CN108367072A - 含抗-pd-1抗体avelumab的水性药物制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新型抗‑PD‑L1抗体制剂。具体而言，本发明涉及抗‑PD‑L1抗体Avelumab的水性药物制剂。

Description

含抗-PD-1抗体AVELUMAB的水性药物制剂

本发明涉及新型抗-PD-L1抗体制剂。具体而言，本发明涉及抗-PD-L1抗体Avelumab的水性药物制剂。

发明背景

程序性死亡1(PD-1)受体和PD-1配体1和2(PD-L1、PD-L2)在免疫调节中发挥不可或缺的作用。PD-1在活化的T细胞上表达，被PD-L1和PD-L2激活，它们由基质细胞、肿瘤细胞或两者表达，引发T细胞死亡和局部免疫抑制(Dong H,Zhu G,Tamada K,Chen L.B7-H1,athird member of the B7 family,co-stimulates T-cell proliferation andinterleukin-10 secretion.Nat Med 1999；5:1365-69；Freeman GJ,Long AJ,Iwai Y,etal.Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 familymember leads to negative regulation of lymphocyte activation.J Exp Med 2000；192:1027-34；Dong H,Strome SE,Salomao DR,et al.Tumor-associated B7-H1 promotesT-cell apoptosis:a potential mechanism of immune evasion.Nat Med 2002；8:793-800.[Erratum,Nat Med 2002；8:1039；Topalian SL,Drake CG,Pardoll DM.Targetingthe PD-1/B7-H1(PD-L1)pathway to activate anti-tumor immunity.Curr OpinImmunol 2012；24:207-12)，潜在地为肿瘤发展和生长提供免疫耐受性环境。相反地，抑制这种相互作用可增强局部T细胞应答，并介导非临床动物模型中的抗肿瘤活性(Dong H,Strome SE,Salomao DR,et al.Nat Med 2002；8:793-800.[Erratum,Nat Med 2002；8:1039；Iwai Y,Ishida M,Tanaka Y,et al.Involvement of PD-L1 on tumor cells inthe escape from host immune system and tumor immunotherapy by PD-L1blockade.Proc Natl Acad Sci USA 2002；99:12293-97)。在临床背景中，用阻断PD-1—PD-L1相互作用的抗体进行治疗已经报道在患有晚期或转移性实体瘤的患者中产生7％至38％的客观应答率，并具有可接受的安全性谱(tolerable safety profile)(Hamid O,Robert C,Daud A,et al.Safety and tumor responses with lambrolizumab(Anti-PD-1)in melanoma.N Engl J Med 2013；369:134-44；Brahmer JR,Tykodi SS,Chow LQ,etal.Safety and activity of anti-PD-L1 antibody in patients with advancedcancer.N Engl J Med 2012；366(26):2455-65；Topalian SL,Hodi FS,Brahmer JR,etal.Safety,activity,and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer.NEngl J Med 2012；366(26):2443-54；Herbst RS,Soria J-C,Kowanetz M,etal.Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A incancer patients.Nature 2014；515:563-67)。值得注意的是，应答时间看上去延长了——对于大多数患者持续时间为1年或更长。

Avelumab(也称为MSB0010718C)是免疫球蛋白(Ig)G1同种型的完全的人类单克隆抗体。Avelumab选择性地与PD-L1结合，并竞争性地阻断PD-L1与PD-1的相互作用。

与靶向T细胞的抗-PD-1抗体相比，Avelumab靶向肿瘤细胞，并因此预计具有较少的副作用，包括自身免疫相关的安全性问题的风险较低，因为PD-L1的阻断完整地保留了PD-L2—PD-1途径以促进外周自身耐受(Latchman Y,Wood CR,Chernova T,et al.PD-L1is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation.Nat Immunol 2001；2(3):261-68)。

在临床上，目前正在许多癌症类型上测试Avelumab，包括非小细胞肺癌、尿路上皮癌、间皮瘤、默克尔细胞癌、胃癌或胃食管交界癌(gastroesophageal junction cancer)、卵巢癌和乳腺癌。

在WO2013079174中公开了Avelumab的氨基酸序列以及其序列变体和其抗原结合片段，其中具有Avelumab氨基酸序列的抗体被称为A09-246-2。公开的还有制备方法和一些医疗用途。

Avelumab的更多医疗用途在WO2016137985、PCT/lB2016/052748、PCT/US2016/037498、PCT/US2016/053939、U.S.专利申请号62/341,921中也有描述。

WO2013079174也在2.4节中描述了一种抗体的人用水性制剂，其具有Avelumab的氨基酸序列。该制剂包含浓度为10mg/ml的抗体，作为抗氧化剂的甲硫氨酸以及具有5.5的pH。

在WO2015048520中描述了IgG1型非糖基化抗-PD-L1抗体的制剂研究，其中为临床研究选择了pH为5.8的制剂。

发明描述

由于Avelumab通常通过静脉注射递送给患者，并因此以水性形式提供，本发明涉及更多的水性制剂，其适合用于稳定WO2013079174中所公布的具有翻译后修饰的、且浓度较高的Avelumab。

图1a(SEQ ID NO:1)展示的是由用作宿主生物体的CHO细胞所表达的Avelumab的全长重链序列。

然而经常观察到，在抗体生产过程中，重链的C-末端的赖氨酸(K)被切割掉。位于Fc部分，此修饰对抗体-抗原结合没有影响。因此，在一些实施方案中，Avelumab的重链序列的C-末端赖氨酸(K)是不存在的。在图1b(SEQ ID NO:2)中展示的是没有C-末端赖氨酸的Avelumab的重链序列。

图2(SEQ ID NO:3)展示的是Avelumab的全长轻链序列。

高度相关性的翻译后修饰是糖基化。

大多数可溶性和膜结合蛋白会进行糖基化，它们是在真核细胞的内质网中产生的，其中称为糖基转移酶的酶将一个或多个糖单元连接到蛋白质的特定糖基化位点。最常见的是，连接点是NH₂或OH基团，导致N-连接或O-连接的糖基化。

这也适用于在真核宿主细胞中重组产生的蛋白质，例如抗体。重组IgG抗体在Fc区CH2结构域中的特定天冬酰胺残基处含有保守的N-连接糖基化位点。抗体的N-连接糖基化存在许多已知的物理功能，例如影响其溶解性和稳定性、蛋白酶抗性、与Fc受体的结合、细胞转运和体内循环半衰期(Hamm M.等人，Pharmaceuticals 2013，6，393-406)。IgG抗体N-聚糖结构主要是双触角复合型结构，其包含b-D-N-乙酰葡糖胺(GlcNac)、甘露糖(Man)且常含有半乳糖(Gal)和岩藻糖(Fuc)单元。

在Avelumab中，单个糖基化位点是Asn300，位于两条重链的CH2结构域中。糖基化的细节在实施例1中描述。

由于糖基化影响抗体的溶解性和稳定性，因此当要开发抗体的稳定的、药学上合适的制剂时，要慎重考虑此参数。

令人惊讶的是，本专利申请的发明人已经发现，对于以其氨基酸序列及其翻译后修饰充分表征的Avelumab，可以在不存在抗氧化剂且在pH值低至5.2的情况下使其在多种水性制剂中保持稳定。

附图

图1a：Avelumab的重链序列(SEQ ID NO:1)

图1b：缺少C-末端K的Avelumab的重链序列(SEQ ID NO:2)

图2：Avelumab的轻链序列(SEQ ID NO:3)

图3：Avelumab的二级结构

图4：Avelumab聚糖的2AB HILIC-UPLC色谱图

图5：图4的峰值编号

图6：DoE2制剂的SE-HPLC的总聚集物(40℃)

图7：DoE2制剂的SE-HPLC的总聚集物(25℃)

图8：DoE2制剂通过生物分析仪的片段(40℃)

图9：DoE2制剂通过生物分析仪的片段(25℃)

图10：DoE2的酸性簇和主峰丰度(25℃)

图11：2-8℃下长期稳定性，LMW(％)

图12：2-8℃下长期稳定性，≥10μm的亚可见颗粒

图13：2-8℃下长期稳定性，≥25μm的亚可见颗粒

图14：2-8℃下长期稳定性，酸性簇(％)

图15：2-8℃下长期稳定性，主峰(％)

图16：2-8℃下长期稳定性，碱性簇(％)

图17：25℃下长期稳定性，LMW(％)

图18：25℃下长期稳定性，≥10μm的亚可见颗粒

图19：25℃下长期稳定性亚，≥25μm的可见颗粒

图20：25℃下长期稳定性，酸性簇(％)

图21：25℃下长期稳定性，主峰(％)

图22：25℃下长期稳定性，碱性簇(％)

图23：40℃下长期稳定性，LMW(％)

图24：40℃下长期稳定性，≥10μm的亚可见颗粒

图25：40℃下长期稳定性，≥25μm的亚可见颗粒

图26：40℃下长期稳定性，酸性簇(％)

图27：40℃下长期稳定性，主峰(％)

图28：40℃下长期稳定性，碱性簇(％)

定义

除非另有说明，否则说明书和权利要求书中使用的以下术语，具有以下列出的含义。

本文提到的“Avelumab”包括IgG1型的抗-PD-L1抗体，如WO2013079174中通过其氨基酸序列所定义的，并且如本专利申请中，通过其氨基酸序列和其翻译后修饰所定义的。本文提到的“Avelumab”可包括生物类似物，其例如可与WO2013079174中公开的氨基酸序列具有至少75％，合适地至少80％、合适地至少85％、合适地至少90％、合适地至少95％、合适地至少96％、合适地至少97％、合适地至少98％，或最合适地至少99％的氨基酸序列同一性。替代地或另外地，在本文中提及的“Avelumab”可包括生物类似物，其与本文中公开的翻译后修饰不同，特别是糖基化模式不同。

“生物类似物”这一术语(也称为后续生物制品)在本领域中是众所周知的，并且本领域技术人员很容易理解何时药物会被视为Avelumab的生物类似物。“生物类似物”这一术语通常用于描述之前已经正式授予上市许可的“创新者生物制药产品”(“生物制品”，其药物物质通过活生物体制备，或源自活生物体，或通过重组DNA，或受控基因表达方法制备)的后续版本(通常来自不同来源)。由于生物制品具有高度的分子复杂性，并且通常对制造过程中的变化敏感(例如，如果在其生产中使用不同的细胞系)，并且由于后续仿制者通常无法获得发明者的分子克隆、细胞库、关于发酵和纯化过程的专有技术，也无法获得活性药物物质本身(仅限创新者的商业化药物产品)，任何“生物类似物”不太可能与创新药物产品完全相同。本文中，术语“缓冲液”或“缓冲溶液”是指通常水性的溶液，其包含酸(通常为弱酸，例如乙酸、柠檬酸、咪唑盐(imidazolium)形式的组氨酸)及其共轭碱(例如乙酸盐或柠檬酸盐，如乙酸钠、柠檬酸钠或组氨酸)的混合物或者碱(通常为弱碱，例如组氨酸)与其共轭酸(例如质子化的组氨酸盐)的混合物。由于“缓冲剂”赋予的“缓冲作用”，加入少量强酸或碱时，“缓冲溶液”的pH值只会轻微改变。

本文中，“缓冲系统”包括一种或多种缓冲剂和/或其酸/碱共轭物，并且更合适地包括一种或多种缓冲剂和其酸/碱共轭物，并且最合适地仅包括一种缓冲剂和其酸/碱共轭物。除非另有说明，本文关于“缓冲系统”(即缓冲液浓度)规定的任何浓度合适地指缓冲剂和/或其酸/碱共轭物的组合浓度。换言之，本文关于“缓冲系统”所规定的浓度适当地指所有相关缓冲物质(buffering species)(即彼此处于动态平衡状态的物质，例如柠檬酸盐/柠檬酸)的组合浓度。因此，给定浓度的组氨酸缓冲系统通常涉及组氨酸和咪唑盐形式的组氨酸的组合浓度。然而，针对组氨酸，通过参照组氨酸或其盐的加入量计算这种浓度通常是简单的。包含相关缓冲系统的组合物的总体pH，通常反映了每种相关缓冲物质(即缓冲剂与其酸/碱共轭物的平衡)的平衡浓度。

本文中，术语“缓冲剂”是指缓冲液或缓冲溶液的酸或碱组分(通常为弱酸或弱碱)。缓冲剂有助于将给定溶液的pH维持在预定值或接近预定值，并且通常选择缓冲剂以完善其预定值。合适地，缓冲剂是单一化合物，其产生期望的缓冲效果，尤其是当所述缓冲剂与适当量的(取决于预定的期望的pH)其相应的“酸/碱共轭物”混合(并适当地能够进行质子交换)时，或者如果所需量的相应的“酸/碱共轭物”在原位形成—这可以通过加入强酸或碱直至达到所需的pH而实现。例如，在乙酸钠缓冲系统中，可以先使用乙酸钠(碱性)溶液，然后酸化，例如用盐酸，或者加入乙酸(酸性)、氢氧化钠或乙酸钠溶液中，直至达到所需的pH值。

通常，“稳定剂”是指有助于维持生物制药药物的结构完整性的组分，特别是在冷冻和/或冻干和/或储存期间(特别是当暴露于应激时)。这种稳定效果可能由于多种原因而产生，但通常这种稳定剂可起到渗透剂的作用减缓蛋白质变性。如本文所用的，稳定剂是氨基酸(即游离氨基酸，其不是肽或蛋白质的一部分—例如甘氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、赖氨酸)和糖稳定剂，例如糖醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇)和/或二糖(例如海藻糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖)。

根据本发明，用作缓冲剂、抗氧化剂或表面活性剂的试剂不包含在本文所用的术语“稳定剂”的含义之中，即使它们可能表现出活性或稳定活性(even if they mayexhibit,i.a.stabilizing activity)。

本文中，术语“表面活性剂(surfactant)”是指表面活性剂(surface-activeagent)，优选非离子表面活性剂。本文中使用的表面活性剂的实施例包括聚山梨酸酯(例如聚山梨酸酯20(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯)，也以商品名Tween 20为人所知)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188，一种非离子三嵌段共聚物，由聚氧丙烯(聚(环氧丙烷)的中央疏水链构成，聚氧丙烯侧接聚氧乙烯(聚(环氧乙烷)的两条亲水链，也以商品名Lutrol F 68为人所知)。本文中，术语“稳定”，通常是指在保存/储存期间组分(通常为其活性物质或组合物)的物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物稳定性。

根据本发明，用作缓冲剂、抗氧化剂或稳定剂的试剂不包含在本文使用的术语“表面活性剂”的含义之中，即使它们可能表现出活性或稳定活性。

本文中，术语“抗氧化剂”是指能够防止或减少制剂中待稳定的生物药物的氧化的试剂。抗氧化剂包括自由基清除剂(例如抗坏血酸、BHT、亚硫酸钠、p-氨基苯甲酸、谷胱甘肽或没食子酸丙酯)、螯合剂(例如EDTA或柠檬酸)或链终止剂(例如甲硫氨酸或N-乙酰半胱氨酸)。根据本发明，用作缓冲剂、稳定剂或表面活性剂的试剂，不包含在此使用的术语“抗氧化剂”的含义之中，即使它们可能表现出活性或稳定活性。

“稀释剂”是构成任何液体药物组合物中成分的平衡的试剂，例如使得重量百分比总计100％。本文中，液体药物组合物是水性药物组合物，因此本文使用的“稀释剂”是水，优选注射用水(WFI)。

本文中，术语“颗粒尺寸”或“孔尺寸”分别指给定的颗粒或孔的最长维度的长度。可使用激光颗粒尺寸分析仪和/或电子显微镜(例如隧道电子显微镜，TEM或扫描电子显微镜，SEM)测量二者的尺寸。可使用实施例中概述的方案和设备得到颗粒计数(对于任何给定的尺寸)，其涉及亚可见颗粒的颗粒计数。

本文中，术语“约”是指对于本技术领域技术人员而言容易知晓的相应值的通常误差范围。在此提及的“约”某一值或参数包括(并描述)了针对该值或参数本身的方案。如果有疑问，或者对于特定值或参数的误差范围没有被该领域承认的通常理解，则“约”意味着该值或参数的±5％。

本文中，与聚糖物质有关的术语“百分比份额”直接指不同物质的数量。例如，术语“所述FA2G1占所有聚糖物质的25％-41％”是指在具有100个重链的经分析的50个抗体分子中，25-41个重链会表现出FA2G1糖基化模式。

需要理解的是，提及的“治疗”或“疗法”包括预防以及减轻病症的既定症状。因此，对某一状态、紊乱或病症的“治疗”或“疗法”包括：(1)在可能患有或易患该状态、紊乱或病症但尚未经历或显示出该状态、紊乱或病症的临床或亚临床症状的人中，预防或延迟该状态、紊乱或病症的临床症状的出现，(2)抑制该状态、紊乱或病症，即阻止、减少或延迟疾病的发展或其复发(在维持治疗的情况下)，或其至少一种临床或亚临床症状，或(3)缓解或减轻疾病，即造成该状态、紊乱或病症或其临床或亚临床症状中的至少一种的消退。

水性抗-PD-L1抗体制剂

在第一方面，本发明提供了一种新的水性药物抗体制剂，其包含：

(i)浓度为1mg/mL至30mg/mL的Avelumab，作为抗体；

(ii)浓度为5mM至15mM的乙酸盐或组氨酸，作为缓冲剂；

(iii)浓度为240mM至320mM的D-甘露糖醇或海藻糖，或浓度为50至150mM的盐酸精氨酸和浓度为25mM至75mM的谷氨酸的组合，作为稳定剂；

(iv)浓度为0.25mg/mL-0.75mg/mL的泊洛沙姆188或聚山梨醇酯20，作为表面活性剂或非表面活性剂；

其中所述制剂不包含甲硫氨酸，并且

另外其中所述制剂的pH为5.0至6.0，优选为5.0至5.6。

在一优选实施方案中，所述制剂不包含任何抗氧化剂。

在一实施方案中，所述制剂中Avelumab的浓度为约10mg/mL至约20mg/mL。

在另一实施方案中，所述制剂中乙酸盐或组氨酸的浓度为约10mM。

在又一实施方案中，所述制剂中D-甘露糖醇或海藻糖的浓度为约280mM，或者对于盐酸精氨酸和谷氨酸的组合，盐酸精氨酸的浓度为约150mM，并且谷氨酸的浓度为约50mM。

在又一实施方案中，所述制剂中泊洛沙姆188或聚山梨醇酯20的浓度为约0.5mg/mL。

在又一实施方案中，所述制剂的pH为5.2(±0.1)至5.5(±0.1)。

在一个优选的实施方案中，所述制剂包含浓度为约10mM的乙酸盐，并且不包含任何其他缓冲剂。

在另一优选的实施方案中，所述制剂包含浓度为约280mM的D-甘露糖醇或海藻糖，并且不包含任何其他稳定剂。

在又一优选的实施方案中，所述制剂包含浓度为约0.5mg/mL的聚山梨醇酯20或泊洛沙姆188，并且不包含任何其它表面活性剂。

在一实施方案中，所述制剂包含：

(i)浓度为约10mg/mL的Avelumab，作为抗体；

(ii)浓度为约10mM的乙酸盐，作为缓冲剂；

(iii)浓度为约280mM的D-甘露糖醇或海藻糖，作为稳定剂；

(iv)浓度为约0.5mg/mL的聚山梨醇酯20或泊洛沙姆188，作为表面活性剂；

并且不包含甲硫氨酸，且pH值为约5.5。

在一优选实施方案中，所述制剂包含：

(i)Avelumab，浓度为10mg/mL；

(ii)乙酸盐，浓度为10mM；

(iii)D-甘露糖醇或海藻糖，浓度为280mM；

(iv)聚山梨醇酯20或泊洛沙姆188，浓度为0.5mg/mL；

并且pH值为5.5(±0.1)。

在一个优选的实施方案中，所述制剂由以下组成：

(i)Avelumab，浓度为10mg/mL；

(ii)三水合乙酸钠，浓度为10mM；

(iii)D-甘露糖醇或海藻糖，浓度为280mM；

(iv)聚山梨醇酯20或泊洛沙姆188，浓度为0.5mg/mL；

(v)HCl，用于调节pH值；

(vi)水(注射用)，作为溶剂；

并且pH值为5.5(±0.1)。

在一个优选的实施方案中，所述制剂由以下组成：

(i)Avelumab，浓度为10mg/mL；

(ii)三水合乙酸钠，浓度为10mM；

(iii)二水合海藻糖，浓度为280mM；

(iv)聚山梨醇酯20，浓度为0.5mg/mL；

(v)HCl，用于调节pH值；

(vi)水(注射用)，作为稀释剂；

并且pH值为5.5(±0.1)。

在更优选的实施方案中，所述制剂由以下组成：

(i)Avelumab，浓度为10mg/mL；

(ii)三水合乙酸钠，浓度为10mM；

(iii)D-甘露糖醇，浓度为280mM；

(iv)聚山梨醇酯20，浓度为0.5mg/mL；

(v)HCl，用于调节pH值；

(vi)水(注射用)，作为稀释剂；

并且pH值为5.5(±0.1)。

在另一实施方案中，所述制剂包含：

(i)浓度为约20mg/mL的Avelumab，作为抗体；

(ii)浓度为约10mM的乙酸盐，作为缓冲剂；

(iii)浓度为约280mM的D-甘露糖醇或海藻糖，作为稳定剂；

(iv)浓度为约0.5mg/mL的聚山梨醇酯20或泊洛沙姆188，作为表面活性剂；

并且不包含甲硫氨酸，且pH值为5.2(±0.1)。

在一优选实施方案中，所述制剂包含：

(i)Avelumab，浓度为20mg/mL；

(ii)乙酸盐，浓度为10mM；

(iii)D-甘露糖醇或海藻糖，浓度为280mM；

(iv)聚山梨醇酯20或泊洛沙姆188，浓度为0.5mg/mL；

并且pH值为5.5(±0.1)。

在一优选实施方案中，所述制剂包含：

(i)Avelumab，浓度为20mg/mL；

(ii)乙酸，浓度为10mM；

(iii)D-甘露糖醇或二水合海藻糖，浓度为280mM；

(iv)聚山梨醇酯20或泊洛沙姆188，浓度为0.5mg/mL；

(v)乙酸钠，用于调节pH值；

(vi)水(注射用)，作为稀释剂；

并且pH值为5.2(±0.1)。

在更优选的实施方案中，所述制剂由以下组成：

(i)Avelumab，浓度为20mg/mL；

(ii)乙酸，浓度为10mM；

(iii)D-甘露糖醇，浓度为280mM；

(iv)聚山梨醇酯20，浓度为0.5mg/mL；

(v)乙酸钠，用于调节pH值；

(vi)水(注射用)，作为稀释剂；

并且pH值为5.2(±0.1)。

在更优选的实施方案中，所述制剂由以下组成：

(i)Avelumab，浓度为20mg/mL；

(ii)乙酸，浓度为10mM；

(iii)二水合海藻糖，浓度为280mM；

(iv)聚山梨醇酯20，浓度为0.5mg/mL；

(v)乙酸钠，用于调节pH值；

(vi)水(注射用)，作为稀释剂；

并且pH值为5.2(±0.1)。

在更优选的实施方案中，所述制剂由以下组成：

(i)Avelumab，浓度为20mg/mL；

(ii)乙酸，浓度为10mM；

(iii)D-甘露糖醇，浓度为280mM；

(iv)泊洛沙姆188，浓度为0.5mg/mL；

(v)乙酸钠，用于调节pH值；

(vi)水(注射用)，作为稀释剂；

并且pH值为5.2(±0.1)。

在更优选的实施方案中，所述制剂由以下组成：

(i)Avelumab，浓度为20mg/mL；

(ii)乙酸，浓度为10mM；

(iii)二水合海藻糖，浓度为280mM；

(iv)泊洛沙姆188，浓度为0.5mg/mL；

(v)乙酸钠，用于调节pH值；

(vi)水(注射用)，作为稀释剂；

并且pH值为5.2(±0.1)。

在一优选的实施方案中，所述制剂由以下组成：

(i)Avelumab，浓度为20mg/mL；

(ii)乙酸，浓度为10mM(0.6mg/mL)；

(iii)D-甘露糖醇，浓度为280mM(51mg/mL)；

(iv)聚山梨醇酯20，浓度为0.5mg/mL；

(v)氢氧化钠，浓度为7.5mM(0.3mg/mL)；

(vi)水(注射用)，作为稀释剂；

并且pH值为5.0至5.6，优选地为5.2(±0.1)。

在一优选的实施方案中，后一种制剂通过组合以下组分制成：

(i)20mg/mL的Avelumab；

(ii)0.6mg/mL的冰醋酸；

(iii)51mg/mL的D-甘露糖醇；

(iv)0.5mg/mL聚山梨醇酯20；

(v)0.3mg/mL的氢氧化钠；

(vi)水(注射用)，作为稀释剂；

以获得所述制剂的期望体积。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种水性药物抗体制剂，其中使用氢氧化钠调节pH值。因此，所述制剂的组成为：作为活性成分的浓度为20mg/mL的Avelumab；和作为赋形剂的冰醋酸、D-甘露糖醇、聚山梨醇酯20、氢氧化钠和注射用水；其中所述制剂的pH值为5.0至5.6，优选地为5.2(±0.1)。

在一优选的实施方案中，所述制剂的重量摩尔渗透压浓度(osmolality)在270至330mOsm/kg之间。

在一实施方案中，如以上所描述的制剂中的所述Avelumab具有图1a(SEQ ID NO:1)或图1b(SEQ ID NO:2)的重链序列、图2的轻链序列(SEQ ID NO:3)，并且在Asn300上携带糖基化，其包括FA2和FA2G1作为主要聚糖物质，其联合份额占所有聚糖物质的70％以上。

在一优选的实施方案中，在Avelumab糖基化中，所述FA2占所有聚糖物质的44％至54％，并且所述FA2G1占25％-41％。

在一优选的实施方案中，在Avelumab糖基化中，所述FA2占所有聚糖物质的47％-52％，并且所述FA2G1占29％-37％。

在一优选的实施方案中，在Avelumab糖基化中，所述FA2占所有聚糖物质的约49％，并且所述FA2G1占约30％-约35％。

在一优选的实施方案中，Avelumab糖基化还包含作为次要聚糖物质的A2、A2G1、A2G2以及FA2G2，分别占所有聚糖物质的<5％、<5％、<5％和<7％。

在一优选的实施方案中，在Avelumab糖基化中，所述A2占所有聚糖物质的3％-5％、所述A2G1占<4％、所述A2G2占<3％并且所述FA2G2占5％-6％。

在一优选的实施方案中，在Avelumab糖基化中，所述A2占所有聚糖物质的约3.5％-约4.5％、所述A2G1占约0.5％-约3.5％、所述A2G2占<2.5％并且所述FA2G2占约5.5％。

在一实施方案中，如以上所描述的制剂中的所述Avelumab具有图1b的重链序列(SEQ ID NO:2)。

在一实施方案中，如上所述的Avelumab制剂用于静脉内(IV)施用。

药物递送装置

在第二方面，本发明提供了一种药物递送装置，其包含如本文所定义的液体药物组合物。药物递送装置适当地包括腔室，所述药物组合物位于其中。适当地，所述药物递送装置是无菌的。

所述药物递送装置可以是小瓶、安瓿、注射器、注射笔(例如基本上整合了注射器)或i.v.(静脉)袋。

水性药物制剂经肠胃外施用，优选经由皮下注射、肌内注射、静脉注射或静脉输注。最优选的施用方式是静脉输注。

在一优选的实施方案中，所述药物递送装置是含有如上所述的制剂的小瓶。

在更优选的实施方案中，所述小瓶在10mL溶液中包含200mg Avelumab，Avelumab浓度为20mg/mL。

在甚至更优选的实施方案中，小瓶是玻璃小瓶。

药物治疗

在第三方面，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括将如上所述的制剂施用于患者。

在一个实施方案中，待治疗的癌症选自非小细胞肺癌、尿路上皮癌、膀胱癌、间皮瘤、默克尔细胞癌、胃癌或胃食管交界癌、卵巢癌、乳腺癌、胸腺瘤、胃腺癌、肾上腺皮质癌、头颈部鳞状细胞癌、肾细胞癌、黑素瘤和/或经典霍奇金淋巴瘤。

缩写

ANOVA 方差分析

CD 圆二色性

CE 毛细管电泳

DoE 实验设计

DP 药物产品

DS 药物

DSF 差示扫描荧光测定

DTT 二硫苏糖醇

ESI 电喷雾电离

HILIC 亲水相互作用液相色谱

HMW 较高的分子量

HPLC 高效液相色谱

iCE 毛细管等电聚焦

LC 液相色谱

LMW 较低的分子量

MALDI 基质辅助激光解吸电离

MS 质谱

NTU 浊度法浊度单位

OD 光密度

PBS 聚缓冲盐水

PES 聚醚砜

PVDF 聚偏二氟乙烯

SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SE 尺寸排除

TOF 飞行时间

UPLC 超高效液相色谱

RH 相对湿度(Residual Humidity)

UV 紫外线

实施例

用于确定稳定性的方法

为了评估经测试的抗体制剂的稳定性，并选择最佳候选者，根据以下方案确定热应激、机械应激、光照、重量摩尔渗透压浓度(osmolality)、浊度、蛋白质含量、总聚集物、片段化、pH、同种异形体(isoform)、圆二色性、亚可见颗粒和生物活性这些稳定性参数：

热应激：

在40℃：将原始小瓶容器中的样品在温度为40℃±2℃(RH 75％±5％)的恒温箱中温育，并在预定时间点取出。

在25℃：将原始小瓶容器中的样品在温度为25℃±2℃(RH 60％±5％)的恒温箱中温育，并在预定时间点取出。

机械应激：

将原始小瓶容器中的样品放在轨道摇床上，保持在300转/分钟，持续达24小时(室温)。

光照：

将原始小瓶容器中的样品暴露于光源7小时，将Suntest机器中的辐照度水平调整为765W/m²(辐射波长在320nm和800nm之间)。

重量摩尔渗透压浓度(Osmolality)：

正常人血浆的重量摩尔渗透压浓度为约280mOSm/kg(Medical Physiology-Principles for Clinical Medicine.由Rodney A.Rohdes博士和David R.Bell博士编辑)。一般来说，当开发肠胃外制剂时，以重量摩尔渗透压浓度接近300mOsm/kg的溶液作为目标。可接受的范围(根据产品规格)为250-400mOsm/kg。

在这里，重量摩尔渗透压浓度是通过在加入溶质后测定水溶液的凝固点下降的冰点测定法确定的。溶质的量，以及因此观察到的重量摩尔渗透压浓度值与混合的溶液(compounded solution)的观察到的凝固点下降成比例。

浊度：

溶液的浊度可用比浊计测定，所述比浊计能够测量散射光或衰减光(Hach LangeModel 2100AN型号)。在小容量比色杯中约3毫升的溶液，被870±30nm发光二极管(LED)组件照射。检测器监测散射光并通过与已知浊度的一系列标准品进行比较来提供溶液的浊度(NTU)。

蛋白质含量：

在1cm路径长度的石英比色杯中，通过在280nm和320nm处的溶液的光密度确定蛋白质含量(用相应缓冲液稀释至蛋白质浓度)。假定摩尔消光系数为1.46cm²/mg，通过代入公式：(A280-A320)/(1.46cm²/mg×1cm)获得蛋白质浓度。

总聚集物：

通过SE-HPLC方法测定聚集物的量。将20μL的样品体积(样品用PBS稀释至约0.5mL)注入TSK gel Super SW3000 4.6mm×30cm(cod.18675)中，温度保持在22±5℃，流速为0.35mL/min(流动相为50mM磷酸钠+0.4高氯酸钠，pH为6.3±0.1)。在214nm处进行UV检测。

片段化：

通过生物分析仪测定低分子物质(或片段)。进行分析的样品的浓度范围为1.25-3.75mg/mL(用纯水制备的稀释液)。将3μL的各稀释样品与2μL的相应样品缓冲液(当在还原条件下进行测试时加入DTT)和1μL 60mM马来酰亚胺溶液混合。将样品在70℃加热5分钟，然后加入84μL的纯水并将溶液涡旋并离心沉降。将6μL加载到芯片上(0.25-0.75μg蛋白质)。将芯片放入Agilent 2100生物分析仪中，并在接下来的五分钟内开始分析。

同种异形体：

同种异形体分布由iCE确定。使用Fc涂布的毛细管柱(内径为100mm，且长度为50mm)。通过使用以下进行分离：阴极溶液为0.1％甲基纤维素中的100mM NaOH溶液，阳极溶液为0.1％甲基纤维素中的80mM正磷酸(o-phosphoric acid)溶液。样品从80μL主混合物溶液开始制备(通过混合以下获得：700μL 0.1％甲基纤维素、10μL Pharmalyte 5-8、70μLPharmalyte 8-10.5、10μL 7.65pI标记物和10μL 9.77pI标记物)，向其中加入合适体积的经洗涤的Avelumab样品(相当于洗涤后除去制剂组分后200μg的蛋白质)。加入一定量的相应于在前一步骤中加入的经洗涤的Avelumab样品的体积(120μL)的纯化水。分离是在检测波长为280nm的情况下进行的，分别设置1分钟和15分钟的预聚焦和聚焦时间，以及预聚焦和聚焦电压分别为1500V和3000V。样品在1000mBar的压力下注入。

pH：通过常规电位测定法来确定。

圆二色性(CD)：

在近紫外范围(320-250nm)中，通过使用Jasco(mod.J810)的CD分光光度计对Avelumab的三级结构进行研究。将样品用纯水稀释至1.5mg/mL蛋白质浓度，并且一旦加入到1cm路径长度的石英比色杯中，在室温以20nm/min的扫描速度、以0.5nm的数据间距(datapitch)、8秒的积分时间和标准灵敏度进行分析。

亚可见颗粒：

通过使用Pamas SVSS-C颗粒计数器的光遮蔽法的技术来计数亚可见颗粒。将样品用纯水稀释5倍以获得至少25mL的待测试的最终体积。

生物活性：

对于在实施例5中描述的长期稳定性研究，生物活性作为另外的稳定性参数被测量。

使用的方法是基于Avelumab的能力吸附在ELISA板上以剂量依赖性方式结合存在于细胞系HEK-293(hPDL1，用PD-L1永久转染)上的其抗原PD-L1。使用的剂量是400、200、100、50、25、12.5、6.25和3.12ng/mL。从获得的数据计算EC₅₀值。样品的生物活性(效能)用样品相对于标准品的生物活性的百分比来表示，并且如下计算：效能(样品)[％]＝(EC₅₀(样品)/EC₅₀(标准品)×100.7。

制备方法

本发明还提供了制备本文所定义的水性药物制剂的方法。所述方法适合地包括，以视为适当的任何特定顺序将所需的任何相关组分混合在一起以形成水性药物制剂。本领域技术人员可参考本领域公知的用于形成水性药物制剂(特别是那些通过注射器注射或静脉输注)的示例或技术。

所述方法可包括，首先制备除Avelumab之外的一些或全部组分(任选地与一些或全部稀释剂)的预混物(或预溶液)，且然后Avelumab自身(任选地与一些稀释剂一起或者预溶解在一些稀释剂中)可与预混物(或预溶液)混合以提供水性药物制剂或组合物(随后向所述组合物中加入最终组分以提供最终水性药物制剂)。优选地，该方法涉及形成缓冲系统，合适地是包含如本文所定义的缓冲剂的缓冲系统。在添加Avelumab之前，缓冲系统合适地在预混物中形成。缓冲系统可通过简单地将缓冲剂(提供预制的)与其酸/碱共轭物(适合地以合适的相对量混合以提供期望的pH—其可由技术人员从理论上或实验上确定)混合形成。在乙酸盐缓冲系统的情况下，这意味着例如将乙酸钠与HCl混合，或将乙酸与NaOH或乙酸盐混合。最终的水性药物制剂的预混物的pH可通过加入所需量的碱或酸或一定量的缓冲剂或酸/碱共轭物而仔细调整。

在某些实施方案中，缓冲剂和/或缓冲系统预先形成为单独的混合物，并通过缓冲物交换(例如使用渗滤直至达到相关浓度或重量摩尔渗透压浓度)将缓冲系统转移至水性药物制剂的前体(包含除缓冲剂和/或缓冲系统之外的一些或全部组分，合适地包含Avelumab并且可能仅包含Avelumab)。如果需要，可在其后添加其他赋形剂以制备最终的液体药物组合物。调节pH可在所有组分都添加之后立刻进行或在此之前进行。

任何、一些或全部组分可与稀释剂预先溶解或预先混合以与其他组分混合。

可过滤最终的水性药物制剂以适当地去除颗粒物质。合适的过滤为通过尺寸等于或小于1μm的过滤器，适合地为0.22μm。合适地，通过PES过滤器或PVDF过滤器进行过滤，适合地为0.22μm PES过滤器。

本领域技术人员非常清楚如何能使用水性药物制剂来制备静脉注射溶液，从而使抗体药物物质可在静脉内施用。

静脉注射溶液的制备通常由以下组成：从带有塑料注射器(PP)和针头的盐水袋(例如0.9％或0.45％盐水)中取出的一定量的溶液，并用水性药物制剂替代。替代的溶液量将取决于患者的体重。

实施例1—Avelumab的结构

1.1一级结构

Avelumab是具有两个重链和两个轻链分子的IgG。两条链的氨基酸序列分别如图1a(SEQ ID NO:1)/1b(SEQ ID NO:2)和图2(SEQ ID NO:3)所示。

1.2二级结构

使用LC-MS和MS/MS方法以确认分子的完整链以及蛋白质的翻译后修饰的存在。图3显示了Avelumab分子亚基的二级结构。

如通过UPLC-Q-TOF质谱分析经胰蛋白酶消化获得的肽确认的，二硫键Cys21-Cys96、Cys21-Cys90、Cys147-Cys203、Cys138-Cys197、Cys215-Cys223、Cys229-Cys229、Cys232-Cys232、Cys264-Cys324和Cys370-Cys428形成九种典型的IgG结合模式。

1.3糖基化

所述分子在重链的Asn300上含有一个N-糖基化位点。如通过肽定位(mapping)所确定的，由MALO1-TOF鉴定的主要结构是复杂的、双触角型核心岩藻糖基化的具有零个(G0F)、一个(G1F)或两个(G2F)半乳糖残基的寡糖。主要物质是G0F和G1F。由2-氨基苯甲酰胺标记的Avelumab聚糖荧光已通过HILlC-UPLC-ESI-Q-TOF进行了分析。图4显示了发现的聚糖物质的UPLC谱。

表1：2AB HILlC-UPLC色谱图的峰鉴定

几何形状代表聚糖构建模块，对应于以下分子实体：

Man △Fuc ○Gal □GalNAc GlcNAc ◇NANA NGNA

Man：甘露糖、Fuc：岩藻糖、Gal：半乳糖、GalNAc：N-乙酰半乳糖胺、NANA：唾液酸、NGNA：N-羟乙酰神经氨酸

使用的聚糖命名法遵循Harvey等人(Proteomics 2009，9，3796-3801)提出的牛津标志法。在含有岩藻糖的物质中(FA2、FA2G1、FA2G2)，Fuc-GlcNAc的连接性为α1-6。在具有末端GlcNAc的物质中，GlcNAc-Man连接性为β1-2。在含有半乳糖的物质中，Gal-GlcNAc连接性为β1-4。

经报道的色谱图谱(profile)已被整合并产生Avelumab的聚糖物质分布，如表2a所示。

表2a

A2	FA2	A2G1	FA2G1	A2G2	FA2G2	M5**
							3.6	48.7	3.4	35.6	2.3	5.4	1.0

**可能是甘露糖5，与双触角单半乳糖基化的物质共洗脱

聚糖定位(mapping)分析证实了通过肽定位进行的鉴定(允许鉴定两种主要聚糖物质)，此外还用该方法表征了二级和次要物质，特别用于聚糖分析。

在另一次测量中观察到以下聚糖物质分布。

表2b

A2	FA2	A2G1	FA2G1	A2G2	FA2G2
						4.0	50.2	1.0	30.0	0.1	5.6

实施例2—DoE1的筛选

第一个实验设计在10mg/mL Avelumab筛选DoE1，评估了几个因素的影响，如不同缓冲物质类型/pH值、赋形剂、表面活性剂类型和相关浓度。通过这项研究选择出可使蛋白质稳定性最大化的最佳条件。

在DoE1中考虑了以下因素用于研究：

-缓冲物质类型和pH值：乙酸盐、柠檬酸盐和组氨酸缓冲物质，在pH值为5.0-6.0的范围内进行评估。

-赋形剂：考虑3种不同的赋形剂，以指示糖/糖醇(polyol)或氨基酸是否优选用于在配方中混合(compounding)。

-表面活性剂类型和浓度：两种备选的表面活性剂(Tween 20和泊洛沙姆188)以不同浓度(0-1mg/mL)进行评估。

该研究在DIN6R小瓶(Schott)中进行，蛋白质浓度为10mg/mL，填充体积为8mL(80mg/小瓶)。

表3描述了经研究的DoE1配方的选择。

DoE1允许选择合适的待制备的缓冲物质/pH、赋形剂类型和表面活性剂类型，它们用于如实施例3中所描述的随后的DoE2研究。

表3 DoE1筛选制剂

(1)对应于280mM

(2)对应于150mM

(3)对应于50mM

(4)WO2013079174中公开的制剂

2.1制备

预先配制的药物物质(DS)(10(±1)mg/mL Avelumab、1.36mg/mL三水合乙酸钠、51mg/mL D-甘露糖醇、0.21mg/mL L-甲硫氨酸、盐酸q.b.至pH 5.5)在三种缓冲液(pH 5.0的10mM乙酸钠、pH 5.0的10mM柠檬酸钠和pH 5.75的10mM组氨酸)中通过切向流动过滤(使用具有10kDa截留的Pellicon XL Biomax盒)进行缓冲物质交换，直至达到三倍体积交换。在每个步骤中，DS溶液用相关缓冲物质稀释5倍。交换的DS材料中，最终目标蛋白质浓度>10mg/mL。然后将所需的赋形剂加入到相关的缓冲物质-交换的DS材料中，调整pH和最终溶液重量至目标以获得表3中列出的DP组合物。

向交换的DS溶液添加成分的顺序如下：

将D-甘露糖醇或二水合海藻糖或盐酸精氨酸+谷氨酸加入交换的DS溶液中，搅拌至完全溶解，加入L-甲硫氨酸并搅拌至完全溶解(仅用于参考)，加入泊洛沙姆188或聚山梨醇酯20(50mg/mL储备溶液)，搅拌至完全溶解，检查pH并用氢氧化钠调节至目标pH。

药物产品(DP)溶液加入(8mL)到DIN6R小瓶(Schott)中。

在DS渗滤过程中的目视检查表明，柠檬酸钠缓冲液通常导致更高的乳光，同时当在乙酸钠和组氨酸缓冲物质中进行交换时也获得了明显更澄清的溶液。

在表4中，显示了在缓冲液交换时测定三种DS材料的蛋白质回收率、重量摩尔渗透压浓度(Osmomat 030/D，Gonotec)和浊度的实验结果。获得了令人满意的蛋白质回收率(>89％)和最终重量摩尔渗透压浓度值(<61mOsm/kg)。浊度分析证实在柠檬酸钠中DS交换的乳光更高。

表4：缓冲液交换后在DS材料上进行的回收率(OD)、重量摩尔渗透压浓度和浊度的实验结果。

缓冲物质	回收(％)	重量摩尔渗透压浓度(mOsm/kg)	浊度(NTU)
				乙酸盐	96	29	3
柠檬酸盐	89	38	30
				组氨酸	93	61	6

2.2重量摩尔渗透压浓度

与DoE1筛选相关的DP制剂的重量摩尔渗透压浓度值包含在299-396mOsm/kg的范围内，大多数制剂的重量摩尔渗透压浓度低于约360mOsm/kg。

测量在时间0时进行直至制备完成。

所获得的值与目标一致(可接受的范围250-400mOsm/kg)。含有二水合海藻糖的溶液显示出较高的值(接近400mOsm/kg)，这是由于该成分对冰点的影响和随后(显见)增加的重量摩尔渗透压浓度。

2.3热应激

2.3.1蛋白质含量

如通过OD测量所确定的，在时间0时的含量值与理论值(10mg/mL)一致。在40℃1个月后没有观察到显着变化。

2.3.2总聚集物

在时间0时，且在40℃储存2周和4周后，通过SE-HPLC测定总聚集物DoE1制剂。

在40℃的热应激下，在聚集物方面没有统计学意义上显著的变化凸现出来，因此表明经测试的不同的基质导致聚集模式的不变/可忽略的变化。

2.3.3片段化

在时间0时，且在40℃储存2周和4周后，通过生物分析仪(2100生物分析仪，Agilent)测定在DoE1制剂中的片段化。

数据表明：

-pH值是40℃时蛋白质片段化的关键因素。在pH>5.75时，片段化倾向于显著增加(最典型地在从DoE1-13到DoE1-19的制剂中，在柠檬酸盐和组氨酸缓冲液中)。

-片段化中表现出最低程度变化的制剂是pH范围为5.0-5.75的制剂，尤其是在D-甘露糖醇或二水合海藻糖(DoE1-2-8-9-10-12)的存在下。

-制剂DoE1-7(柠檬酸盐缓冲液pH5.25，存在D-甘露糖醇和Tween 20)呈现出连贯的(consistent)峰倍增的异常分布(在片段化方面可能与使用柠檬酸盐作为缓冲剂有关的一些问题，此外在制造过程中已经注意到有增加浊度/乳光的问题)。

2.3.4浊度

在时间0时，且在40℃储存2周和4周后，使用浊度测定法(nephelometry)测定DoE1制剂的浊度。

在含有柠檬酸盐作为pH缓冲剂的所有DP制剂中，始终能观察到乳光/强乳光。

在乙酸钠和组氨酸中的所有制剂都是透明的/略带乳光，在40℃储存1个月后没有观察到显著变化。

2.3.5 pH

未发现pH的变化。

2.4机械应激

将DoE1制剂在小瓶中以300rpm(室温)进行24小时的轨道摇动。在压力终止后，测试样品的聚集物和乳光。

2.4.1总聚集物

在机械应激后，通过SE-HPLC测定总聚集物，并与时间0时的结果进行比较。观察到可忽略的变化。

2.4.2浊度

机械应激后且与时间0时的结果比较，DoE1制剂的浊度通过浊度测定法(2100ANIS，Hach Lange)测量。通过ANOVA评估数据，并观察到来自表面活性剂的存在的中等显著影响(0.01<p值<0.05)。Tween20或泊洛沙姆188可帮助最小化机械应激后的浊度变化。

2.5光照

DoE1制剂在765W/m²下进行7小时照射(Suntest CPS，Atlas)。在光应激终止后，测试样品的聚集物、乳光、pH和同种异形体谱。

2.5.1总聚集物

使用SE-HPLC(Alliance，Waters)观察到轻微变化，最常见的是当使用柠檬酸钠缓冲液时(p值<0.01)。

为了使聚集变化最小化，乙酸钠和组氨酸是优选的缓冲物质。

2.5.2浊度

如通过浊度测定所确定的，最明显的浊度增加一般发现于pH值>5.75(DoE1-13和DoE1-16和DoE1-17)的柠檬酸盐缓冲物质中。

2.5.3 pH

未观察到变化。

2.6 DoE1：结果

评估在热应激、机械应激和光应激的框架中获得的数据应激应激，以确定针对应激提供最大的蛋白质抗性的条件。

结果分析报告在表5中。

表5：10mg/mL蛋白质浓度下，高度稳定的Avelumab制剂的组分

外推的制剂以绿色突出显示(ID#＝外推)，而那些测试组中最相似的配方是DoE1-4，也有报道。

这些数据表明，pH 5.0-5.5的乙酸盐缓冲物质提供改进的蛋白质稳定性，并且在存在表面活性剂(如Tween 20或泊洛沙姆188)浓度高于0.2mg/mL时，对于提高制剂中的蛋白质稳定性也是重要的。

实施例3

第二次DoE筛选“DoE2”旨在微调在DoE1完成时选定的制剂，并同时将蛋白质浓度增加至20mg/mL。

通过第二次制剂筛选，20mg/mL蛋白质浓度的制剂赋形剂(D-甘露糖醇、二水合海藻糖)和表面活性剂(不含表面活性剂、0.5mg/mL的泊洛沙姆188或聚山梨醇酯20)不同的六种制剂在热应激(在40℃下1个月、在25℃和2-8℃下8周)且机械摇动(24小时，300rpm，室温)后，在pH 5.2的10mM乙酸钠缓冲物质存在下测试。表6中列出了相关的组合物。

表6：DoE2筛选制剂(蛋白质浓度＝20mg/mL)

进行DoE2研究以比较评价D-甘露糖醇与二水合海藻糖的效果，以及表面活性剂(吐温20或泊洛沙姆188，或不含表面活性剂)在pH 5.2的乙酸钠缓冲液中在20mg/mL增加的蛋白质浓度的影响。设计中包括两个pH值5.5的参考样品：含L-甲硫氨酸的“参考”和不含L-甲硫氨酸的参考制剂，对应于DoE1-8。

3.1制备

使用预先配制的药物物质(DS)(在pH 5.5的10mM乙酸钠中的27.1mg/mL的Avelumab)。然后将所需的赋形剂加入到DS材料中。

向DS溶液添加成分的顺序如下：加入D-甘露糖醇或二水合海藻糖，搅拌至完全溶解，加入泊洛沙姆188或聚山梨醇酯20(20mg/mL储液)，搅拌至完全溶解，加入L-甲硫氨酸并搅拌至完全溶解(仅用于参考)，搅拌至完全溶解，检查pH值并用氢氧化钠或稀释的乙酸调节到目标pH值。

用相关缓冲物质调节溶液重量至目标，以获得表7中列出的DP组合物。

DP溶液(8mL)装入DIN6R小瓶中。

3.2热应激

3.2.1蛋白质含量

在40℃经过4周(表7)和25℃经过8周(表8)未发现蛋白质含量(OD，Lambda 35，Perkin Elmer)的变化。

表7：通过DoE2制剂的OD的蛋白质含量(mg/mL)(40℃时热应激)。

表8：通过DoE2制剂的OD的蛋白质含量(mg/mL)(25℃时热应激)。

3.2.2总聚集物

通过SE-HPLC测定的40℃和25℃稳定性的总聚集物分别示于图6和图7中。观察到只有微小的、非显著的聚集变化。

3.2.3通过生物分析仪的片段化

在40℃评估片段1个月，并在25℃评估2个月。相关结果分别如图8和图9所示。

在40℃，除制剂DoE2-1外，其在1个月后呈现高于7％的片段量，观察到其他配方具有相似的行为(1个月后片段量为4-6％)，制剂DoE2-4、DoE2-5和DoE2-6的效果稍好一些(在40℃1个月后片段量为4.0-4.5％)。

在25℃，2个月后发现类似的片段化百分比(4.6-6.1％)。

3.2.4同种异形体分布(profile)

在时间0时且在40℃储存4周后，通过iCE280(Fast IEF分析仪，ConvergentBioscience)测定在DoE2制剂中的同种异形体分布。在40℃储存时，通常可确定酸性簇的增加，同时观察到碱性同种异形体的并发减少。

在40℃经过1个月(表9)和在25℃8周后(图10)评估同种异形体分布。

在两种应激条件下，所有样品均观察到可比较的(comparable)变化。

表9：在40℃4周后，针对DoE2制剂的iCE280结果

3.2.6浊度

在40℃1个月后(表8)和25℃下2个月后(表9)没有观察到变化。

表10：在40℃1个月后DoE2制剂的浊度

表11：在25℃2个月后DoE2制剂的浊度

3.2.7 pH

在40℃1个月后(表12)和在25℃2个月后(表13)没有观察到变化。

表12：40℃1个月后DoE2制剂的pH值

表13：25℃2个月后DoE2制剂的pH值

3.2.8圆二色性

在时间0和在40℃4周后和在25℃8周后在近紫外线范围内收集DoE2制剂的圆二色性光谱(J-810 Spectropolarimeter，Jasco)。所有制剂中的蛋白质在40℃4周后和25℃8周后通常保持其三级结构。

3.2.9亚可见颗粒

在2-8℃储存8周后，测定DoE2制剂的亚可见颗粒。结果显示在表14中。在欧洲药典限制范围内发现该值(对于用标称含量小于100mL的容器提供的溶液而言)。

表14：2-8℃8周后DoE2制剂的亚可见颗粒

3.3机械应激

3.3.1生物分析仪的片段化

在300rpm 24小时后，在所有样品中观察到片段的轻微变化(高达5.0-6.5％)(表15)，所述变化与经测试的具体组合物没有特定的关系。

表15：振荡24小时后(300rpm；室温)，通过生物分析仪的DoE2制剂的片段(％)

3.3.2聚集物

机械震荡后没有观察到变化(表16)。

表16：振荡24小时后(300rpm；室温)，通过SE-HPLC的DoE2制剂的聚集物(％)

3.3.3 pH

机械震荡后没有观察到变化(表17)。

表17:振荡24小时后(300rpm；室温)DoE2制剂的pH值

3.4浊度

机械震荡后没有观察到变化(表18)。

表18：振荡24小时后(300rpm；室内温度)，DoE2制剂的浊度(NTU)

3.5 DoE2：结果

这些结果表明pH 5.2(从DoE1外推)没有影响片段化，并因此适于在稳定的制剂中使用。已证实，保留蛋白质稳定性的最佳pH范围为5.0-5.5(DoE1)。相反，5.6-5.7的pH值会导致较高的片段化。

甘露糖醇和二水合海藻糖导致相似的行为。

没有发现泊洛沙姆188优于Tween 20。

这些结果还表明，DoE2制剂中较高的蛋白质浓度(20mg/mL)是可行的且没有观察到的或预期的稳定性问题。

DoE2：在时间0时、在40℃4周后和在25℃8周后，根据同种异形体分布将制剂3(最优选并最终选定以进一步使用的是20mg/mL的配方)与参考制剂进行比较，以评估在不同条件下的稳定性时间中在两种制剂之间是否存在不同的行为。结果呈现在表19中。

表19：在时间0时、4周(40℃)后和8周(25℃)后，DoE2制剂3和参考制剂通过iCE280的同种异形体分布。

此外，25℃下的额外时间点(8周)突出表明，相对于参照制剂没有由于pH值降低而导致的主要问题。

实施例4-抗氧化剂(L-甲硫氨酸)的效果

由于在WO2013079174中公开的制剂中使用了甲硫氨酸，现Avelumab制剂的开发也旨在阐明该化合物作为抗氧化剂的影响。

将10mg/mL样品(来自DoE1组)用200μL 6％的H₂O₂进行2倍稀释，获得约5mg/mL的最终蛋白质浓度和3％的H₂O₂，并然后在5℃下孵育3h。在孵育结束时，使用4mL 10kDa的AmiconUltra(Millipore)将样品通过超速离心相对于水洗涤(每步骤1mL洗涤4次)。Amicon处理后的最终蛋白质浓度为约10mg/mL。

DoE1：除了存在L-甲硫氨酸外，制剂8与DoE2的参考配方相同：用两种配方中的H₂O₂进行强制氧化(在2-8℃3小时)，然后通过iCE280进行测试(氧化通常导致电泳图中更多酸性物质的增加)，且生物分析仪旨在确定两种制剂是否由于抗氧化剂的存在而引起任何差异。结果列于表20和21中。

表20：强制氧化处理后，DoE1制剂8和参考制剂的通过iCE280的同种异形体分布。上表：样品储存在2-8℃。下表：样品在40℃储存4周+在2-8℃储存6周。

观察到两种制剂(含或不含甲硫氨酸)的可比较的酸性簇丰度。

在这些样品中也测试通过生物分析仪的片段(表21)：观察到两种制剂(含或不含甲硫氨酸)的可比较的水平的片段化。

表21：强制氧化处理后，DoE1制剂8和参考制剂的通过生物分析仪的片段。

上表：样品储存在2-8℃。

下表：样品在40℃下储存4周，在2-8℃储存6周。

这些结果表明稳定Avelumab不需要抗氧化剂，并因此可从制剂中省略。

实施例5-长期稳定性研究

5.1药物产品组合物和强度(strength)

制造表22中列出的Avelumab制剂1、2、3、4和5并用于长期稳定性研究。制造过程包括混合，然后在最终灌装小瓶之前，通过0.22μm膜(测试了PES和PVDF过滤器)进行双重过滤消毒步骤。

制剂5对应于如实施例2和3中描述的也在DoE-1和-2研究中使用的参考制剂。

表22：DP组合物

制造时(时间0时)，测定重量摩尔渗透压浓度且发现其与期望值一致(范围：320-350mOsm/kg)。

5.2稳定性研究计划和持续时间

关于制剂的稳定性，表23中总结了研究时间表、储存条件和待应用的测试。对于每个时间点，表格表示了待测试的储存条件。

小瓶处于直立位置时进行样品的储存。

该研究将在40℃进行1个月，在加速条件下(25℃)进行6个月，并在长期条件下(2-8℃)进行12个月。

表23：稳定性计划

在40℃(长达1个月)、25℃(长达6个月)和2-8℃(长达12个月)收集数据。

5.3在2-8℃的稳定性

5.3.1目视检查的着色程度

没有观察到稳定性的变化。所有溶液都比最澄清的标准溶液更清晰(<Y7)。数值处在规范中。

5.3.2通过浊度法的浊度水平

所有溶液都显示包含在澄清溶液范围内的浊度(1-3 NTU)。数值处在规范中。

5.3.3 pH

没有观察到稳定性的变化。所有溶液都显示与目标一致的pH值(制剂1至4为5.2±0.1，参考DP为5.5±0.1)。数值处在规范中。

5.3.4通过OD的蛋白质含量

在研究期间发现制剂1和2的浓度(目标浓度＝20mg/mL)在18.7-19.8mg/mL的范围内(相对于目标±10％的范围内)，随时间没有显著变化。

在研究期间发现制剂3和4以及参考DP的浓度(目标浓度＝10mg/mL)在9.3-10.2mg/mL的范围内；没有发现显著变化。

因此，蛋白质含量在2-8℃12个月稳定期中保持不变(数值在说明书中)。

5.3.5通过SE-HPLC的二聚体和HMW

相对于时间0时，在2-8℃12个月内聚集没有变化。数值处在规范中。

5.3.6通过SDS-PAGE N-Red的片段(LMW)

如图11所示，样品显示了时间0时SDS-PAGE N-RED的LMW的值，其在11.9％-16.2％的范围内，随后在下一个点(8周)有+5-7％的增加，并且在其余的稳定期内(长达六个月)有较小的变化。

5.3.7亚可见颗粒

对于每个容器的亚可见颗粒，计数均低于美国、欧洲和日本药典针对用于标称含量小于100mL的输注或注射溶液设定的限值(每个容器6000个颗粒等于或大于10μm，每个容器600个颗粒等于或大于25μm)。

图12和图13分别显示了两种颗粒尺寸范围的相关条形图，分别表示≥10μm的亚可见颗粒和≥25μm的亚可见颗粒。

储存时的亚可见颗粒没有凸显的变化。

5.3.8生物学活性

对于在稳定性研究过程中测试的所有时间点，生物活性值通常在89-110％的范围内。储存时没有观察到下降。

5.3.9同种异形体模式

来自iCE280实验的结果显示于图14(酸性簇，峰1-2-3-4的总和)、图15(主峰)和图16(碱性簇，峰6-7的总和)中。同种异形体分布在12个月的稳定期内保持不变。在冷藏条件下，没有观察到pH对抗体的同种异形体的影响。

5.3.10在2-8℃的稳定性结果

在2-8℃的温度下12个月的稳定期内，没有发现经测试的五种制剂的物理化学性质发生显著变化。这对于同种异形体模式尤其令人惊讶，因为在制剂1至4中不存在甲硫氨酸。

5.4 2在5℃的稳定性

5.4.1目视检查的着色程度

没有观察到稳定性的变化。所有溶液都比最澄清的标准溶液更清澈(<Y7)。数值处在规范中。

5.4.2通过浊度法的浊度水平

所有溶液都显示包含1-3NTU(清澈溶液范围)之间的浊度。数值处在规范中。

5.4.3 pH

没有观察到稳定性的变化。所有溶液pH值都显示与目标一致(制剂1-2-3-4为5.2±0.1，参考DP为5.5±0.1)。数值处在规范中。

5.4.4通过OD的蛋白质含量

在研究期间发现制剂1和2的浓度(目标浓度＝20mg/mL)在18.5-20.0mg/mL的范围内(相对于目标在±10％的界限内)，随时间没有显著变化。

在研究期间发现制剂3和4以及参考DP的浓度(目标浓度＝10mg/mL)在9.5-10.0mg/mL范围内；没有发现显著变化。

因此，蛋白质含量在25℃六个月的稳定期中保持不变。数值处在规范中。

5.4.5通过SE-HPLC测定的二聚体和HMW

对于时间0时，在25℃6个月内的聚集没有变化。在整个研究中发现聚集低于规范限制(不超过5％)。

5.4.6通过SDS-PAGE N-Red测定的片段(LMW)

样品在时间0时显示的通过SDS-PAGE N-RED测定的LMW值在11.9-16.2％的范围内，随后在下一个点(4周)逐步增加，随后在剩余的稳定期内(长达6个月)有微小变化(图17)。

5.4.7亚可见颗粒

对于每个容器的亚可见颗粒，计数均低于由美国、欧洲和日本药典用于标称含量小于100mL的输注或注射溶液设定的限值(每个容器6000个颗粒等于或大于10μm，且每个容器600个颗粒等于或大于25μm)。相关的条形图如图18和图19所示。

在25℃稳定后，亚可见颗粒未凸显出变化。

5.4.8生物学活性

对于在稳定性研究过程中测试的所有时间点，生物活性值通常在90-110％的范围内。在25℃稳定后没有观察到降低。

5.4.9同种异形体模式

图20(酸性簇，峰1-2-3-4的总和)、图21(主峰)和图22(碱性簇，峰6-7的总和)显示了来自iCE280实验的结果。

酸性簇在25℃储存时趋于增加。所有样品在25℃6个月后都显示出酸性簇增加约+10％，且并发主峰(6个月后-5％)和碱性簇(6个月后-5％)的下降。

5.4.10在25℃的稳定性结果

在25℃6个月的稳定性，所测试的五种制剂在时间0时，在蛋白质含量、外观、透明度、pH、聚集物、亚可见颗粒和生物活性方面没有显示出变化。

在25℃6个月后，根据SDS-PAGE N-RED发现片段增加+5个百分点，而生物分析仪没有凸显出统计学显著的变化。

通过iCE280在同种异形体分布中的类似行为：在六个月的研究中，所有制剂的酸性簇倾向于增加+10％，并发主峰和碱性簇的减少。

5.5在40℃的稳定性

5.5.1目视检查的着色程度

没有观察到稳定性的变化。所有溶液都比最澄清的标准溶液(＜Y7)更清澈。

5.5.2通过浊度法测定的浊度水平

没有观察到稳定性的变化。所有溶液都显示包含2NTU(澄清溶液的范围)的浊度。数值处在规范中。

5.5.3 pH

没有观察到稳定性的变化。所有溶液都显示与目标一致的pH值(制剂1-2-3-4为5.2±0.1，且参考DP为5.5±0.1)。数值处在规范中。

5.5.4通过OD测定的蛋白质含量

在研究期间发现制剂1和2的浓度(目标浓度＝20mg/mL)在18.0-19.0mg/mL的范围内(相对于目标的±10％的界限内)，随着时间的推移没有蛋白质损失的倾向。

在研究期间发现制剂3和4以及参考DP的浓度(目标浓度＝10mg/mL)在9.5-10.0mg/mL的范围内，随着时间的推移没有蛋白质损失的倾向。数值处在规范中。

总之，热应激对测试条件下的蛋白质含量没有不利影响(在40℃长达1个月)。

5.5.5通过SE-HPLC测定的二聚体和HMW

1个月后聚集没有发生显著变化。在1个月后所有值低于1％总聚集物(低于不超过5％的规范限制)。

5.5.6通过SDS-PAGE N-Red、生物分析仪测定的片段(LMW)

鉴于SOS-PAGE N-RED方法的多样性(例如，分别针对DP 01-190214和DP 02-190214确定了时间0时的值11.9和14.5)，可得出结论：在40℃研究期间没有发生重大变化(图23)。

5.5.7亚可见颗粒

对于每个容器的亚可见颗粒，计数均低于由美国、欧洲和日本药典设定的用于标称含量小于100mL(每个容器6000个颗粒等于或大于10μm，且每个容器600个颗粒等于或大于25μm)的输注或注射溶液的限值。相关的条形图如图24和图25所示。

在热应激下没有凸显出亚可见颗粒的变化。

5.5.8生物学活性

对于在稳定性研究过程中所有测试的时间点，生物活性值通常在99-120％的范围内。热应激时在样品中没有观察到下降。

5.5.9同种异形体模式

图26(酸性簇，峰1-2-3-4的总和)、图27(主峰)和图28(碱性簇，峰6-7的总和)显示了来自iCE280实验的结果。

在40℃储存时，酸性簇趋于增加。

主峰变化(Fehler！Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.)证实了新配方在10mg/mL时的稳定性略好，且其余组合物的行为相同。

用碱性簇确定获得的结果证实了上述的结果。

长达两个星期，在五种组合物中观察到了类似的行为。在较高稳定性时间内，在20mg/mL和10mg/mL Avelumab DP之间出现轻微分化(在10mg/mL的配方中有稍好的抗性)。

5.5.10在40℃的稳定性结果

在40℃时(1个月)，相对于时间0，经测试的五种制剂在蛋白质含量、外观、透明度、pH、聚集物、亚可见颗粒和生物活性方面没有变化。

通过iCE280凸显出了10mg/mL和20mg/mL DP制剂之间的小差异(酸性簇倾向于在储存时经历一些增加，在20mg/mL比在10mg/mL DP制剂中更明显)。

5.6结论

5.6.1在2-8℃的稳定性(12个月)

发现所有制剂都是稳定的：未观测到外观、浊度(通过浊度法测定)、亚可见颗粒、pH、蛋白质含量(通过OD测定)、聚集(通过SE-HPLC测定)、片段(通过SDS-PAGE N-RED和生物分析仪测定)、同种异形体分布(通过iCE280测定)和生物活性(通过生物测定)方面相对于时间0的显著变化。

5.6.2在25℃的稳定性(6个月)

相对于时间0，蛋白质含量、外观、透明度、pH值、聚集物、亚可见颗粒和生物活性方面没有变化。

在25℃6个月后根据SDS-PAGE N-RED发现片段增加了+5％，而通过Bioanalyzer(一种用作附加工具的方法，用于增加片段化发生结论的稳健性)没有凸显出统计学上的显著变化。

通过iCE280观察到同种异形体分布的类似行为：在六个月的研究中，所有制剂的酸性簇趋于增加+10％，并发主峰和碱性簇的减少。

5.6.3在40℃的稳定性(1个月)

相对于时间0，蛋白质含量、外观、透明度、pH、聚集物、亚可见颗粒和生物活性方面没有变化。

通过iCE280凸显出了10mg/mL和20mg/mL DP制剂之间的小差异(酸性簇趋于在储存时经历一些增加，在20mg/mL比在10mg/mL的DP制剂中更明显一些)。

5.7 24个月的稳定性

5.7.1 DP组合物的制备

制备以下DP组合物并在24个月的时间内研究它们的稳定性：

表24：DP组合物

*对应于10mM乙酸钠

**最终pH为5.2

两种制剂都对应于如表22中所示的制剂DP 01-190214。唯一的区别是当与0.6mg/mL的冰醋酸组合时，使用固定量的0.3mg/mL(7.5mM)的氢氧化钠产生5.2的pH。制剂DP 01-160414和DP 02-160414之间的唯一区别在于后一制剂的体积为30mL每小瓶，而前者为10mL每小瓶。

两种制剂通过0.22μm PVDF膜双重过滤，然后人工填充到小瓶中。在过滤之前和之后测试蛋白质含量；相关结果表明双重无菌过滤时没有发生蛋白质损失。

已经在相应的最终容器(小瓶)中收集了两种制剂的长达24个月(在+5±3℃)和长达6个月(在+25℃±2℃(RH60％±5％))的稳定性数据。

5.7.2长达24个月的稳定性(在+5±3℃)

长达24个月在+5±3℃，没有观察到蛋白质含量(通过OD测定)、HMW(通过SE-HPLC测定)、浊度(通过浊度测定法测定)、颗粒形成(通过光遮蔽测定)、着色度水平(通过视觉检查测定)和生物效能的变化。酸性同种异形体略有增加(2年后所有组合物均观察到+5％)。在通过SDS-PAGE N-RED、生物分析和CE-SDS N-RED测定的片段化方面没有观察到统计学显著的变化。

5.7.3在+25℃±2℃(RH 60％±5％)下长达6个月的稳定性

在+25℃±2℃(RH 60％±5％)长达6个月，没有观察到蛋白质含量(通过OD测定)、HMW(通过SE-HPLC测定)、浊度(通过浊度法测定)、颗粒形成(通过光遮蔽测定)、同种异形体分布(通过iCE280测定)、着色水平(通过目视检查测定)、电泳纯度(通过SDS/-PAGE RED)和生物效能的变化。类似于在5℃的稳定性，在+25℃±2℃(RH 60％±5％)(在生物分析仪上证实的结果)没有观察到统计学上显著的片段化增加。

5.7.4保持时间

过滤之前保持时间(袋内，在室温下多至24小时)、过滤之后保持时间(袋内，室温下多至72小时)和摇动(在室温下200rpm多至24小时)显示出蛋白质含量、颗粒形成、聚集物和浊度没有显著的变化，因此表明在制备过程中通常考虑的标准操作时间内可能不会出现重大问题。

5.7.5冷冻/解冻研究

冷冻/解冻研究证明，经测试的制剂可安全地在-80℃冷冻，并然后升温至+5±3℃或+25℃，蛋白质没有发生重大变化。

序列表

<110> 默克专利股份有限公司

<120> 含抗-PD-1抗体AVELUMAB的水性药物制剂

<130> P 15/241

<160> 3

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Heavy chain sequence of Avelumab

<400> 1

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 2

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Heavy chain sequence of Avelumab, lacking the C-terminal K

<400> 2

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 3

<211> 216

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Light chain sequence of Avelumab

<400> 3

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

Claims (42)

1.一种水性药物抗体制剂，其包含：

(i)浓度为1mg/mL至30mg/mL的Avelumab作为抗体；

(ii)浓度为5mM至15mM的乙酸盐或组氨酸作为缓冲剂；

(iii)浓度为240mM至320mM的D-甘露糖醇或海藻糖，或浓度为50mM至150mM的盐酸精氨酸和浓度为25mM至75mM的谷氨酸的组合，作为稳定剂；

(iv)浓度为0.25mg/mL-0.75mg/mL的泊洛沙姆188或聚山梨醇酯20作为表面活性剂，或不含表面活性剂；

其中所述制剂不包含甲硫氨酸，并且

另外其中所述制剂的pH值为5.0至6.0。

2.权利要求1所述的制剂，其中所述pH为5.0至5.6。

3.权利要求1或2所述的制剂，其中所述Avelumab的浓度为约10mg/mL至约20mg/mL。

4.权利要求1-3中任一项所述的制剂，其中所述乙酸盐或组氨酸的浓度为约10mM。

5.权利要求1-3中任一项所述的制剂，其中所述D-甘露糖醇或海藻糖的浓度为约280mM，或者对于所述盐酸精氨酸和谷氨酸的组合，所述盐酸精氨酸的浓度为约150mM，且所述谷氨酸的浓度为约50mM。

6.权利要求1-3中任一项所述的制剂，其中所述泊洛沙姆188或聚山梨醇酯20的浓度为约0.5mg/mL。

7.权利要求1-3中任一项所述的制剂，其中所述pH为5.2(±0.1)至5.5(±0.1)。

8.权利要求1-7中任一项所述的制剂，其包含浓度为约10mM的乙酸盐，且不包含任何其他缓冲剂。

9.权利要求1-8中任一项所述的制剂，其包含浓度为约280mM的D-甘露糖醇或海藻糖，且不包含任何其他稳定剂。

10.权利要求1-9中任一项所述的制剂，其包含浓度为约0.5mg/mL的聚山梨醇酯20或泊洛沙姆188，且不包含任何其它表面活性剂。

11.一种水性药物抗体制剂，其包含：

(i)浓度约10mg/mL的Avelumab作为抗体；

(ii)浓度为约10mM的乙酸盐作为缓冲剂；

(iii)浓度为约280mM的D-甘露糖醇或海藻糖作为稳定剂；

(iv)浓度为约0.5mg/mL的聚山梨醇酯20或泊洛沙姆188作为表面活性剂；

其中所述制剂不包含甲硫氨酸，并且

进一步地其中所述制剂的pH值为5.5(±0.1)。

12.权利要求9所述的制剂，其包含：

(i)浓度为10mg/mL的Avelumab；

(ii)浓度为10mM的乙酸盐；

(iii)浓度为280mM的D-甘露糖醇或海藻糖；

(iv)浓度为0.5mg/mL的聚山梨醇酯20或泊洛沙姆188；

其中所述制剂的pH值为5.5(±0.1)。

13.权利要求10所述的制剂，其由以下组成：

(i)浓度为10mg/mL的Avelumab；

(ii)浓度为10mM的三水合乙酸钠；

(iii)浓度为280mM的D-甘露糖醇或海藻糖；

(iv)浓度为0.5mg/mL的聚山梨醇酯20或泊洛沙姆188；

(v)用以调节pH值的HCl；

(vi)作为溶剂的水(注射用)；

其中所述制剂的pH值为5.5(±0.1)。

14.权利要求13所述的制剂，其由以下组成：

(i)浓度为10mg/mL的Avelumab；

(ii)浓度为10mM的三水合乙酸钠；

(iii)浓度为280mM的二水合海藻糖；

(iv)浓度为0.5mg/mL的聚山梨醇酯20；

(v)用以调节pH值的HCl；

(vi)作为稀释剂的水(注射用)；

其中所述制剂的pH值为5.5(±0.1)。

15.权利要求11所述的制剂，其由以下组成：

(i)浓度为10mg/mL的Avelumab；

(ii)浓度为10mM的三水合乙酸钠；

(iii)浓度为280mM的D-甘露糖醇；

(iv)浓度为0.5mg/mL的聚山梨醇酯20；

(v)用于调节pH值的HCl；

(vi)作为稀释剂的水(注射用)；

其中所述制剂的pH值为5.5(±0.1)。

16.权利要求1所述的制剂，其包含：

(i)浓度为约20mg/mL的Avelumab作为抗体；

(ii)浓度为约10的mM的乙酸盐作为缓冲剂；

(iii)浓度为约280mM的D-甘露糖醇或海藻糖作为稳定剂；

(iv)浓度为约0.5mg/mL的聚山梨醇酯20或泊洛沙姆188作为表面活性剂；

其中所述制剂的pH值为5.2(±0.1)。

17.权利要求16所述的制剂，其包含：

(i)浓度为20mg/mL的Avelumab；

(ii)浓度为10mM的乙酸盐；

(iii)浓度为280mM的D-甘露糖醇或海藻糖；

(iv)浓度为0.5mg/mL的聚山梨醇酯20或泊洛沙姆188；

其中所述制剂的pH值为5.5(±0.1)。

18.权利要求1-12、16或17中任一项所述的制剂，其中所述制剂不包含抗氧化剂。

19.权利要求1 6所述的制剂，其由以下组成：

(i)浓度为20mg/mL的Avelumab；

(ii)浓度为10mM的乙酸；

(iii)浓度为280mM的D-甘露糖醇或二水合海藻糖；

(iv)浓度为0.5mg/mL的聚山梨醇酯20或泊洛沙姆188；

(v)用于调节pH值的乙酸钠；

(vi)作为稀释剂的水(注射用)；

其中所述制剂的pH值为5.2(±0.1)。

20.权利要求19所述的制剂，其由以下组成：

(i)浓度为20mg/mL的Avelumab；

(ii)浓度为10mM的乙酸；

(iii)浓度为280mM的D-甘露糖醇；

(iv)浓度为0.5mg/mL的聚山梨醇酯20；

(v)用于调节pH值的乙酸钠；

(vi)作为稀释剂的水(注射用)；

其中所述制剂的pH值为5.2(±0.1)。

21.权利要求19所述的制剂，其由以下组成：

(i)浓度为20mg/mL的Avelumab；

(ii)浓度为10mM的乙酸；

(iii)浓度为280mM的二水合海藻糖；

(iv)浓度为0.5mg/mL的聚山梨醇酯20；

(v)用于调节pH值的乙酸钠；

(vi)作为稀释剂的水(注射用)；

其中所述制剂的pH值为5.2(±0.1)。

22.权利要求19所述的制剂，其由以下组成：

(i)浓度为20mg/mL的Avelumab；

(ii)浓度为10mM的乙酸；

(iii)浓度为280mM的D-甘露糖醇；

(iv)浓度为0.5mg/mL的泊洛沙姆188；

(v)用于调节pH值的乙酸钠；

(vi)作为稀释剂的水(注射用)；

其中所述制剂的pH值为5.2(±0.1)。

23.权利要求19所述的制剂，其由以下组成：

(i)浓度为20mg/mL的Avelumab；

(ii)浓度为10mM的乙酸；

(iii)浓度为280mM的二水合海藻糖；

(iv)浓度为0.5mg/mL的泊洛沙姆188；

(v)用于调节pH值的乙酸钠；

(vi)作为稀释剂的水(注射用)；

其中所述制剂的pH值为5.2(±0.1)。

24.权利要求16所述的制剂，其由以下组成：

(i)浓度为20mg/mL的Avelumab；

(ii)浓度为10mM的乙酸；

(iii)浓度为280mM的D-甘露糖醇；

(iv)浓度为0.5mg/mL的聚山梨醇酯20；

(v)浓度为7.5mM的氢氧化钠；

(vi)作为稀释剂的水(注射用)；

其中所述制剂的pH值为5.2(±0.1)。

25.权利要求24所述的制剂，其中所述制剂通过组合以下而制成：

(i)20mg/mL的Avelumab；

(ii)0.6mg/mL的冰醋酸；

(iii)51mg/mL的D-甘露糖醇；

(iv)0.5mg/mL聚山梨醇酯20；

(v)0.3mg/mL的氢氧化钠；

(vi)作为稀释剂的水(注射用)。

26.权利要求2的制剂，其由以下组成：

(i)浓度为20mg/mL的Avelumab；

(ii)浓度为0.6mg/mL的乙酸；

(iii)浓度为51mg/mL的D-甘露糖醇；

(iv)浓度为0.5mg/mL的聚山梨醇酯20；

(v)浓度为0.3mg/mL的氢氧化钠；

(vi)作为稀释剂的水(注射用)；

其中所述制剂的pH值为5.0至5.6。

27.一种水性药物抗体制剂，其由作为活性成分的浓度为20mg/mL的Avelumab；和作为赋形剂的冰醋酸、D-甘露糖醇、聚山梨醇酯20、氢氧化钠和注射用水组成；其中所述制剂的pH值为5.0至5.6。

28.权利要求27所述的制剂，其pH值为5.2(±0.1)。

29.权利要求1-28中任一项所述的制剂，其中所述Avelumab具有(SEQ ID NO:1)或(SEQID NO:2)的重链序列，(SEQ ID NO:3)的轻链序列，以及在Asn300上携带糖基化，所述糖基化包含FA2和FA2G1作为主要聚糖物质，其联合份额占所有聚糖物质的70％以上。

30.权利要求29所述的制剂，其中在Avelumab糖基化中，所述FA2占所有聚糖物质的44％至54％，且所述FA2G1占所有聚糖物质的25％至41％。

31.权利要求30所述的制剂，其中在Avelumab糖基化中，所述FA2占所有聚糖物质的47％至52％，且所述FA2G1占所有聚糖物质的29％至37％。

32.权利要求29所述的制剂，其中在所述Avelumab糖基化中，所述FA2占所有聚糖物质的约49％，且所述FA2G1占所有聚糖物质的约30％至约35％。

33.权利要求29-32中任一项所述的制剂，其中所述Avelumab糖基化还包含作为次要聚糖物质的占所有聚糖物质的5％以下的A2、占所有聚糖物质的5％以下的A2G1、占所有聚糖物质的5％以下的A2G2和占所有聚糖物质的7％以下的FA2G2。

34.权利要求33所述的制剂，其中在所述Avelumab糖基化中，所述A2占所有聚糖物质的3％至5％，所述A2G1占所有聚糖物质的4％以下，所述A2G2占所有聚糖物质的3％以下并且所述FA2G2占所有聚糖物质的5％至6％。

35.权利要求34所述的制剂，其中在所述Avelumab糖基化中，所述A2占所有聚糖物质的约3.5％至约4.5％，所述A2G1占所有聚糖物质的约0.5％至约3.5％，所述A2G2占所有聚糖物质的2.5％以下并且所述FA2G2占所有聚糖物质的约5.5％。

36.权利要求29-35中任一项所述的制剂，其中所述Avelumab具有(SEQ ID NO:2)的重链序列。

37.权利要求1-36中任一项所述的制剂，其用于静脉内(IV)施用。

38.小瓶，其含有权利要求37所述的制剂。

39.权利要求38所述的小瓶，其在10mL溶液中含有200mg的Avelumab，浓度为20mg/mL。

40.权利要求38或39所述的小瓶，其为玻璃小瓶。

41.一种治疗癌症的方法，其包括向患者施用权利要求1-37中任一项所述的制剂。

42.权利要求41所述的方法，其中所述癌症选自非小细胞肺癌、尿路上皮癌、膀胱癌、间皮瘤、梅克尔细胞癌、胃癌或胃食管交界癌、卵巢癌、乳腺癌、胸腺瘤、胃腺癌、肾上腺皮质癌、头颈部鳞状细胞癌、肾细胞癌、黑素瘤和/或经典霍奇金淋巴瘤。