CN108330127A - 一种磁珠混合液、核酸保存方法、核酸提取试剂及试剂盒 - Google Patents

一种磁珠混合液、核酸保存方法、核酸提取试剂及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种磁珠混合液，其包括磁珠、蛋白酶、变性剂、甘油、缓冲剂和核酸助沉剂。本发明还公开了一种核酸保存方法、核酸提取试剂及试剂盒。将磁珠混合液的各组分按一定比例预混合，进行核酸提取时可一次取相应体积即可均匀添加所需组分，用量更精准、操作更加简单；将各成分按比例预混，还能降低包装成本和运输成本。本发明的磁珠混合液，可以使磁珠保存的温度范围更广。采用本发明的磁珠混合溶液作为核酸(或含核酸的载体颗粒)溶剂，可以在核酸提取时同时进行监控核酸的提取，节省磁珠法核酸提取试剂的加样步骤，同时可以保证复孔间核酸加入浓度的均一性。采用磁珠混合液能稳定保存核酸。

Description

一种磁珠混合液、核酸保存方法、核酸提取试剂及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，尤其涉及一种磁珠混合液、核酸保存方法、核酸提取试剂及试剂盒。
背景技术
磁珠法核酸提取试剂是生物科学和纳米材料科学二者合一的高新技术产品，主要运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合，利用氧化硅纳米微球的超顺磁性，在离液盐和外加磁场的作用下，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出DNA和RNA，可应用在临床致病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、分子生物学研究等多种领域。
目前磁珠法核酸提取试剂核酸提取过程主要分为四步：裂解—结合—漂洗—洗脱。其中裂解步骤主要使用裂解液、核酸助沉剂(Carrier RNA)和蛋白酶 K，结合步骤主要使用纳米磁珠。市面上大部分磁珠法核酸提取试剂是由裂解液、冻干蛋白酶K、冻干CarrierRNA和纳米磁珠悬浮液组成，核酸提取前使用蛋白酶K缓冲液溶解蛋白酶K干粉，缓冲液溶解Carrier RNA干粉，再根据提取用量使蛋白酶K溶液、Carrier RNA溶液与裂解液、磁珠悬浮液和待提取样本混合裂解。该提取试剂虽然可以在常温环境下长期保存(1年以上)且具有较好的稳定性，但提取试剂的各组分单独存放，一套提取试剂需要使用8个以上的无 DNase和RNase保存管或瓶，造成包装体积增大；而且复溶蛋白酶K和Carrier RNA，核酸提取步骤需要逐个试剂按体积加入；复溶体积误差导致蛋白酶K和 Carrier RNA浓度不准确、提取过程中加入体积误差导致最终浓度出现偏差。
因此，市面上大部分磁珠法核酸提取试剂不仅造成成本和运输资源的浪费，而且用户使用过程中操作繁琐、容易使用用量出错。磁珠由于是纳米微球，不能进行冻结保存(-20℃)，因此保存方式仅为常温或冷藏以及Carrier RNA复溶后需分装-20℃冷冻保存，2-8℃保存期一般不超过48小时。由于磁珠法核酸提取试剂具有快速、回收率高以及能应用于自动化等优点，因此需要一种更简便准确的方法。
脱氧核酸核酸(DNA)是一种生物大分子，可组成遗传指令，引导生物发育和生命机能运作。DNA是由许多脱氧核苷酸按一定碱基顺序彼此用3’，5’- 磷酸二酯键相连构成的长链，大多数DNA是由双链构成，两条链之间以氢键链接，氢键和磷酸二酯键在酸性环境、高温、反复冻融、DNA酶等条件下容易降解断裂，导致DNA保存的遗传信息损失。
重组质粒是把目的DNA片段采用酶与质粒载体链接而成的一种环状双链 DNA，通过在细菌内部大量复制后重新提取得到。重组质粒含有目的基因片段，同时较容易大量获得，因此常用于代替靶基因模板作为试剂盒阳性对照、质控品等。
目前为了维持DNA或重组质粒结构的完整性，避免大规模断裂和降解，最佳的保存方法是冻干-80℃或者液氮低温保存，但DNA冻干存在操作困难、DNA 损失较大和复溶操作麻烦等问题，以及-80℃或者液氮低温保存需要昂贵的设备和后期维护费用，实际应用不具可操作性。科研单位或企业应用较多的核酸保存方法为将核酸溶解在TE Buffer(TE缓冲液)或双蒸水中，-20℃长期保存，但随着时间的推移，核酸仍会出现降解。
目前，中国专利申请CN102559654A公开一种DNA保存溶剂，该溶剂组分包括甘油、TE缓冲液、1-羧基-N,N,N-三甲基乙内酯，这种DNA保存溶液组分较多，配制复杂，成本较高。再有中国专利申请CN106434636A公开一种新型 DNA稳定溶液及制备方法，其溶液配方主要包括磷酸钾、葡萄糖、乙二胺四乙酸二钠和水，能保存一年以上琼脂糖凝胶电泳检测无降解，但基于琼脂糖检测无法判断DNA的断裂情况以及该方法需-20℃或-80℃保存，无法做到常温或冷藏保存。
发明内容
本发明的目的在于提出一种磁珠混合液，具有各成分用量更精准的特点；
本发明的另一目的在于提出一种核酸保存方法，具有保存温度范围广的特点；
本发明的又一目的在于提出一种核酸提取试剂，具有节省实验步骤的特点；
本发明的再一目的在于提出一种试剂盒，具有易保存的特点。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一种磁珠混合液，包括磁珠、蛋白酶、变性剂、甘油、缓冲剂、pH调节剂和核酸助沉剂。该磁珠混合液为预混液病可长期保存，应用于核酸提取时直接使用。
进一步的，磁珠为氨基磁珠、羧基磁珠或环氧基磁珠。
进一步的，缓冲剂为Tris-Hcl、EDTA-Na2和CaCl2。
进一步的，变性剂为尿素或SDS。
进一步的，每毫升的磁珠混合液包含磁珠10-100mg、蛋白酶10-50mg、 Tris-Hcl100mM、EDTA-Na2 10mM、CaCl2 10mM、尿素10mM、甘油50％、核酸助沉剂25μg，无DNase和RNase纯化水补足1mL。
一种采用上述磁珠混合液保存核酸的方法，将核酸加入磁珠混合液中保存，保存温度为-25℃至30℃。
进一步的，核酸为DNA或重组质粒，磁珠混合液保存核酸量为 1×104-5×107copy/mL。
进一步的，保存温度为：-20±5℃、2-8℃或室温。
一种包含上述磁珠混合液的核酸提取试剂，还包括内标重组质粒，内标重组质粒溶解于磁珠混合液中。
一种包括上述核酸提取试剂的试剂盒，还包括引物组、检测探针、内标探针。
本发明的有益效果为：
1、采用磁珠、蛋白酶、变性剂、甘油、缓冲剂和核酸助沉剂按一定比例预混合，进行核酸提取时可一次取相应体积即可均匀添加所需组分，用量更精准、操作更加简单；将各成分按比例预混，还能降低包装成本和运输成本。
2、本发明的磁珠混合溶液中的甘油使磁珠混合液不会出现冻结情况，同时甘油的高粘性使磁珠保持较好的分散效果，可以使磁珠保存的温度范围更广：冷冻、冷藏和常温条件均可保存较长时间。
3、采用本发明的磁珠混合溶液作为核酸(或含核酸的载体颗粒)溶剂，可以在核酸提取时同时进行监控核酸的提取，节省磁珠法核酸提取试剂的加样步骤，同时可以保证复孔间核酸加入浓度的均一性。
4、本发明的核酸保存方法中采用磁珠混合液能稳定保存核酸，使核酸浓度在冷冻、冷藏和室温条件下仍保持不变，还能有效减少核酸的局部断裂。磁珠混合液中的蛋白酶K能使溶液中的DNase或RNase水解、变性剂能将蛋白质的氢键、疏水键打开，引起蛋白质构象变化而失活。
附图说明
图1是本发明实施例1的磁珠混合液提取血清重组质粒的荧光定量PCR检测结果图；
图2是本发明实施例2的磁珠混合液提取血清重组质粒的荧光定量PCR检测结果图；
图3是本发明实施例3的磁珠混合液提取血清重组质粒的荧光定量PCR检测结果图；
图4是本发明实施例4的磁珠混合液提取血清重组质粒的荧光定量PCR检测结果图；
图5是本发明实施例5的磁珠混合液提取血清重组质粒的荧光定量PCR检测结果图；
图6是本发明实施例6的磁珠混合液提取血清重组质粒的荧光定量PCR检测结果图；
图7是本发明实施例7的磁珠混合液提取血清重组质粒的荧光定量PCR检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式进一步说明本发明的技术方案。
一种磁珠混合液，包括磁珠、蛋白酶、变性剂、甘油、缓冲剂和核酸助沉剂。核酸助沉剂可以是Carrier RNA或Carrier DNA，有利于采用该磁珠混合液提取核酸，提高核酸回收率。
磁珠具有超顺磁性，表面修饰有对DNA具有富集作用的基团，磁珠为氨基磁珠、羧基磁珠或环氧基磁珠。磁珠的尺寸为50nm-3000nm，具体的可以选择50nm、100nm、200nm、300nm、1000nm、2000nm、3000nm。
蛋白酶具体的采用蛋白酶K，蛋白酶K具有高活性。蛋白酶K能使溶液中的DNase或RNase水解，减少核酸保存的局部断裂。
缓冲剂为Tris-Hcl、EDTA-Na2和CaCl2。
变性剂为尿素或SDS，磁珠混合液中的尿素可由SDS替换，两者都可以达到较好的变性效果。变性剂尿素和SDS能将蛋白质的氢键、疏水键打开，引起蛋白质构象变化而失活，防止磁珠混合液被蛋白质污染，有利于磁珠混合液进行核酸长期保存。
优选的，每毫升的磁珠混合液包含磁珠10-100mg、蛋白酶10-50mg、Tris-Hcl100mM、EDTA-Na2 10mM、CaCl2 10mM、尿素10mM、甘油50％、核酸助沉剂25μg，无DNase和RNase纯化水补足1mL。
另一方案中，每毫升的磁珠混合液包含磁珠10-100mg、蛋白酶10-50mg、 Tris-Hcl100mM、EDTA-Na2 10mM、CaCl2 10mM、SDS 0.2-1％、、甘油50％、核酸助沉剂25μg，无DNase和RNase纯化水补足1mL。
其中，尿素10mM是指磁珠混合液中尿素的含量为10mmol/L，甘油50％是指磁珠混合液中甘油的重量分数为50％，SDS 0.2-1％是指磁珠混合液中的重量分数为0.2-1％。
本发明的磁珠混合液用于提取核酸，还能用于保存核酸。
本发明的磁珠混合液将各成分按一定比例预混合，在进行核酸提取时可一次取相应体积即可均匀添加所需组分，用量更精准、操作更加简单；将各成分按比例预混，还能降低包装成本和运输成本。
本发明的磁珠混合溶液中的甘油使磁珠混合液不会出现冻结情况，同时甘油的高粘性使磁珠保持较好的分散效果，可以使磁珠保存的温度范围更广：冷冻、冷藏和常温条件均可保存较长时间。
一种采用上述磁珠混合液保存核酸的方法，将核酸加入磁珠混合液中保存，保存温度为-25℃至30℃。优选的，保存温度为：-20±5℃、2-8℃或室温。优选的，核酸为DNA或重组质粒。磁珠混合液保存核酸量为10-5×107copy/μL。
采用本发明的磁珠混合溶液作为核酸(或含核酸的载体颗粒)溶剂，可以在核酸提取时同时进行监控核酸的提取，节省磁珠法核酸提取试剂的加样步骤，同时可以保证复孔间核酸加入浓度的均一性。
本发明的核酸保存方法中采用磁珠混合液能稳定保存核酸，使核酸浓度在冷冻、冷藏和室温条件下仍保持不变，还能有效减少核酸的局部断裂。磁珠混合液中的蛋白酶K能使溶液中的DNase或RNase水解、变性剂能将蛋白质的氢键、疏水键打开，引起蛋白质构象变化而失活。采用本发明的核酸保存方法，核酸保存时间达到两年以上。
一种包含上述磁珠混合液的核酸提取试剂，还包括内标重组质粒，内标重组质粒溶解于磁珠混合液中。内标重组质粒保存于磁珠混合液中有较长的保存时间和较宽的保存温度范围，在核酸提取时，可一次取相应体积即可均匀添加所需组分，用量更精准、操作更加简单；将各成分按比例预混，还能降低包装成本和运输成本。
一种包括上述核酸提取试剂的试剂盒，还包括引物组、检测探针、内标探针和核酸提取试剂。通过内标重组质粒采用竞争性内标有效监控假阴性，内标采用与靶点相同的引物对序列，扩增产物长度与靶点扩增产物长度相同，同时具有相同的CG含量，因此能最大限度与靶点保持相同的扩增效率，达到最佳的监控假阴性效果。
采用该试剂盒的核酸提取试剂提取核酸时，可一次取相应体积即可均匀添加所需组分，用量更精准、操作更加简单；将各成分按比例预混，还能降低包装成本和运输成本。
实施例1
一、核酸提取步骤如下：
(1)在1.5mL离心管中加入450μL细胞裂解液、40μL磁珠混合液、250μL 样本，混匀2分钟后室温静置10分钟。进行短暂离心，吸附磁珠，弃除所有溶液。
(2)加入500μL洗涤液，混匀2分钟后室温静置2分钟。进行短暂离心，吸附磁珠，弃除所有溶液。
(3)加入500μL洗涤液，混匀2分钟后室温静置2分钟。进行短暂离心，吸附磁珠，弃除所有溶液。
(4)室温晾干磁珠10分钟后加入80μL洗脱液，混匀2分钟后室温静置5 分钟。进行短暂离心，吸附磁珠，收集纯化好的DNA溶液。
其中，样本为血清稀释的重组质粒溶液，重组质粒为：含HBV核酸序列重组质粒(载体：pUC57；克隆位点：Smal(Blunt)；载体抗性：Ampicillin)，血清为：阴性且外观澄清的血清。
二、配制荧光定量PCR反应液
PCR反应液：表1
名称 1测试
PCR反应预混液 20μL
HBV DNA 30μL
PCR反应预混液配方：表2
PCR反应条件：表3
三、本实施方式的磁珠混合液配方如表4所示：表4
本实施例的磁珠混合液回收率：
a)使用阴性血清稀释重组质粒至5.6×104copy/μL，采用磁珠混合液进行提取，采用上述的PCR反应试剂进行检测。
b)使用无DNase/RNase纯化水稀释重组质粒至1.75×105copy/μL，采用上述的PCR反应试剂进行检测。
表5
结果如表5和图1所示，混合重组质粒血清经过提取后，检测Ct均值与重组质粒直接检测Ct均值之差为0.33，Ct CV为0.849，说明磁珠混合液的回收效率达80％以上。
本实施例的磁珠混合液中的尿素10mM可由SDS 0.2-1％代替，磁珠混合液仍具有较高的回收率。
本实施例的核酸保存方法，是将核酸保存于上述的磁珠混合液中，保存温度为-25℃至30℃，保存时间达到两年以上。核酸为DNA或重组质粒。
本实施例的核酸提取试剂包括上述的磁珠混合液和内标重组质粒，内标重组质粒溶解于上述磁珠混合液中。
本实施例的试剂盒，包括引物组、检测探针、内标探针和上述的核酸提取试剂。
实施例2
采用实施例1的核酸提取步骤和荧光定量PCR检测步骤进行磁珠混合液回收率分析。
本实施例的磁珠混合液配方如表6所述：
表6
组分名称 每mL用量范围
磁珠 100mg
蛋白酶K 50mg
尿素 10mM
Tris-Hcl 100mM
CaCl2 10mM
EDTA-Na2 10mM
甘油 50％
Carrier RNA 25μg
无DNase和RNase纯化水 补充至1mL
磁珠混合液回收率检测：
a)使用阴性血清稀释重组质粒至5.6×104copy/μL，采用磁珠混合液进行提取，采用PCR反应试剂进行检测。
b)使用无DNase/RNase纯化水稀释重组质粒至1.75×105copy/μL，采用PCR 反应试剂进行检测。
表7
c)结果如表7所示和图2，混合重组质粒血清经过提取后，检测Ct均值与重组质粒直接检测Ct均值之差为0.27，Ct CV为0.601，说明磁珠混合液的回收效率达85％以上。
本实施例的磁珠混合液中的尿素10mM可由SDS 0.2-1％代替，磁珠混合液仍具有较高的回收率。
本实施例的核酸保存方法，是将核酸保存于上述的磁珠混合液中，保存温度为-25℃至30℃，保存时间达到两年以上。核酸为DNA或重组质粒。
本实施例的核酸提取试剂包括上述的磁珠混合液和内标重组质粒，内标重组质粒溶解于上述磁珠混合液中。
本实施例的试剂盒，包括引物组、检测探针、内标探针和上述的核酸提取试剂。
实施例3
采用实施例1的核酸提取步骤和荧光定量PCR检测步骤进行磁珠混合液回收率分析。
本实施例的磁珠混合液配方如表8所述：
表8
磁珠混合液回收率检测：
a)使用阴性血清稀释重组质粒至1×105copy/μL、1×104copy/μL、 1×103copy/μL，采用磁珠混合液进行提取，反应试剂进行检测。
b)使用无DNase/RNase纯化水稀释重组质粒至3.125×105copy/μL、 3.125×104copy/μL、3.125×103copy/μL，采用反应试剂直接检测。
表9
c)结果如表9和图3所示，混合重组质粒血清经过提取后1×105copy/μL(相当于3.125×105copy/μL)检测Ct均值与重组质粒直接检测Ct均值之差为0.36， Ct CV为0.06％；1×104copy/μL(相当于3.125×104copy/μL)检测Ct均值与重组质粒直接检测Ct均值之差为0.43，Ct CV为0.31％；1×103copy/μL(相当于 3.125×103copy/μL)检测Ct均值与重组质粒直接检测Ct均值之差为0.5，Ct CV 为0.59％。
说明磁珠混合液的回收效率达80％以上。
需要说明的是：在核酸提取步骤中，使用阴性血清稀释重组质粒至 1×105copy/μL，加入250μL样本，即样本中的重组质粒量为250×105copy，核酸提取的最后m加入80μL洗脱液除去磁珠，则提取得到的重组质粒浓度理论上应当是250/80×105copy/μL，即3.125×105copy/μL。因此，采用无DNase/RNase 纯化水稀释重组质粒至3.125×105copy/μL做对比试验。
实施例4
一、核酸提取步骤如下：
(1)在1.5mL离心管中加入450μL细胞裂解液、40μL磁珠混合液、250μL 样本，混匀2分钟后室温静置10分钟。进行短暂离心，吸附磁珠，弃除所有溶液。
(2)加入500μL洗涤液，混匀2分钟后室温静置2分钟。进行短暂离心，吸附磁珠，弃除所有溶液。
(3)加入500μL洗涤液，混匀2分钟后室温静置2分钟。进行短暂离心，吸附磁珠，弃除所有溶液。
(4)室温晾干磁珠10分钟后加入80μL洗脱液，混匀2分钟后室温静置5 分钟。进行短暂离心，吸附磁珠，收集纯化好的DNA溶液。
其中，样本为阴性样本(例如血清、血浆或其他)。内标重组质粒：特异性引物扩增序列重组质粒。
二、配制荧光定量PCR反应液
PCR反应液：表10
名称 1测试
PCR反应预混液 20μL
待扩增DNA模板 30μL
PCR反应预混液配方：表11
组分名称 浓度 单反应用量
PCR缓冲液 5× 10μL
dNTPs(ATCGU) 100mM 0.72μL
正向引物 50μM 1μL
反向引物 50μM 1μL
检测探针 50μM 0.05μL
内标探针 50μM 0.05μL
Taq酶 5U/μL 0.5μL
UNG酶 1U/μL 0.01
无DNase和RNase纯化水 / 加至终体积20μL
待扩增DNA模板 / 30μL
total / 50μL
反应条件：表12
三、内标重组质粒回收率的检测。
磁珠混合液加入被保存的内标重组质粒的配方：表13
组分名称 每mL用量范围
磁珠 10mg
蛋白酶K 10mg
尿素 10mM
Tris-Hcl 100mM
CaCl2 10mM
EDTA-Na2 10mM
甘油 50％
Carrier RNA 25μg
内标重组质粒 6.25×104copy
无DNase和RNase纯化水 补充至1mL
内标重组质粒回收率：
a)使用混合磁珠混合液对阴性血清进行提取，PCR反应试剂进行检测。
b)使用无DNase/RNase纯化水稀释内标重组质粒至31.25copy/μL，直接进行PCR反应检测。
表14
c)结果如表14和图4所示，采用加入内标重组质粒的磁珠混合液进行阴性血清提取，与内标重组质粒等浓度直接扩增检测后，Ct均值之差为0.36，Ct CV 为0.122％，说明混合质粒的磁珠混合液对内标质粒回收率达到85％以上，同时孔间均一性有较优效果(CV＜1％)。
需要说明的是，内标重组质粒用于监测假阴性，磁珠混合液中的内标重组质粒需被提取出来参与PCR检测。本发明将内标重组质粒加入磁珠混合液中进行保存，不影响内标质粒的回收率。
实施例5
使用实施例4中的核酸提取步骤和荧光定量PCR检测方法。
磁珠混合液加入被保存的内标重组质粒的配方：表15
组分名称 每mL用量范围
磁珠 10mg
蛋白酶K 10mg
尿素 10mM
Tris-Hcl 100mM
CaCl2 10mM
EDTA-Na2 10mM
甘油 50％
Carrier RNA 25μg
内标重组质粒 5×107copy
无DNase和RNase纯化水 补充至1mL
内标重组质粒回收率：
a)使用加入内标重组质粒的磁珠混合液对阴性血清进行提取，反应试剂进行检测。
b)使用无DNase/RNase纯化水稀释内标重组质粒至2.5×104copy/μL，直接进行反应检测。
表16
c)结果如表16和图5所示，采用加入内标重组质粒的磁珠混合液进行阴性血清提取，与内标重组质粒等浓度直接扩增检测后，Ct均值之差为0.44，Ct CV 为0.17％，说明混合质粒的磁珠混合液对内标质粒回收率达到82％以上，同时孔间均一性有较优效果(CV＜1％)。
需要说明的是，内标重组质粒用于监测假阴性，磁珠混合液中的内标重组质粒需被提取出来参与PCR检测。本发明将内标重组质粒加入磁珠混合液中进行保存，不影响内标质粒的回收率。
实施例6
使用实施例4中的核酸提取步骤和荧光定量PCR检测方法。
磁珠混合液加入被保存的内标重组质粒的配方：表17
内标重组质粒回收率：
a)使用加入内标重组质粒的磁珠混合液对阴性血清进行提取，反应试剂进行检测。
b)使用无DNase/RNase纯化水稀释内标重组质粒至5copy/μL，直接进行反应检测。
表18
c)结果如表18和图6所示，采用加入内标重组质粒的磁珠混合液进行阴性血清提取，与内标重组质粒等浓度直接扩增检测后，Ct均值之差为0.48，Ct CV 为0.831％，说明混合质粒的磁珠混合液对内标质粒回收率达到80％以上，同时孔间均一性有较优效果(CV＜1％)。
需要说明的是，内标重组质粒用于监测假阴性，磁珠混合液中的内标重组质粒需被提取出来参与PCR检测。本发明将内标重组质粒加入磁珠混合液中进行保存，不影响内标质粒的回收率。
实施例7
使用实施例4中的核酸提取步骤和荧光定量PCR检测方法。
磁珠混合液加入被保存的内标重组质粒的配方：表19
组分名称 每mL用量范围
磁珠 50mg
蛋白酶K 25mg
尿素 10mM
Tris-Hcl 100mM
CaCl2 10mM
EDTA-Na2 10mM
甘油 50％
Carrier RNA 25μg
内标重组质粒 6.25×104copy
无DNase和RNase纯化水 补充至1mL
PCR预混液配方：表20
组分名称 浓度 单反应用量
PCR缓冲液 5× 10μL
dNTPs(ATCGU) 100mM 0.72μL
正向引物 50μM 1μL
反向引物 50μM 1μL
基因探针 50μM 0.05μL
Taq酶 5U/μL 0.5μL
UNG酶 1U/μL 0.01
无DNase和RNase纯化水 / 加至终体积20μL
HBV DNA / 30μL
total / 50μL
DNA回收率：
a)使用阴性血清稀释HBV DNA溶液至2ng/μL，采用加入内标重组质粒的磁珠混合液进行提取，反应试剂进行检测。
b)使用无DNase/RNase纯化水稀释HBV DNA溶液至6.25ng/μL，直接进行反应检测。
表21
c)结果如表21和图7所示，用加入内标重组质粒的磁珠混合液进行阴性血清提取，与内标重组质粒等浓度直接扩增检测后，Ct均值之差为0.36，Ct CV为 0.122％，说明混合质粒的磁珠混合液对内标质粒回收率达到85％以上，同时孔间均一性有较优效果(CV＜1％)。
本实施例的检测结果表明，将内标质粒加入磁珠混合液中后对核酸提取的回收率几乎没有影响。
实施例8
一、加入内标重组质粒的磁珠混合液的配方：表22
二、磁珠混合液配方为：表23
组分名称 每mL用量范围
磁珠 50mg
蛋白酶K 25mg
尿素 10mM
Tris-Hcl 100mM
CaCl2 10mM
EDTA-Na2 10mM
甘油 50％
Carrier RNA 25μg
无DNase和RNase纯化水 补充至1mL
三、加入内标重组质粒的磁珠混合液的核酸提取步骤如下：
a)在1.5mL离心管中加入450μL细胞裂解液和40μL加入内标重组质粒的磁珠混合液。
b)在1.5mL离心管中加入250μL样本，混匀2分钟。
c)室温静置10分钟。
d)短暂离心，吸附磁珠，弃除所有溶液。
e)加入500μL洗脱液，混匀2分钟。
f)室温静置2分钟。
g)短暂离心，吸附磁珠，弃除所有溶液。
h)加入500μL洗脱液，混匀2分钟。
i)室温静置2分钟。
j)短暂离心，吸附磁珠，弃除所有溶液。
k)室温晾干磁珠10分钟。
l)加入80μL洗脱液，混匀2分钟。
m)室温静置5分钟。
n)短暂离心，吸附磁珠，收集纯化好的DNA溶液。
四、采用磁珠溶液核酸和单独内标重组质粒溶液的提取步骤如下：
a)在1.5mL离心管中加入450μL细胞裂解液、40μL磁珠混合液和5μL内标重组质粒溶液(内标重组质粒溶液：使用无DNase/RNase纯化水稀释内标重组质粒至31.25copy/μL)。
b)在1.5mL离心管中加入250μL样本，混匀2分钟。
c)室温静置10分钟。
d)短暂离心，吸附磁珠，弃除所有溶液。
e)加入500μL洗脱液，混匀2分钟。
f)室温静置2分钟。
g)短暂离心，吸附磁珠，弃除所有溶液。
h)加入500μL洗脱液，混匀2分钟。
i)室温静置2分钟。
j)短暂离心，吸附磁珠，弃除所有溶液。
k)室温晾干磁珠10分钟。
l)加入80μL洗脱液，混匀2分钟。
m)室温静置5分钟。
n)短暂离心，吸附磁珠，收集纯化好的DNA溶液。
五、加入内标重组质粒的磁珠混合液的稳定性
a)把配制的加入内标重组质粒的磁珠混合液分装成250μL/份，共18份，其中6份储存于-20±5℃、6份储存于2～8℃、6份储存于室温。
b)把配制的磁珠混合液分装成250μL/份，共7份，储存于-20±5℃；将内标重组质粒使用无DNase/RNase纯化水稀释内标重组质粒至31.25copy/μL，分装成5μL/份，共7份，储存于-20±5℃。
c)将a)和b)的试样分别在储存10d、1个月、3个月、6个月、12个月取出进行阴性样本提取检测，采用第三和第四的核酸提取步骤进行核酸提取，通过荧光定量PCR检测进行回收率测定。
d)从数据来看，内标重组质粒单独保存在-20±5℃条件下，稳定性较差，浓度偏差超过1个Ct(2倍)，将内标重组质粒加入磁珠混合液保存较为稳定，基本偏差在0.5个Ct以内(PCR扩增的允许偏差范围)，同时复孔间CV均在1％左右，说明孔间均一性较好。内标重组质粒保存于磁珠混合液，其在室温条件下保存较为稳定。采用本发明的磁珠混合液进行内标重组质粒保存，在常温下有更好的保存稳定性，节省保存成本。相应的，保存有内标重组质粒的磁珠混合液作为核酸提取试剂，和引物组、检测探针及内标探针组成试剂盒，是的HBVDNA的检测更加高效精准，并且能够降低试剂盒本身的成本和保存成本。
表24
需要说明的是：本发明的实施例中采用荧光定量PCR检测磁珠混合液的回收率，用于检测有效片段的回收率，检测结果中没有其他杂质核酸和大片化核酸干扰，本发明的磁珠混合液和核酸提取试剂对核酸有较高的保护程度，片段化程度低。目前的电泳法和分光光度法检测核酸回收率是检测回收的总核酸量， DNA片段化程度和有效片段无法验证。相对于目前的电泳法和分光光度法检测回收率，通过荧光定量PCR检测能够检测真正意义上磁珠混合液的回收率。
以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种磁珠混合液，其特征在于，包括磁珠、蛋白酶、变性剂、甘油、缓冲剂和核酸助沉剂。
2.根据权利要求1所述的磁珠混合液，其特征在于，所述磁珠为氨基磁珠、羧基磁珠或环氧基磁珠。
3.根据权利要求1所述的磁珠混合液，其特征在于，所述缓冲剂为Tris-Hcl、EDTA-Na2和CaCl2。
4.根据权利要求3所述的磁珠混合液，其特征在于，所述变性剂为尿素或SDS。
5.根据权利要求4所述的磁珠混合液，其特征在于，每毫升的所述磁珠混合液包含磁珠10-100mg、蛋白酶10-50mg、Tris-Hcl 100mM、EDTA-Na2 10mM、CaCl2 10mM、尿素10mM、甘油50％、核酸助沉剂25μg，无.DNase和RNase纯化水补足1mL。
6.一种采用权利要求1-5任一项所述磁珠混合液保存核酸的方法，其特征在于，将核酸加入所述磁珠混合液中保存，保存温度为-25℃至30℃。
7.根据权利要求6所述的采用磁珠混合液保存核酸的方法，其特征在于，所述核酸为DNA或重组质粒，所述磁珠混合液保存核酸量为1×104-5×107copy/mL。
8.根据权利要求7所述的采用磁珠混合液保存核酸的方法，其特征在于，所述保存温度为：-20±5℃、2-8℃或室温。
9.一种包含权利要求1-6任一项所述磁珠混合液的核酸提取试剂，其特征在于，还包括内标重组质粒，所述内标重组质粒溶解于所述磁珠混合液中。
10.一种包括权利要求9所述核酸提取试剂的试剂盒，其特征在于，还包括引物组、检测探针和内标探针。
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