物的安全管理，颁布实施了《农业转基因生物安全管理条例》及其配套管理办法，且采用强制性标识方法，只要含有转基因成分就必须标识。因此建立高效、准确的转基因成分的检测方法是转基因生物安全监管得以顺利开展和实施的关键。
常用的转基因作物检测方法有定性PCR、复合PCR、实时荧光定量PCR、试纸条等。但在检测速度、成本、操作性上都具有不同程度上的缺陷。环状等温扩增技术是2000年由日本科学家Notomi等建立的一种新型核酸等温扩增技术，具有简便、高效、特异、快速等优点，虽然目前已广泛应用与病原微生物和转基因作物的分子检测中，但在转基因特异品系检测上的应用研究还很少。
PA110-15是以两系温敏不育系培矮64S(PA64S)为受体，通过农杆菌介导获得的转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻，目前尚未获得我国农业部颁发的安全证书。目前已经很多关于PA110-15材料的检测方法。专利CN201410081539公开了转基因水稻PA110-15转化体特异性PCR检测引物及定性检测方法和试剂盒；专利CN201410081893公开了转基因水稻PA110-15外源插入片段旁侧序列及应用；专利CN201510685106公开了转基因水稻PA110-15品系特异性5’端定量PCR检测引物；专利201510685126公开了转基因水稻PA110-15转化体特异性定量PCR检测引物；专利201510685232公开了转基因水稻PA110-15外源基因纯合杂合状态的PCR检测引物。这些研究全部采用普通PCR法和荧光PCR法，目前尚未发现将LAMP应用于转基因水稻PA110-15品系特异性检测的引物和方法。
因此有必要建立一种新型LAMP法对转基因水稻PA110-15品系特异性的检测技术。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供一种转基因水稻PA110-15品系特异性的LAMP检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种转基因水稻PA110-15品系特异性的LAMP检测方法，包括以下步骤：
A、设计合成引物；
B、配置LAMP反应体系；
C、将待检测转基因水稻PA110-15的DNA稀释液加入反应体系中，进行LAMP反应，所得扩增产物进行凝胶电泳即可。
优选地，步骤A中，所述引物包括内引物FIP、内引物BIP、外引物F3和外引物B3；所述引物的碱基序列如SEQ ID No：1～4所示。
优选地，步骤B中，所述PCR反应体系以23μL总体积计，包括以下体积含量的各组分(其中FIP/BIP和F3/B3引物的浓度是核酸扩增常用的引物浓度，它们在反应体系里的体积是最优化的选择，体积过多或过低均影响LAMP扩增结果)：
优选地，步骤C中，所述待检测转基因水稻PA110-15的DNA稀释液与LAMP反应体系的体积比为2:23。
优选地，步骤C中，所述待检测转基因水稻PA110-15的DNA稀释液的浓度为10-20ng/μL。
优选地，步骤C中，所述LAMP反应的条件为：65℃扩增反应1h，1个循环；80℃使酶失活5min、4℃降温5min，1个循环。
优选地，步骤C中，所述凝胶电泳具体采用2％琼脂糖凝胶电泳，200V下进行25min。
本发明还提供了一种用于检测转基因水稻PA110-15品系的LAMP引物组合物，包括内引物FIP、内引物BIP、外引物F3和外引物B3；所述引物的碱基序列如SEQ ID No：1～4所示。
本发明还提供了一种前述的LAMP引物组合物在检测转基因水稻PA110-15品系中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明建立的LAMP方法具有良好的特异性，适于转基因水稻PA110-15品系特异性检测，其灵敏度极高，达到了10拷贝。本发明的方法具有快速、高效、灵敏、准确、方便等优点，满足田间实时快速和日常实验室准确监测转基因水稻PA110-15的要求。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1是本发明LAMP检测的特异性实验结果图；图中，泳道M，DL2000DNA marker；泳道1，转基因水稻PA110-15；泳道2，转基因水稻T2A-1；泳道3，转基因水稻TT51；泳道4，转基因玉米Bt11；泳道5，转基因玉米MIR604；泳道6，转基因棉花MON88913；泳道7，转基因棉花MON1445；泳道8，转基因大豆A5547-127；泳道9，转基因油菜MS1；泳道NTC，空白对照；
图2是本发明LAMP检测的灵敏度实验结果；图中，泳道M，DL2000DNAmarker；泳道1，10000拷贝；泳道2，1000拷贝；泳道3，100拷贝；泳道4，10拷贝；泳道5，5拷贝；泳道6，空白对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照仪器或者试剂制造厂商所建议的条件。
实施例1：LAMP方法的特异性检测
1、合成具有以下核苷酸序列的引物，本实施例引物及荧光探针的浓度都为10μmol/L。
以上引物的核苷酸序列是针对转基因水稻PA110-15及产品的品系特异性某特定位点，即外源基因与水稻基因组DNA的整合位点设计，通过该设计就可以精确检测转基因水稻PA110-15的转化事件；
2、提取9种不同的作物的DNA，即2种转基因水稻(PA110-15和TT51)、2种转基因玉米(Bt11和MIR604)、2种转基因棉花(MON88913和MON1445)、1种转基因大豆(A5547-127)、1种转基因油菜(MS1)和1种非转基因水稻(明恢63)。采用常规的DNA提取手段，并将其稀释至10ng/μL。
3、配制反应体系：即将2μL的DNA稀释液加入到23μL反应体系中，所述2μL的反应体系包括以下组分：
反应体系中MgSO4、Thermol Buffer缓冲液和Bst DNA聚合酶均购自美国纽英伦生物技术公司；dNTPs购自上海申能博彩公司。
4、LAMP特异性检测
根据上述LAMP反应体系，将9种不同的作物，即2种转基因水稻(PA110-15和TT51)、2种转基因玉米(Bt11和MIR604)、2种转基因棉花(MON88913和MON1445)、1种转基因大豆(A5547-127)、1种转基因油菜(MS1)和1种非转基因水稻(明恢63)在以下LAMP反应的条件下对产物进行扩增。用ddH2O设置空白对照。
LAMP反应条件：65℃扩增反应1h，1个循环；80℃使酶失活5min、4℃降温5min，1个循环。本实施例中采用的是ABI Veriti 96Well定性PCR扩增仪(美国应用生物系统公司)。
在本实施例中，邀请3位人员参与协同实验验证。每位人员均重复三次实验，每个实验设置三个重复。并要求他们均用ddH2O设置空白对照。
5、观察实验结果
将扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，200V，25min。2％琼脂糖凝胶电泳出梯状条带的为转基因水稻PA110-15的样品，无条带的为其他样品或空白对照。本实例中采用的是DY-501型核酸电泳仪(上海精密科学仪器有限公司)，UVP Biodoc-It 220凝胶成像一体机(美国Spring公司)。
从图1可知，只有转基因水稻PA110-15的泳道出现梯状条带，其他物种以及空白对照均无条带，而三个协同实验的验证结果均与本实验一致，说明建立的LAMP方法具有良好的特异性，可用于转基因水稻PA110-15品系特异性检测。
实施例2：LAMP方法的灵敏度检测
1、引物合成、转基因水稻PA110-15的DNA提取见实例1。
2、制备转基因水稻PA110-15模板稀释梯度
先通过网站http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html将DNA浓度(ng/μL)转化成拷贝数，再将转基因水稻PA110-15的DNA模板用ddH2O依次稀释至10000拷贝、1000拷贝、100拷贝、10拷贝、5拷贝。
3、将上述5个浓度梯度进行LAMP扩增，并用ddH2O设置空白对照。配置LAMP体系、LAMP反应条件见实例1。
在本实施例中，邀请3位人员参与协同实验验证。每位人员均重复三次实验，每个实验设置三个重复。并要求他们均用ddH2O设置空白对照。
4、观察实验结果
将扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，200V，25min。2％琼脂糖凝胶电泳出现梯状条带对应的最低拷贝数就是LOD值。
图2显示，泳道1是10000拷贝，泳道2是1000拷贝，泳道3是100拷贝，泳道4是10拷贝，泳道5是5拷贝，泳道6是空白对照。结果显示除了5拷贝、空白对照没有条带外，其他泳道均出现梯状条带，而协同实验的结果与本实验均一致。说明本实验建立的LAMP方法的灵敏度极高，达到了10拷贝。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 转基因水稻PA110-15品系特异性的LAMP检测方法
<130> DAG35749
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaatggcgaa tgctagagca gaatcatata tgatgggctg ga 42
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgggcctct tcgctattac ccaacttaat cgccttgca 39
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctgtacata tatatatgga tgca 24
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggaaaaccct ggcgttac 18

Claims (9)

1.一种转基因水稻PA110-15品系特异性的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、设计合成引物；
B、配置LAMP反应体系；
C、将待检测转基因水稻PA110-15的DNA稀释液加入反应体系中，进行LAMP反应，所得扩增产物进行凝胶电泳即可。
2.根据权利要求1所述的转基因水稻PA110-15品系特异性的LAMP检测方法，其特征在于，步骤A中，所述引物包括内引物FIP、内引物BIP、外引物F3和外引物B3；所述引物的碱基序列如SEQ ID No：1～4所示。
3.根据权利要求1所述的转基因水稻PA110-15品系特异性的LAMP检测方法，其特征在于，步骤B中，所述LAMP反应体系以23μL总体积计，包括以下体积含量的各组分：
4.根据权利要求1所述的转基因水稻PA110-15品系特异性的LAMP检测方法，其特征在于，步骤C中，所述待检测转基因水稻PA110-15的DNA稀释液与LAMP反应体系的体积比为2:23。
5.根据权利要求1或4所述的转基因水稻PA110-15品系特异性的LAMP检测方法，其特征在于，步骤C中，所述待检测转基因水稻PA110-15的DNA稀释液的浓度为10-20ng/μL。
6.根据权利要求1或4所述的转基因水稻PA110-15品系特异性的LAMP检测方法，其特征在于，步骤C中，所述LAMP反应的条件为：65℃扩增反应1h，1个循环；80℃使酶失活5min、4℃降温5min，1个循环。
7.根据权利要求1或4所述的转基因水稻PA110-15品系特异性的LAMP检测方法，其特征在于，步骤C中，所述凝胶电泳具体采用2％琼脂糖凝胶电泳，200V下进行25min。
8.一种用于检测转基因水稻PA110-15品系的LAMP引物组合物，其特征在于，包括内引物FIP、内引物BIP、外引物F3和外引物B3；所述引物的碱基序列如SEQ ID No：1～4所示。
9.一种根据权利要求8所述的LAMP引物组合物在检测转基因水稻PA110-15品系中的应用。
CN201810349209.7A 2018-04-04 2018-04-18 转基因水稻pa110-15品系特异性的lamp检测方法 Pending CN108374040A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810302084 2018-04-04
CN2018103020842 2018-04-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108374040A true CN108374040A (zh) 2018-08-07

Family

ID=63032530

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810349209.7A Pending CN108374040A (zh) 2018-04-04 2018-04-18 转基因水稻pa110-15品系特异性的lamp检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108374040A (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105154572A (zh) * 2015-10-20 2015-12-16 中国农业科学院生物技术研究所 转基因水稻pa110-15品系特异性5’端定量pcr检测引物

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105154572A (zh) * 2015-10-20 2015-12-16 中国农业科学院生物技术研究所 转基因水稻pa110-15品系特异性5’端定量pcr检测引物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘佳: "转Bt基因稻米加工品的LAMP检测方法的建立", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101775440A (zh) 一种转基因大豆检测用质粒标准分子及其构建方法
Andrea et al. Development of a simple and cost-effective bead-milling method for DNA extraction from fish muscles
CN106350588A (zh) 基于lamp快速检测抗苯并咪唑类杀菌剂的灰霉病菌的方法
CN101906466B (zh) 瓜类主要病原菌的多重pcr检测试剂盒及其检测方法
CN110423827A (zh) 一种基于pcsB基因的无乳链球菌环介导等温扩增现场快检技术
Dolatabadi et al. Rapid screening for human‐pathogenic Mucorales using rolling circle amplification
Reddy et al. Development of specific markers for identification of Indian isolates of Fusarium oxysporum f. sp. ricini
Rizzo et al. A duplex real-time PCR with probe for simultaneous detection of Geosmithia morbida and its vector Pityophthorus juglandis
CN103276061B (zh) 一种检测布鲁菌的lamp核酸试纸条试剂盒及其应用
Niessen et al. Development and application of loop-mediated Isothermal amplification (LAMP) assays for rapid diagnosis of the bat white-nose disease fungus Pseudogymnoascus destructans
CN109897910A (zh) 一种基于rpa-侧流层析试纸条技术快速精准检测尖镰孢菌的方法
CN108315473A (zh) 一种用于水稻稻曲病病菌lamp快速检测的引物组合物及其应用
CN107881254A (zh) 环介导恒温扩增法检测苎麻疫霉菌的引物及其检测方法
Horn et al. Development of a multiplex Q-PCR to detect Trichoderma harzianum Rifai strain T22 in plant roots
CN102134602A (zh) 转Xa21基因水稻或其制品检测用引物和探针、试剂盒及方法
CN101831508B (zh) 一种茶尺蠖核型多角体病毒的定量检测方法
CN110878373A (zh) 一种致病疫霉菌的重组酶聚合酶扩增检测试剂盒及其应用
CN108374040A (zh) 转基因水稻pa110-15品系特异性的lamp检测方法
CN103146824A (zh) 一种用于转基因水稻pcr检测的重组标准质粒及试剂盒
CN112176080B (zh) 特异性检测剑麻紫色卷叶病植原体的巢式pcr引物组、试剂盒及检测方法
Taha et al. Species identification of dermatophytes isolated from human superficial fungal infections by conventional and molecular methods
CN101016554A (zh) 转基因油菜Rf3事件外源插入载体旁侧序列及其应用
CN108315487B (zh) 一种检测鳗鲡疱疹病毒的引物组、试剂盒及其应用
Ren et al. A Portable Nucleic Acid Sensor Based on PCR for Simple, Rapid, and Sensitive Testing of Botrytis cinerea in Ginseng
Xue et al. Application of real-time scorpion PCR for authentication and quantification of the traditional Chinese medicinal plant Drynaria fortunei

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180807