CN108342470A - mtDNA检测试剂在制备供肾损伤程度或移植肾功能的诊断试剂盒中的用途及诊断试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了mtDNA检测试剂在制备供肾损伤程度或移植肾功能的诊断试剂盒中的用途及诊断试剂盒，涉及医疗卫生技术领域。其通过将血浆中线粒体DNA的检测试剂用在制备供肾损伤程度的诊断试剂盒及移植肾功能的诊断试剂盒中，能够使肾损伤程度和移植肾功能的诊断过程更加简便易行，无需切取肾组织进行检测，是一种无创伤的药物检测方法，检测成本显著降低。本发明中提供的一种供肾损伤程度的诊断试剂盒及移植肾功能的诊断试剂盒，均包括血浆中线粒体DNA的检测试剂，诊断效果可靠性强，且诊断成本低。

Description

mtDNA检测试剂在制备供肾损伤程度或移植肾功能的诊断试 剂盒中的用途及诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及一种医疗卫生技术领域，且特别涉及mtDNA检测试剂在制备供肾损伤程度或移植肾功能的诊断试剂盒中的用途及诊断试剂盒。
背景技术
肾移植是一种治疗终末期肾脏病患者最有效的办法，供肾质量的好坏不仅在肾脏分配中起着重要的作用，而且在预测患者术后移植肾功能恢复的快慢及受者长期的肌酐水平中起着重要的作用。目前在供肾质量的评估中，供肾零点穿刺是判断供肾质量好坏的常用方法，零点穿刺即在获取完供肾后，切取部分肾脏组织行冰冻病理组织学检查，经病理学专家阅读病理切片后，根据损伤的肾小球及肾小管程度判断供肾质量的等级。
但是，现有的检测方法存在着以下几点不足：(1)有创性:切取部分的供肾组织会损伤肾脏，并增加肾移植手术的风险；(2)费用高：行移植肾穿刺活检，需要行病理实验；(3)等待时间延长：在行供体穿刺活检的行病理检查的过程中，增加了手术的等待时间；(4)技术要求高：需要专业的病理学专家阅片。
发明内容
本发明的目的在于提供血浆中线粒体DNA的检测试剂在制备供肾损伤程度的诊断试剂中的用途，旨在克服现有肾损伤程度检测方法的不足，降低损伤和检测成本。
本发明的另一目的在于提供血浆中线粒体DNA的检测试剂在制备移植肾功能的诊断试剂盒中的用途，旨在降低检测移植肾功能的损伤和检测成本。
本发明的第三目的在于提供一种供肾损伤程度的诊断试剂盒，其包括血浆中线粒体DNA的检测试剂，检测方法简便易行，适于广泛推广应用。
本发明的第四目的在于提供一种移植肾功能的诊断试剂盒，其同样检测方法易行，能够降低检测过程中的损伤及检测成本。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出了血浆中线粒体DNA的检测试剂在制备供肾损伤程度的诊断试剂盒中的用途。
本发明还提出了血浆中线粒体DNA的检测试剂在制备移植肾功能的诊断试剂盒中的用途。
本发明还提出一种供肾损伤程度的诊断试剂盒，包括血浆中线粒体DNA的检测试剂。
本发明还提出一种移植肾功能的诊断试剂盒，包括血浆中线粒体 DNA的检测试剂。
本发明实施例提供的mtDNA检测试剂在制备供肾损伤程度或移植肾功能的诊断试剂盒中的用途及诊断试剂盒有益效果是：其通过将血浆中线粒体DNA的检测试剂用在制备供肾损伤程度的诊断试剂盒及移植肾功能的诊断试剂盒中，能够使肾损伤程度和移植肾功能的诊断过程更加简便易行，无需切取肾组织进行检测，是一种无创伤的药物检测方法，检测成本显著降低。本发明中提供的一种供肾损伤程度的诊断试剂盒及移植肾功能的诊断试剂盒，均包括血浆中线粒体 DNA的检测试剂，试剂盒的制备成本低，诊断效果可靠性强。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为血浆线粒体DNA含量对肾脏损伤程度预测作用的测试结果图；
图2为供体血浆线粒体DNA含量对移植肾功能的恢复情况预测作用的测试结果图；
图3为供体血浆线粒体DNA含量预测术后受者恢复情况的可靠性研究结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例提供的mtDNA检测试剂在制备供肾损伤程度或移植肾功能的诊断试剂盒中的用途及诊断试剂盒进行具体说明。
本发明实施例提供了血浆中线粒体DNA的检测试剂在制备供肾损伤程度的诊断试剂盒中的用途。其通过将血浆中线粒体DNA的检测试剂用在供肾损伤程度的诊断试剂盒中，使供肾损伤程度的检测过程克服了现有技术中的诸多缺点。
具体地，通过血浆中线粒体DNA的检测试剂检测血浆线粒体 DNA的含量水平，评估供肾质量的好坏，成功的解决了通过病理穿刺所带来的弊端。具有以下几点优点：(1)此检测技术无创性，只需留取少量供体血液标本，进行定量的检测，即可得到结果，不损伤供肾组织；(2)费用低，采用定量PCR技术，可以减少医疗费用；(3) 减少等待时间：在明确供体是否捐献后，可以早起对供肾进行评估，并且可以多次留取样本，多次进行评估供肾质量。(4)技术要求及人力成本低：通过检测血浆线粒体DNA的含量，得到一个具体的数值，通过和检测标准进行对比，得出供肾质量的结果；(5)对于移植受者长期的移植肾功能具有预测作用。
由于发明人发现，血浆中线粒体DNA的检测试剂检测血浆线粒体DNA的含量水平，能够对移植受者长期的移植肾功能具有预测作用。因此，本发明实施例还提供了血浆中线粒体DNA的检测试剂在制备移植肾功能的诊断试剂盒中的用途，该药物用于移植肾功能的诊断过程中，同样具备上述的几个优点。
具体地，血浆为获取肾脏时留取的外周血，获取的血液标本在2 小时内进行离心得到血浆标本，取100ul血浆标本进行检测线粒体 DNA的含量水平，检测方法目前已相对成熟，文献有相关报道。
参考文献1：Wang C,Hann HW,Hann RS,et al.Circulating mitochondrial DNAcontent associated with the risk of liver cirrhosis:A nested case-controlstudy[J].Digestive diseases and sciences, 2015,60(6):1707-1715。
参考文献2：Li L,Hann HW,Wan S,et al.Cell-free circulatingmitochondrial DNA content and risk of hepatocellular carcinoma in patientswith chronic hbv infection[J].Scientific reports,2016,6。
具体地，检测试剂包括第一引物对和第二引物对，第一引物对的碱基序列如SEQNO.1-2所示，第二引物对的碱基序列如SEQ NO.3-4 所示。
第一引物对的序列如下：
正向引物SEQ NO.1：
5'-CCCTAAAACCCGCCACATCT-3'；
反向引物SEQ NO.2：
5'-GAGCGATGGTGAGAGCTAAGGT-3'；
第二引物对的序列如下：
正向引物SEQ NO.3：
5'-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3'；
反向引物SEQ NO.4：
5'-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3'。
进一步地，检测试剂还包括核酸提取试剂盒和qPCR试剂，核酸提取试剂盒优选为QIAamp试剂盒，用于将mtDNA提取出来，qPCR 试剂提供反应体系。具体地，qPCR试剂包括PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+中的至少一种。以上为几种常用的qPCR 试剂，可以根据需要进行选择。
本发明实施例还提供了一种供肾损伤程度的诊断试剂盒，包括血浆中线粒体DNA的检测试剂。可以将血浆中线粒体DNA的检测试剂制成试剂盒用于供肾损伤程度诊断过程中。
具体地，血浆中线粒体DNA的检测试剂包括检测引物、核酸提取试剂盒和qPCR试剂；检测引物包括第一引物对和第二引物对，第一引物对的碱基序列如SEQ NO.1-2所示，第二引物对的碱基序列如 SEQ NO.3-4所示；核酸提取试剂盒优选为QIAamp试剂盒。
本发明实施例还提供了一种移植肾功能的诊断试剂盒，包括血浆中线粒体DNA的检测试剂。同样可以将血浆中线粒体DNA的检测试剂制成试剂盒用于供肾损伤程度诊断过程中。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种供肾损伤程度的诊断试剂盒，其包括检测引物、QIAamp试剂盒和qPCR试剂。
其中，检测引物包括第一引物对和第二引物对，第一引物对的碱基序列如SEQNO.1-2所示，第二引物对的碱基序列如SEQ NO.3-4 所示；qPCR试剂包括PCR反应缓冲液和Taq DNA聚合酶。
实施例2
本实施例提供一种供肾损伤程度的诊断试剂盒，其包括检测引物、QIAamp试剂盒和qPCR试剂。
其中，检测引物包括第一引物对和第二引物对，第一引物对的碱基序列如SEQNO.1-2所示，第二引物对的碱基序列如SEQ NO.3-4 所示；qPCR试剂包括PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶和dNTPs。
实施例3
本实施例提供一种供肾损伤程度的诊断试剂盒，其包括检测引物、QIAamp试剂盒和qPCR试剂。
其中，检测引物包括第一引物对和第二引物对，第一引物对的碱基序列如SEQNO.1-2所示，第二引物对的碱基序列如SEQ NO.3-4 所示；qPCR试剂包括PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs 和Mg2+。
需要说明的是，本发明实施例中提及的QIAamp试剂盒为现有的用于提取核苷酸的试剂盒，其具体使用过程和成分在此不做过多赘述。
将实施例1中供肾损伤程度的诊断试剂盒用于供肾损伤程度和移植肾功能的诊断过程中。
试验例1
测试供体血浆线粒体DNA在急性肾损伤(AKI)和非急性肾损伤中的表达区别，考察供体血浆线粒体DNA含量能否对肾脏损伤程度具有预测作用，测试结果见图1。测试方法大致为在供体行捐献手术前收集供体血液，从血液中分离出血浆，再去测量血浆里的线粒体DNA的含量，测试样本为100例。
由图1可知，急性肾损伤(AKI)病人血浆里的线粒体DNA含量明显高于非急性肾损伤的情况。由此可见，供体血浆线粒体DNA 含量的检测试剂可以应用于供肾损伤程度的诊断过程中。
试验例2
与试验例1测试方法相似，测试供体血浆线粒体DNA含量能否对移植肾功能的恢复情况具有预测作用，测试结果见图2。
其中，IGF是恢复很快，SGF是恢复速率较快，DGF是恢复速率一般，PNF是恢复速率最差。IGF是7天内肌酐下降和术前相比大于70％，SGF是7天内肌酐下降小于70％，DGF是下降小于70％并且需要透析治疗，PNF是移植肾无功能，一直不恢复。
由图2可知，线粒体DNA的含量越高，代表供体肾脏损伤的越严重，术后恢复越差，在PNF组内我们可以看见线粒体DNA的含量是最高的。可见，线粒体DNA的含量越高，术后恢复越差，甚至会导致手术后患者无法恢复。
由此可见，供体血浆线粒体DNA含量的检测试剂可以应用于移植肾功能的恢复情况的诊断过程中。
试验例3
采用常规的方法，测定供体血浆线粒体DNA含量预测术后受者恢复情况的可靠性，结果见图3。
在图3中直线上方是有意义，在直线下面就是说明没有预测意义。在评估过程中，正方形总的面积是1，波浪线下的面积越大，说明预测的意义越高，波浪线下的面积大致为0.757，说明预测意义很大。
综上所述，本发明提供的mtDNA检测试剂在制备供肾损伤程度或移植肾功能的诊断试剂盒中的用途，其通过将血浆中线粒体DNA 的检测试剂用在制备供肾损伤程度的诊断试剂盒及移植肾功能的诊断试剂盒中，能够使肾损伤程度和移植肾功能的诊断过程更加简便易行，无需切取肾组织进行检测，是一种无创伤的药物检测方法，检测成本显著降低。
本发明中还提供了一种供肾损伤程度的诊断试剂盒及移植肾功能的诊断试剂盒，均包括血浆中线粒体DNA的检测试剂，试剂盒的制备成本低，诊断效果可靠性强。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学附属第三医院（中山大学肝脏病医院）
<120> mtDNA检测试剂在制备供肾损伤程度或移植肾功能的诊断试剂盒中的用途及
诊断试剂盒
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccctaaaacc cgccacatct 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gagcgatggt gagagctaag gt 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cagcaagtgg gaaggtgtaa tcc 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cccattctat catcaacggg tacaa 25

Claims (10)

1.血浆中线粒体DNA的检测试剂在制备供肾损伤程度的诊断试剂盒中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述血浆为获取肾脏时留取的外周血。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测试剂包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对的碱基序列如SEQ NO.1-2所示，所述第二引物对的碱基序列如SEQNO.3-4所示。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述检测试剂还包括核酸提取试剂盒和qPCR试剂。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述qPCR试剂包括PCR反应缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2+中的至少一种。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述核酸提取试剂盒包括QIAamp试剂盒。
7.血浆中线粒体DNA的检测试剂在制备移植肾功能的诊断试剂盒中的用途。
8.一种供肾损伤程度的诊断试剂盒，其特征在于，包括血浆中线粒体DNA的检测试剂。
9.根据权利要求8所述的供肾损伤程度的诊断试剂盒，其特征在于，所述血浆中线粒体DNA的检测试剂包括检测引物、核酸提取试剂盒和qPCR试剂；
所述检测引物包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对的碱基序列如SEQNO.1-2所示，所述第二引物对的碱基序列如SEQ NO.3-4所示；
所述核酸提取试剂盒优选为QIAamp试剂盒。
10.一种移植肾功能的诊断试剂盒，其特征在于，包括血浆中线粒体DNA的检测试剂。
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