CN108342348A - 一种制备埃博拉病毒核蛋白抗原的基因工程菌及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备埃博拉病毒核蛋白抗原的基因工程菌及应用，诱导基因工程菌株Escherichia coli Bl21(DE3)/ pET‑28a‑ ZEBOV‑NP表达埃博拉病毒核蛋白，通过离心和超声破碎获得抗原，该抗原可溶性强，有良好的抗原性，适合作为间接ELISA检测用抗原。本发明涉及的埃博拉病毒核蛋白抗原制备方法简便快速，产量大，与经典制备方法相比，所获抗原性质更稳定，所建立的间接ELISA检测方法灵敏度强，特异性好，检测周期短，有广泛应用。

Description

一种制备埃博拉病毒核蛋白抗原的基因工程菌及应用
技术领域
本发明属于病原检测技术领域，具体涉及一种制备埃博拉病毒核蛋白抗原的基因工程菌及应用，利用本发明提供的工程菌，可大量快速地制备埃博拉病毒核蛋白抗原，该抗原能与相应抗体特异性的结合，该抗原在用于埃博拉病毒核蛋白抗体的检测中具有很强的灵敏度和显著的特异性，具有开发成为检测试剂盒的应用价值。
背景技术
埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)能够引起埃博拉出血热，主要症状表现为发热、腹泻、体内外大出血等，主要通过体液、粘膜接触传播，气溶胶传播等，传播能力极强，致死率极高，且尚无被批准上市的治疗药物和疫苗，因此被WHO定义为生物安全四级病毒。该病90％以上的流行发生在非洲赤道附近区域，在美洲及亚洲也有个别输入型案例的报道。2014年至2016年，肆虐西非国家几内亚、利比里亚、塞拉利昂的埃博拉病毒蔓延速度惊人，感染和死亡人数均为有记录以来最多的一次疫情，成为国际高度关注的突发公共卫生事件，并对他国家的公共健康构成威胁。尽管到目前为止，埃博拉疫情主要发生在非洲，但是随着经济全球化进程的深入，中国和非洲经济文化联系的日益密切，大量人员频繁来往于中非之间，埃博拉病毒对人们的威胁与日俱增，埃博拉疫情对中国的公共卫生体系建设和埃博拉疫情的防控带来严峻的挑战和威胁，因此需要对此类病毒的入侵做好储备性工作，其中埃博拉病毒的血清学诊断技术的建立和完善是对埃博拉病毒进行有效防控的重要措施之一。
间接ELISA的原理是将已知的抗原吸附在固相载体表面，利用抗原抗体的特异性反应，使用酶标记的抗抗体检测已与固相结合的受检抗体，是传染病特异性抗体检测的常用方法之一，具有快速、灵敏、简便、易于标准化等优点。同时，由于抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间，两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，因此ELISA检测方法具有高度特异性。
作为埃博拉病毒抗体检测的主要方法，国内外已建立多种ELISA检测方法，但是抗原的选择和制备方法会直接导致ELISA检测方法的特异性、灵敏度及其操作的便利性有很大差异。在以往的ELISA检测方法中，有的抗原来自于病毒感染的细胞培养物，虽然这类方法具备较好的特异性和灵敏度，但是由于埃博拉病毒为生物安全四级病毒，此类抗原的制备和使用需要在BSL-4实验室中进行，使得该检测方法风险高，效率低，在没有BSL-4实验室的条件下无法开展检测工作(Ksiazek et al.,1999)。因此，很多研究人员选择使用体外重组表达抗原建立ELISA检测方法，结果均显示能对埃博拉病毒感染病人恢复期血清或感染动物血清中的IgG抗体进行检测(Prehaud et al.,1998；Saijo et al.,2001；Ikegami etal.,2003；Nakayamaet al.,2010)。但是，选择不同靶抗原建立的ELISA检测方法其特异性有较大差别，Groen和Sobarzo等人的研究显示，以埃博拉病毒VP35、VP40以及GP为抗原建立的ELISA检测方法其灵敏度均逊于以埃博拉核蛋白NP为抗原建立的ELISA检测结果(Groenet al.,2003；Sobarzo et al.,2012)。而且上述利用经典的原核表达系统和真核表达系统(包括杆状病毒表达系统和哺乳动物细胞表达系统)制备抗原的研究中，虽然都取得了较好的检测灵敏度和特异性，但存在蛋白表达量少，病毒培养过程繁琐，细胞易污染等弊端，使大多制备方法，尤其是其中的纯化过程，显得比较复杂繁琐，难以快速大量制备且抗原质量不易控制，例如，纯化的抗原易发生沉淀，从而大大降低了其作为间接ELISA检测抗原的使用效率和效果。此外，真核表达系统制备的抗原成本通常较高，这些因素无疑是埃博拉病毒抗体间接ELISA检测便捷地广泛使用的障碍。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种可用于制备ELISA检测用埃博拉病毒核蛋白抗原的基因工程菌，所述的基因工程菌为：大肠杆菌Escherichia coli Bl21(DE3)/pET-28a-ZEBOV-NP，保藏编号为：CCTCC NO：M2014548。
本发明的另一个目的在于提供了一种可用于ELISA检测用的埃博拉病毒核蛋白抗原快速制备方法，该抗原方法简单易行，操作方便，易于生产，制备的抗原产量大且不易降解，使用该抗原建立的间接ELISA检测方法灵敏度高，特异性好，操作简单，设备要求低、检测周期短，有很广的应用面。
本发明的最后一个目的在于提供了基因工程菌在埃博拉病毒ELISA检测试剂盒中的应用。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种基因工程菌,所述的基因工程菌已于2014年11月5日保藏至中国典型培养物保藏中心，分类命名：大肠杆菌Escherichia coli Bl21(DE3)/pET-28a-ZEBOV-NP，CCTCCNO：2014548，地址：中国武汉武汉大学。
通过对发明内容中的基因工程菌进行诱导表达获得大量制备检测用埃博拉病毒核蛋白抗原，制备过程简单方便，检测活性高，包括：向大肠杆菌Escherichia coli Bl21(DE3)/pET-28a-ZEBOV-NP培养物中加入IPTG诱导蛋白表达，然后破碎细菌，离心，收集上清。
具体步骤是：
A、取适量过夜大肠杆菌Escherichia coli Bl21(DE3)/pET-28a-ZEBOV-NP培养物按1：100加至新鲜LB(同时按1：1000加入50mg/ml卡那霉素抑制杂菌生长)，37℃培养3h，测OD600＝0.2～0.4。
B、加入诱导剂IPTG诱导蛋白表达，诱导条件为：IPTG浓度0.4mM、诱导温度37℃、诱导时间3h。诱导完毕，8,000rpm离心10min，分离得到菌体。
C、倒尽培养基残液，使用适量PBS重悬菌体(通常使用培养菌液的1/10体积)，超声波破碎细胞至OD600<0.1，12,000rpm离心10min，取上清，即得。
检测用埃博拉病毒核蛋白抗原在western-blot和间接ELISA检测埃博拉病毒核蛋白抗体中的应用。它包括下列步骤：
A.western-blot检测埃博拉核蛋白抗体。将样品跑SDS-PAGE。100mA，1hour将样品转移到PDVF膜上。5％(m/v)脱脂奶粉，4℃封闭过夜。TBST(Tris-Buffered Saline with0.05％Tween-20)洗涤3次，每次间隔10min。2000倍稀释阳性抗体ENP作为一抗，室温(20－25℃，以下相同)下孵育1.5hour。同样方法洗涤3次，孵育2000倍稀释的带有AP标记羊抗兔二抗(Beyotime，CAT NO:A0239)，在室温下孵育1.5hour。洗涤后，将膜加入到含有底物BCIP(300×)33μl，底物NBT(150×)66μl，底物工作液10ml的染色槽中，显色约10分钟后用无菌水终止反应。
B.ELISA检测埃博拉核蛋白抗体。适量抗原与包被液(0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液pH 9.6)充分混合，4摄氏度包被过夜，每孔加入混合液100μl。洗涤剂PBST(含0.05％tween-20)洗涤三次，注满后，静置1min，拍干。在37摄氏度下，使用5％脱脂奶粉封闭2hour,每孔200μl，PBST洗涤三次。自行制备的埃博拉核蛋白多克隆抗体(抗体ENP)用PBS(含2％(m/v)脱脂奶粉)进行稀释，37度孵育1hour。抗体MNP，LaV-NP，JUNV-NP，NiV-NP，HeV-NP(为马尔堡病毒，拉萨热病毒，胡宁病毒，尼帕病毒，亨德拉病毒的核蛋白多克隆抗体，由申请人使用自行表达制备的蛋白免疫小鼠或兔子后制备)作为交叉阴性对照，正常小鼠或兔血清作为阴性对照，在同样条件下孵育。PBST洗涤三次。酶联HRP的二抗(Beyotime，CAT NO:A0208)用PBS(加入2％脱脂奶粉)稀释2,000倍，37度孵育1hour。PBST洗涤三次后，加入TMB底物显色液，每孔200μl，室温下显色后终止液终止反应(2M硫酸)，OD450读数。
C.小鼠血清样品的ELISA检测。在目前无法获得阳性样品的客观限制下，我们构建了能够表达埃博拉核蛋白的重组杆状病毒并使用感染细胞裂解物免疫实验小鼠，获得血清样本后，应用上述抗原和ELISA检测方法对小鼠血清样本进行了检测。主要过程如下：抗原与包被液充分混合，4摄氏度包被过夜，每孔加入混合液100μl(抗原包被量：100ng/孔)。洗涤剂PBST(含0.05％tween-20)洗涤三次，注满后，静置1min，拍干。5％(m/v)脱脂奶粉在37摄氏度下，封闭1hour，每孔200μl，PBST洗涤三次。10份小鼠血清样本用PBS(含2％脱脂奶粉)稀释16倍，37度孵育1hour，一份样品三个平行。PBST洗涤三次。酶联HRP的二抗用PBS(加入2％脱脂奶粉)稀释2,000倍，37度孵育1hour。PBST洗涤三次后，吸去剩余的液体。加入TMB底物显色液，每孔200μl，室温下显色后终止液终止反应(2M硫酸)，OD450读数。由于样本数量有限，目前以P/N>2.1为阳性反应判断标准。
D.人群血清样品ELISA检测。在国内无法获得阳性样品的客观限制下，我们对来源于广东省出入境检验检疫局的100份人血清进行了间接ELISA检测，对本发明涉及的埃博拉核蛋白抗原制备方法的进行了进一步的应用。具体过程如下：抗原与包被液充分混合，4摄氏度包被过夜，每孔加入混合液100μl(抗原包被量：抗原量100ng/孔)。洗涤剂PBST(含0.05％tween-20)洗涤三次，注满后，静置1min，拍干。5％(m/v)脱脂奶粉在37摄氏度下，封闭1hour,每孔100μl，PBST洗涤三次。100份人血清用PBS(加入2％脱脂奶粉)稀释1,000倍，37度孵育1hour，一份样品三个平行。PBST洗涤三次。酶联HRP的二抗用PBS(加入2％脱脂奶粉)稀释2,000倍，37度孵育1hour。PBST洗涤三次后，吸去剩余的液体。加入TMB底物显色液，每孔100μl，室温下显色后终止液终止反应(2M硫酸)，OD450读数。将三个平行取平均数，求出样本内标准差，去除大于平均数加两个标准差的读数，将调整后的平均数减去调零孔的读数。求出100个检测值平均数和标准差，最后，得到人血清检测的阳性判断标准：阴性：<空白值+0.35疑似阳性：>空白值+0.35and<空白值+0.6，阳性：>空白值+0.6。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1、本发明涉及的埃博拉病毒核蛋白抗原制备方法，制备过程简便快速且产量高。从菌株培养到获得抗原，仅需要12小时的时间，从30ml培养菌液中即可得到能够包被5000块96孔酶标板的抗原量；
2、本方法制备的埃博拉病毒核蛋白抗原具有可溶性好，抗原性佳，与经典的纯化抗原相比，具有更稳定，不易降解的优点；通过使用冻融后的抗原进行ELISA实验后发现，本发明涉及的抗原尽管冻融过多次，其测定数值基本保持不变，但经典方法得到的抗原的数值有明显下降，ELISA测定数值不稳定，导致使用该抗原进行的实验重复性不好，不同实验批次间的差异较大。
3、本方法制备的检测用抗原，在检测相应抗体时表现了很高的灵敏度，在检测最近缘蛋白马尔堡核蛋白及其他有出血热或脑炎症状的烈性病毒核蛋白抗体时也表现出了显著的特异性，证明了本发明的实用价值。在动物源血清样本和人源血清样本的检测应用中，结果均显示出了很高的灵敏度和很好的特异性，为本发明的进一步研发提供了坚实的实用基础。
附图说明
图1为埃博拉病毒核蛋白融合表达载体的酶切鉴定示意图。
图2重组埃博拉病毒核蛋白的表达示意图；
其中，泳道1:重组蛋白的诱导表达产物，2:表达有埃博拉病毒核蛋白菌体裂解液上清，3:镍柱纯化的埃博拉病毒核蛋白。
图3为使用埃博拉病毒核蛋白特异性多抗(A)和马尔堡病毒核蛋白特异性多抗(B)对重组埃博拉病毒核蛋白进行Western-blot检测示意图；
其中，泳道：1：空载体不加诱导剂(阴性对照)，2：空载体加诱导剂(阴性对照)，3：未纯化的埃博拉病毒核蛋白，4：纯化后的埃博拉病毒核蛋白，5：未纯化的马尔堡病毒核蛋白，6：纯化后的马尔堡病毒核蛋白。
图4为埃博拉病毒核蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立示意图；
ENP-C：本发明涉及方法制备的抗原，ENP-C NC：ENP-C的阴性对照抗原，ENP-P：经典方法制备的抗原，ENP-P NC：ENP-P的阴性对照抗原。
图5为埃博拉病毒核蛋白抗体间接ELISA检测方法的灵敏度示意图；
ENP-C：本发明涉及方法制备的抗原，ENP-C NC：ENP-C的阴性对照抗原，ENP-P：经典方法制备的抗原，ENP-P NC：ENP-P的阴性对照抗原。
图6为埃博拉病毒核蛋白抗体间接ELISA检测方法的特异性示意图。
ENP，MNP，LaV-NP，JUNV-NP，NiV-NP，HeV-NP：分别为埃博拉病毒、马尔堡病毒，拉萨热病毒，胡宁病毒，尼帕病毒，亨德拉病毒的核蛋白多克隆抗体，Neg：阴性对照血清，此处为正常兔血清。
图7为埃博拉病毒核蛋白抗原在小鼠血清样本中特异性抗体间接ELISA检测中的应用；
Q1-Q5，F1-F5：使用两种不同方式免疫小鼠获得的血清样本，每种免疫方式有5份样本；P：阳性对照血清，此处为ENP特异性多克隆抗体；N：阴性对照血清，此处为正常小鼠血清。
图8为埃博拉病毒核蛋白抗原在人血清样本中特异性抗体间接ELISA检测中的应用。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
一种制备埃博拉病毒核蛋白抗原的基因工程菌，通过下述步骤获得：
A、PCR扩增基因：原始基因模板名称pCRII-enp，由中国科学院武汉病毒研究所危宏平研究员课题组提供(经测序验证)。正向引物为5ˊ-GGATCCATGGATTCTCGTCCTCAGAAAAT-3ˊ(F)，反向引物为5’-GTCGACTCACTGATGATGTTGCAGGATT-3’(R)，PCR反应的试剂如下：将5μL的10×ExTaq聚合酶缓冲液、1μL的2.5mM dNTP混合物、1μL的引物F(10uM)、1μL的引物R(10uM)、1μL的扩增模板、1μL的ExTaq HS DNA聚合酶(5U/ul)和40μL的无菌水混合，PCR反应条件：94℃预变性300秒；94℃变性30秒，58℃复性45秒，72℃延伸30秒，循环35次；72℃最后延伸600秒。将PCR扩增产物进行琼脂糖(0.8％)凝胶电泳，获得约2200bp的扩增带，回收的PCR产物与pGEM-T Easy载体(PROMEGA，CAT NO:A1360)连接，测序验证序列。
B、融合载体构建：用BamH I和SalI分别双酶切含NP基因的DNA片段和pET28a(+)(NOVAGEN，CAT NO.89864-3)，酶切体系如下：1μL BamH I，1μL Sal I，8μL PCR产物，10μLddH2O以及1μL BamH I，1μL Sal I，6μL pET28a(+)，12μL ddH2O，酶切条件为37度下3小时。将酶切产物进行连接，连接体系如下：2μl NP基因DNA片段，6μLpET28a(+)，1μL T4连接酶，1μL连接体系buffer，连接条件为4度下过夜。将连接产物与40μL感受态细胞BL21(DE3)(TRANSGEN，CAT NO:CD601)在冰上充分混合，注入电转化杯，用1800V瞬时电击，吸取转化后的转化后产物到1mL SOC培养基中，37℃摇床培养1小时，取200mL涂布于固体LB(按1：1000加入50mg/ml卡那霉素)培养皿中，37度过夜培养，挑取3-5株单菌落，接至5mL新鲜LB培养基，37度过夜培养，提取质粒，进行双酶切验证，酶切体系如下：1μL BamH I，1μL Sal I，8μl质粒，10μL ddH2O，将酶切产物进行0.8％(m/v)琼脂糖凝胶电泳验证，在电泳图上，阳性克隆株会分别在2220bp以及5369bp左右显示两条清晰的条带(图1)。
挑取符合上述条件的克隆株进行培养和诱导表达，并进行抗原制备和埃博拉病毒核蛋白抗体检测，最后选取表达稳定，表达量大且做制备抗原性质良好的克隆株进行保存。所述的基因工程菌已于2014年11月5日保藏至中国典型培养物保藏中心，分类命名：大肠杆菌Escherichia coli Bl21(DE3)/pET-28a-ZEBOV-NP，CCTCC NO：2014548，地址：中国武汉武汉大学。该菌株为大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株，其生理生化特性与大肠杆菌菌株一致，可用于埃博拉病毒核蛋白抗原的表达。克隆菌株在LB固态培养下，呈2mm左右圆形小菌落、边缘光滑清晰、不透明、白色或米白色。在LB液体培养下，呈黄色浑浊液，浑浊度随培养时间的延长而增加。单菌体在显微镜下呈现杆状，大小0.5μm×2μm。本发明或将该保藏的菌株简称为pET-28a-ZEBOV-NP/BL21(DE3)。
实施例2：
埃博拉病毒核蛋白抗原的制备方法，其步骤如下：
A、接种克隆株pET-28a-ZEBOV-NP/BL21(DE3)至5mL新鲜LB培养基(按1：1000加入50mg/ml卡那霉素)，过夜培养。
B、取适量培养物按1：100加至新鲜LB(同时按1：1000加入50mg/ml卡那霉素抑制杂菌生长)，37℃培养3h，测OD600＝0.2～0.4。
C、加入诱导剂IPTG诱导蛋白表达，诱导条件为：IPTG浓度0.4mM，诱导温度37℃，诱导时间3h。诱导完毕后，8000rpm离心10min，分离得到菌体。
D、倒尽培养基残液，使用适量PBS重悬菌体(通常使用培养菌液的1/10体积)，超声波破碎细胞至OD600<0.1，12,000rpm离心10min，分离溶液相与固相。取40μL上清溶液，加入10μL 5×SDS上样缓冲液，95℃变性5min，制成SDS-PAGE电泳样品，用12％(m/v)SDS-PAGE检测融合蛋白的表达。同样条件下培养仅含有空载体的基因工程菌并使用同样制备方法获得的裂解提取物作为阴性对照抗原。
SDS-PAGE电泳结果显示，经过诱导的pET-28a-ZEBOV-NP/BL21(DE3)菌体破碎液样品在110kDa处有明显条带，由此可判断获得了埃博拉病毒核蛋白抗原(抗原浓度可达3ug/ul以上)将用于埃博拉病毒核蛋白抗体的ELISA检测(图2)。
实施例3：
埃博拉病毒核蛋白的Western-blot检测，其步骤是：
A、将上述方法制备的埃博拉病毒核蛋白及相应阴性对照和阳性对照进行SDS-PAGE电泳(图3)；
B、100mA，1小时，将样品转移到PDVF膜上；
C、5％(m/v)脱脂奶粉，4℃下封闭过夜，TBST(含0.05％(v/v)Tween-20)洗涤3次，每次间隔10min；
D、将自行制备的特异性多克隆抗体(埃博拉病毒核蛋白抗体ENP和马尔堡病毒核蛋白抗体MNP)稀释至1：2000倍作为一抗，室温下孵育1.5小时；
E、同样方法洗涤3次后，加入2000倍稀释的二抗-AP标记山羊抗兔IgG(Beyotime，CAT NO:A0239)，室温下孵育1.5小时；
F、洗涤后，将膜加入到含有底物BCIP(300×)33μL、底物NBT(150×)66μL、底物工作液10mL的染色槽中，显色约10分钟后用无菌水终止反应。实验结果显示，上述埃博拉病毒核蛋白抗原与ENP抗体发生了特异的抗原抗体反应，同时与MNP抗体未发生任何反应，证明所制备抗原具有优良的灵敏性及特异性(图3)。
实施例4：
使用本发明涉及方法制备的埃博拉病毒核蛋白抗原建立间接ELISA方法，其步骤是：
A、将相同数量的抗原与包被液(0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液pH 9.6)充分混合，4℃包被过夜，每孔加入混合液100μL(包括上述方法制备的埃博拉病毒核蛋白抗原、经典方法制备的埃博拉病毒核蛋白抗原和阴性对照抗原，抗原包被量：12.5-1600ng/孔)；
B、用PBST(含0.05％tween-20)洗涤三次，注满后，静置1min，拍干，5％脱脂奶粉在37℃下，封闭1小时，每孔200μL，PBST洗涤三次；
C、将自行制备的特异性埃博拉病毒核蛋白抗体用PBS(含2％脱脂奶粉)稀释2000倍，每孔100μL，37度孵育1hour。PBST洗涤三次。酶联HRP的二抗(Beyotime，CAT NO:A0208)用PBS(加入2％脱脂奶粉)稀释2,000倍，37度孵育1hour。PBST洗涤三次后，加入TMB底物显色液，每孔200μl，室温下显色后终止液终止反应(2M硫酸)，OD450读数。
结果显示，使用本发明涉及的方案制备的抗原(ENP-C)在建立间接ELISA检测方法时，抗原包被量为25ng/孔时，依然可看到阳性结果，当抗原包被量为50-200ng/孔的抗原包被量均有较好的效果(P/N值明显高于其他浓度的包被抗原)，使用经典镍柱纯化方法(使用Ni+纯化收集溶液相中的带有his-tag的目的抗原)制备的抗原(ENP-P)在建立间接ELISA检测方法时，包被抗原在100-200ng/孔的条件下效果较好(图4)，因此使用本发明涉及方法制备的同样数量的抗原可进行更多批次的检测实验。此外，进一步的数据分析表明，抗原包被量在50ng/孔至100ng/孔时，本发明涉及方案制备抗原的OD值更高且显著高于经典镍柱纯化方法制备的抗原(P<0.05)，而相应的阴性对照的OD值更低，因而效果更佳。由此可见，本发明涉及的抗原方法较之经典镍柱纯化方法制备抗原的过程更为简便快速(本发明的几乎没有纯化过程，直接细胞破碎后取上清即可)且获得的可用抗原量更高。
D、同上述过程，取适量抗原与包被液(0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液pH 9.6)充分混合，4℃包被过夜(抗原包被量：100ng/孔)，洗涤后封闭1小时。封闭结束，洗涤三次。然后加入2倍梯度稀释的抗体(自行制备的特异性埃博拉病毒核蛋白多克隆抗体，1：1000-1：128000)，每孔100μL，37度孵育1小时后洗涤三次。酶联HRP的二抗(Beyotime，CAT NO:A0208)用PBS(加入2％脱脂奶粉)稀释2,000倍，37度孵育1小时。PBST洗涤三次后，加入TMB底物显色液，每孔200μl，室温下显色后终止液终止反应(2M硫酸)，OD450读数。
实验结果显示，使用本发明涉及的方案制备的抗原(ENP-C)建立的间接ELISA检测方法在抗体稀释至1：128000，仍呈现阳性结果(以P/N>2.1为阳性反应判断标准)，其中抗体稀释度为1：4000-1：16000时OD值，其P/N值明显高于其他稀释度，且背景低(阴性对照OD值低)，表明该方法具有较好的灵敏度(图6)。与使用经典镍柱纯化方法制备的抗原(ENP-P)建立的间接ELISA方法相比，使用相同稀释度的抗体时，ENP-C的OD值均更高且显著高于ENP-P(P<0.05)，表明使用本发明涉及的方案制备的抗原(ENP-C)建立的间接ELISA检测方法具有更好的灵敏度(图5)。
E、同上述过程，取适量抗原与包被液(0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液pH 9.6)充分混合，4℃包被过夜(抗原包被量：100ng/孔)，洗涤后封闭1小时。封闭结束，洗涤三次。然后加入8000倍稀释的抗体ENP，MNP，LaV-NP，JUNV-NP，NiV-NP，HeV-NP(分别为埃博拉病毒和马尔堡病毒，拉萨热病毒，胡宁病毒，尼帕病毒，亨德拉病毒的核蛋白多克隆抗体，由申请人使用自行表达制备的蛋白免疫兔子后制备的抗血清)，作为特异性试验的抗体对照，正常兔血清作为阴性对照，每孔100μL，37℃孵育1小时后洗涤三次。酶联HRP的二抗(Beyotime，CATNO:A0208)用PBS(加入2％脱脂奶粉)稀释2,000倍，37度孵育1小时。PBST洗涤三次后，加入TMB底物显色液，每孔200μl，室温下显色后终止液终止反应(2M硫酸)，OD450读数。
特异性实验结果显示，本发明涉及方法制备的埃博拉病毒核蛋白抗原与抗体MNP，LaV-NP，JUNV-NP，NiV-NP，HeV-NP和阴性对照血清的反应均与阴性，与埃博拉病毒核蛋白阳性血清的反应为阳性(以P/N>2.1为阳性反应判断标准)，由此可见，使用本法制备的抗原建立的间接ELISA方法特异性良好(图6)。
此外，使用本发明涉及方法制备的埃博拉病毒核蛋白抗原建立间接ELISA方法在批内、批间对相同样品间的检测差异不显著，所有数据的变异系数均≤10％，表明该方法具有良好的重复性。
实施例5：
使用本发明涉及方法制备的埃博拉病毒核蛋白抗原在小鼠血清样品间接ELISA检测中的应用：
在目前无法获得阳性样品的客观限制下，我们通过构建能够有效表达埃博拉核蛋白的重组病毒免疫实验小鼠，获得血清样本后，应用本发明涉及方法制备的埃博拉病毒核蛋白抗原对小鼠血清样本中的抗体水平进行了间接ELISA检测。操作方法参照实施例4，具体如下：取适量抗原与包被液(0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液pH 9.6)充分混合，4℃包被过夜(抗原包被量：100ng/孔)，洗涤后封闭1小时。封闭结束，洗涤三次。10份小鼠血清样本(Q1-Q5，F1-F5)用PBS(加入2％脱脂奶粉)稀释16倍，每份样品三个平行，同时以ENP特异性抗体为阳性对照，正常小鼠血清为阴性对照在同样条件下进行孵育。酶联HRP的二抗(Beyotime，CAT NO:A0216)用PBS(加入2％脱脂奶粉)稀释2,000倍，37度孵育1小时。PBST洗涤三次后，加入TMB底物显色液，每孔200μl，室温下显色后终止液终止反应(2M硫酸)，OD450读数。以P/N>2.1为阳性反应判断标准，检测结果显示，所有的小鼠血清样品的OD值远远高于阴性对照，判断为阳性反应(图7)。同时对采用两种不同免疫方式获得的小鼠血清的间接ELISA检测数据进行分析发现，样品F1-F5中特异性抗体的效价要显著高于样品Q1-Q5(P<0.01)。以上应用测试显示了本发明的实用价值，可对药物或疫苗评价过程中动物源血清样本的埃博拉病毒核蛋白抗体进行有效检测。
实施例6：
使用本发明涉及方法制备的埃博拉病毒核蛋白抗原在人血清样品间接ELISA检测中的应用：
我们应用本发明涉及方法制备的埃博拉病毒核蛋白抗原对来源于广东省出入境检验检疫局的100份人血清样本中的抗体水平进行了间接ELISA检测。操作方法参照实施例4，具体如下：取适量抗原与包被液(0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液pH 9.6)充分混合，4℃包被过夜(抗原包被量：100ng/孔)，洗涤后封闭1小时。封闭结束，洗涤三次。100份人血清用PBS(加入2％脱脂奶粉)稀释1000倍，每份样品三个平行。37℃孵育1小时后洗涤三次。酶联HRP的二抗(Beyotime，CAT NO:A0201)用PBS(加入2％脱脂奶粉)稀释2,000倍，37度孵育1小时。PBST洗涤三次后，加入TMB底物显色液，室温下显色后终止液终止反应(2M硫酸)，OD450读数。
根据下列Cut-off值对样品进行检测结果判断：阴性：<空白值+0.35，疑似阳性：>空白值+0.35and<空白值+0.6，阳性：>空白值+0.6。实验结果显示(图8)，100份样品均为阴性，符合样品来源的背景(其中仅一个样品OD值处于疑似样本范围经样本来源方确认可能为样本中的某些成分的干扰导致其OD值偏高)(图8)。以上应用测试进一步显示了本发明的实用价值，具备对临床样本、药物或疫苗评价期间人血清样本中埃博拉病毒核蛋白抗体进行有效检测的用途。

Claims (5)

1.一种基因工程菌，所述的基因工程菌为：大肠杆菌 Escherichia coli Bl21(DE3)/pET-28a- ZEBOV-NP，保藏编号为：CCTCC NO：2014548。
2.权利要求1所述的基因工程菌在制备埃博拉病毒核蛋白抗原中的应用。
3.一种埃博拉病毒核蛋白抗原的制备方法，包括：向大肠杆菌 Escherichia coliBl21(DE3)/pET-28a- ZEBOV-NP 培养物中加入IPTG诱导蛋白表达，然后破碎细菌，离心，收集上清。
4.权利要求1所述的基因工程菌或权利要求3所述方法制备的抗原在制备埃博拉病毒ELISA检测试剂盒中的应用。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：大肠杆菌 Escherichia coli Bl21(DE3)/pET-28a-ZEBOV-NP过夜培养物按1：100加至新鲜LB，37 ℃培养3 h，测OD600=0.2~0.4；加入诱导剂IPTG诱导蛋白表达，诱导条件为：IPTG浓度0.4mM、诱导温度37℃、诱导时间3h；诱导完毕，8,000 rpm离心10 min，分离得到菌体；倒尽培养基残液，使用适量PBS重悬菌体（通常使用培养菌液的1/10体积），超声波破碎细胞至OD600<0.1，12,000 rpm离心10 min，收集上清。
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