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一种抗干扰碱试剂及其制备、使用方法 Download PDF

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Abstract

一种抗干扰碱试剂，组分包括：氢氧化钾、氯化钠、聚戊二烯、双甘氨酸、乙撑亚胺聚合体、氯化钙、氯化镁和曲拉通X‑100。以上组分可增强血清的均一性及稳定性，同时能去除血清中存在许多蛋白酶、凝血因子、球蛋白，最大程度降低这些蛋白酶干扰鲎试剂试验，大力提高抗干扰能力，得到理想的回收率；同时配方成分中的氯化钙、氯化镁又可最大程度激活鲎试剂的酶反应，大力提高内毒素与鲎试剂的反应能力；此外，该碱试剂使用后还添加Tris‑HCl缓冲液，使得被检测血清更具有均一性及稳定性，不和内毒素发生交叉反应，最大限度保护了内毒素结构，可更为准确检测出内毒素浓度。

Description

一种抗干扰碱试剂及其制备、使用方法
技术领域
本发明涉及生物医药鲎试剂检测领域，具体涉及一种抗干扰碱试剂及其制备、使用方法。
背景技术
鲎试剂检测试剂盒已经应用于临床上多年，可用于检测人血清中的内毒素。由于人血清中存在许多蛋白酶、凝血因子、球蛋白。而鲎试剂本身也是丝氨酸蛋白酶水解反应的一个过程，也就是鲎试剂由于内毒素作用激活鲎试剂中蛋白酶使他们产生逐渐水解反应。而人血液中这些蛋白酶会干扰鲎试剂试验。目前医院在鲎试剂检测前大多采用加热稀释法对血清样品处理，加热稀释法很难完全除去血清中干扰物质(人血清中存在许多蛋白酶、凝血因子、球蛋白等)，也会影响检测的准确性，致使检测结果呈假阴性或假阳性。其次，由于内毒素化学结构为含有3个截然不同的区域：O特异侧链、核心多糖、类脂A。核心多糖和类脂之间有KDO键相连，类脂A是以脂化的葡萄糖胺二糖通过焦磷酸酯组成的糖脂化,加热稀释法处理血清样本，由于加热可能破坏内毒素的化学结构，使脂多糖KDO键断开，降低细菌内毒素活性，从而影响检测结果，可能出现假阴性现象。
目前，还有一种KOH碱法对血清进行前处理。但KOH碱法只含氢氧化钾与氯化钠，不能完全除去血液中干扰物质，该方法回收率在50-60％范围内，也会影响检测的准确性，致使检测结果呈假阴性。另外用KOH碱法处理血清后，部分残留成分抑制了内毒素与鲎试剂的酶反应，也致使检测结果呈假阴性。
发明内容
为此，需要提供一种能去除血液中干扰物质，同时不破坏血液中内毒素，同时回收率高的碱试剂。
为实现上述目的，发明人提供了一种抗干扰碱试剂，所述碱试剂组分包括：氢氧化钾、氯化钠、聚戊二烯、双甘氨酸、乙撑亚胺聚合体、氯化钙、氯化镁和曲拉通X-100。
进一步的，所述氢氧化钾的最终浓度为0.05-0.1mol/L、氯化钠的最终浓度为0.1-0.2mol/L、双甘氨酸的最终浓度为0.02-0.04mol/L、乙撑亚胺聚合体的最终浓度为0.01-0.05mol/L、氯化钙最终浓度为0.01-0.02mol/L、氯化镁最终浓度为0.04-0.06mol/L、曲拉通X-100最终浓度为0.0015-0.0046mol/L、聚戊二烯最终浓度为0.15-0.44mol/L。
进一步的，所述氢氧化钾的最终浓度为0.08mol/L、氯化钠的最终浓度为0.15mol/L、双甘氨酸的最终浓度为0.03mol/L、乙撑亚胺聚合体的最终浓度为0.03mol/L、氯化钙最终浓度为0.01mol/L、氯化镁最终浓度为0.05mol/L、曲拉通X-100最终浓度为0.003mol/L、聚戊二烯最终浓度为0.3mol/L。
发明人还提供了上述方案所述抗干扰碱试剂的制备方法，包括以下步骤：
向曲拉通X-100溶液中依次加入氢氧化钾、氯化钠、聚戊二烯、双甘氨酸、乙撑亚胺聚合体、氯化钙、氯化镁后搅拌均匀，制备成抗干扰碱试剂,其中曲拉通X-100最终浓度为0.0015-0.0046mol/L,氢氧化钾的最终浓度为0.05-0.1mol/L、氯化钠的最终浓度为0.1-0.2mol/L、双甘氨酸的最终浓度为0.02-0.04mol/L、乙撑亚胺聚合体的最终浓度为0.01-0.05mol/L、氯化钙最终浓度为0.01-0.02mol/L、氯化镁最终浓度为0.04-0.06mol/L、聚戊二烯最终浓度为0.15-0.44mol/L
发明人还提供了一种抗干扰碱试剂的使用方法，所述抗干扰碱试剂的使用方法包括以下步骤：
在1倍体积待检测血清中加入3-5倍体积权利要求1-3任一所述的抗干扰碱试剂，37℃水浴10min后，加入4-6倍体积Tris-HCl缓冲液混合均匀后加入鲎试剂进行内毒素检测。
进一步的，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为5.8-6.2。
区别于现有技术，上述技术方案碱试剂法组分为氢氧化钾、氯化钠、聚戊二烯、双甘氨酸、乙撑亚胺聚合体、氯化钙、氯化镁和曲拉通X-100，以上组分可增强血清的均一性及稳定性，同时能去除血清中存在许多蛋白酶、凝血因子、球蛋白，最大程度降低这些蛋白酶干扰鲎试剂试验，大力提高抗干扰能力，得到理想的回收率；同时配方成分中的氯化钙、氯化镁又可最大程度激活鲎试剂的酶反应，大力提高内毒素与鲎试剂的反应能力；此外，该配方碱试剂血清处理液制备程序上添加Tris-HCl缓冲液，Tris-HCl缓冲液既可以中和碱试剂，又是一种不会影响蛋白酶活性的缓冲液，使得被检测血清更具有均一性及稳定性，最大限度保护了内毒素结构和鲎试剂中的蛋白酶，可更为准确检测出内毒素浓度。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例详予说明。
实施例1
向1L的0.003mol/L曲拉通X-100溶液中依次加入0.08mol氢氧化钾、0.15mol氯化钠、0.3mol聚戊二烯、0.03mol双甘氨酸、0.03mol乙撑亚胺聚合体、0.01mol氯化钙、0.05mol氯化镁后搅拌均匀，制备抗干扰碱试剂1。
在100μL待检测血清中加入400μL实施例1制备的抗干扰碱试剂，37℃水浴10min后，加入500μL Tris-HCl缓冲液(0.2N，pH6.0)混合均匀后，用细菌内毒素检测试剂盒测定内毒素含量。
对比实施例1
取待测血清100μL用900μL检查用水稀释后，75℃水浴10min后，用鲎试剂细菌内毒素检测试剂盒测定内毒素含量。
对比实施例2
采用市售碱试剂(组分为KOH、NaCl)，
取待测血清100μL用400μL市售碱试剂稀释后，37℃水浴10min后，加入500μLTris-HCl缓冲液(0.2N，pH6.0)混合均匀后，用鲎试剂细菌内毒素检测试剂盒测定内毒素含量。
对比实施例3
向1L水中依次加入0.08mol氢氧化钾、0.15mol氯化钠、0.3mol聚戊二烯、0.03mol双甘氨酸后搅拌均匀，制备成对比实施例3碱试剂。
取待测血清100μL用400μL对比实施例3碱试剂稀释后，37℃水浴10min后，加入500μL Tris-HCl缓冲液(0.2N，pH6.0)混合均匀后，用鲎试剂细菌内毒素检测试剂盒测定内毒素含量。
其中，待检测血清分为血清a、血清b和血清c，其配置方法如下：
1)90μL血清+10μL检查用水→100μL血清样本内含内毒素(血清a)
2)90μL血清+10μL 1EU/mL内毒素溶液→100μL含外加0.100EU/mL内毒素的血清(血清b)
3)90μL血清+10μL 0.500EU/mL内毒素溶液→100μL含外加0.050EU/mL内毒素的血清(血清c)
对比实施例1检测结果如下：
血清a 血清b 血清c
OD1值 0.1750 0.4480 0.3070
OD2值 0.1750 0.4460 0.3040
OD均值 0.1750 0.4470 0.3055
内毒素浓度(EU/ml) 0.0808 0.2586 0.1661
回收率 177.8％ 170.6％
对比实施例2检测结果如下：
血清a 血清b 血清c
OD1值 0.1450 0.2250 0.1910
OD2值 0.1450 0.2360 0.1890
OD均值 0.1450 0.2305 0.1900
内毒素浓度(EU/ml) 0.0612 0.1171 0.0906
回收率 55.9％ 58.8％
对比实施例3检测结果如下：
血清① 血清② 血清③
OD1值 0.149 0.263 0.199
OD2值 0.148 0.266 0.203
OD均值 0.1485 0.2645 0.2010
内毒素浓度(EU/ml) 0.0635 0.1393 0.0978
回收率 75.8％ 68.6％
实施例1检测结果如下：
血清① 血清② 血清③
OD1值 0.1560 0.3220 0.2330
OD2值 0.1580 0.3240 0.2320
OD均值 0.1570 0.3230 0.2325
内毒素浓度 0.0690 0.1776 0.1184
回收率 108.5％ 98.7％
其中，回收率试验结果总结如下：
由上表可以看出，当用对比实施例1高温稀释法对样品处理血清时，回收率在170.6％-177.8％,回收率虽然在回收率在药典50％-200％范围内，但已明显很多干扰物质无法去除，回收率不好；当对比实施例2市售的碱试剂处理血清时，该配方的碱试剂使血清样本得不到有效处理，回收率在药典50％-200％范围内,但是回收率很不理想，在55.9％-58.8％范围内，也会影响检测的准确性，致使检测结果呈假阴性；当对比实施例3碱试剂处理血清时，可提高回收率至68.6％-75.8％，对回收率和准确性有所改善，但效果仍不太理想；而采用本方案的碱试剂处理血清，得到理想的回收率在98.7％-108.5％。
实施例2
向1L的0.0015mol/L曲拉通X-100溶液中依次加入0.05mol氢氧化钾、0.1mol氯化钠、0.15mol聚戊二烯、0.02mol双甘氨酸、0.01mol乙撑亚胺聚合体、0.01mol氯化钙、0.04mol氯化镁后搅拌均匀，制备抗干扰碱试剂2。
实施例3
向1L的0.0015mol/L曲拉通X-100溶液中依次加入0.1mol氢氧化钾、0.2mol氯化钠、0.44mol聚戊二烯、0.04mol双甘氨酸、0.05mol乙撑亚胺聚合体、0.02mol氯化钙、0.06mol氯化镁后搅拌均匀，制备抗干扰碱试剂3。
本发明的抗干扰碱试剂配方是发明人以KOH碱法配方为基础，针对KOH碱法的各种问题，经过反复的创造性思考和试验中得到，能去除血液中干扰物质，同时不破坏血液中内毒素，不和后续的鲎试剂产生交叉反应，产生假阳性或假阴性结果，同时回收率高的碱试剂。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (6)

1.一种抗干扰碱试剂，其特征在于，所述碱试剂组分包括：氢氧化钾、氯化钠、聚戊二烯、双甘氨酸、乙撑亚胺聚合体、氯化钙、氯化镁和曲拉通X-100。
2.根据权利要求1所述抗干扰碱试剂，其特征在于，所述氢氧化钾的最终浓度为0.05-0.1mol/L、氯化钠的最终浓度为0.1-0.2mol/L、双甘氨酸的最终浓度为0.02-0.04mol/L、乙撑亚胺聚合体的最终浓度为0.01-0.05mol/L、氯化钙最终浓度为0.01-0.02mol/L、氯化镁最终浓度为0.04-0.06mol/L、曲拉通X-100最终浓度为0.0015-0.0046mol/L、聚戊二烯最终浓度为0.15-0.44mol/L。
3.根据权利要求2所述抗干扰碱试剂，其特征在于，所述氢氧化钾的最终浓度为0.08mol/L、氯化钠的最终浓度为0.15mol/L、双甘氨酸的最终浓度为0.03mol/L、乙撑亚胺聚合体的最终浓度为0.03mol/L、氯化钙最终浓度为0.01mol/L、氯化镁最终浓度为0.05mol/L、曲拉通X-100最终浓度为0.003mol/L、聚戊二烯最终浓度为0.3mol/L。
4.权利要求1-3任一所述抗干扰碱试剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
向曲拉通X-100溶液中依次加入氢氧化钾、氯化钠、聚戊二烯、双甘氨酸、乙撑亚胺聚合体、氯化钙、氯化镁后搅拌均匀，制备成抗干扰碱试剂,其中曲拉通X-100最终浓度为0.0015-0.0046mol/L,氢氧化钾的最终浓度为0.05-0.1mol/L、氯化钠的最终浓度为0.1-0.2mol/L、双甘氨酸的最终浓度为0.02-0.04mol/L、乙撑亚胺聚合体的最终浓度为0.01-0.05mol/L、氯化钙最终浓度为0.01-0.02mol/L、氯化镁最终浓度为0.04-0.06mol/L、聚戊二烯最终浓度为0.15-0.44mol/L。
5.权利要求1-3任一所述抗干扰碱试剂的使用方法，其特征在于，所述抗干扰碱试剂的使用方法包括以下步骤：
在1倍体积待检测血清中加入3-5倍体积权利要求1-3任一所述的抗干扰碱试剂，37℃水浴10min后，加入4-6倍体积Tris-HCl缓冲液混合均匀后加入鲎试剂进行内毒素检测。
6.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为5.8-6.2。
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