CN108323173A - 一种酶法合成氯霉素中间体的方法 - Google Patents

一种酶法合成氯霉素中间体的方法 Download PDF

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CN108323173A CN201880000133.5A CN201880000133A CN108323173A CN 108323173 A CN108323173 A CN 108323173A CN 201880000133 A CN201880000133 A CN 201880000133A CN 108323173 A CN108323173 A CN 108323173A
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Abstract

本发明公开了一种酶法合成氯霉素中间体的方法，该方法采用硝基苯甲醛和甘氨酸为底物，在醛缩酶催化作用下，反应获得氯霉素中间体。本发明制备氯霉素中间体的方法，从廉价且易获得的原料开始，利用醛缩酶对底物硝基苯甲醛和甘氨酸进行反应获得。该反应降低原料成本，解决现有技术操作复杂、污染大、产率低等缺点。本发明方法转化率高，目标产物得率高，使得氯霉素中间体的工艺简单，所用醛缩酶经大肠杆菌发酵易得，生产成本和产品质量优于化学法，适合工业化生产。

Description

一种酶法合成氯霉素中间体的方法
技术领域
本发明属于生物制药和生物化工的技术领域，涉及一种氯霉素中间体的制备方法。
背景技术
氯霉素是由委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuela)中分离提取的广谱抗生素。对大多数革兰氏阴性和阳性菌都具有很强抗性。其抗菌机制是与核蛋白体50S亚基结合，抑制肽酰基转移酶，从而抑制蛋白质合成。氯霉素作为一种临床应用广泛的抗生素药物，具副作用小、药效高等优点。目前，国内总产量达到3000吨以上，其中出口2000吨左右，国内消耗1000吨左右。近年来，全世界的用量正在不断地扩大。因此，开发一种绿色高效的氯霉素工业化方法受到广大研究者的关注。
氯霉素合成一般采用化学合成途径，几乎没有酶法合成关键中间体的报道。其中，CN 106566851 A发明一种利用酮还原酶制备一种氯霉素类化合物的方法。其结构与我们的结构有明显差异。
其合成路线如下：
化学合成存在的缺点：制备工艺复杂，反应步骤长尤其是拆分的步骤非常繁琐，反应条件苛刻，整体收率偏低，消耗大量有机试剂，产生大量有害成分，对环境造成严重污染。CN 106566851 A给出的方法存在的缺点是原料价格较贵，获取困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酶法合成氯霉素中间体的方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种酶法合成氯霉素中间体的方法，其特征在于，该方法采用硝基苯甲醛和甘氨酸为底物，在醛缩酶催化作用下，反应获得氯霉素中间体，其结构式为：
优选的，所述醛缩酶为苏氨酸醛缩酶。
更优选的，所述苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO：1～4中的一种。
优选的，上述反应体系中，硝基苯甲醛和甘氨酸的浓度分别为0.04～0.1M、0.5～1M。
优选的，上述反应体系中还含有溶剂。
优选的，所述溶剂为助溶剂的缓冲溶液，所述助溶剂包括但不限于二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺中的至少一种，所述缓冲溶液包括但不限于磷酸缓冲液、乙酸缓冲液中的至少一种。
当醛缩酶为SEQ ID NO：2所示的醛缩酶时，助溶剂优选为二甲基亚砜；当醛缩酶为SEQ ID NO：4所示的醛缩酶时，助溶剂优选为二甲基甲酰胺。
优选的，所述溶剂中助溶剂的体积浓度为20～50％。
优选的，所述缓冲液的pH值为5～6，浓度为0.08～0.12M。
优选的，上述反应体系中还含有磷酸吡哆醛。
优选的，所述磷酸吡哆醛在反应体系中的浓度为0.1～0.7mM。
优选的，上述反应的温度为0～50℃，更优选反应温度为5～40℃；进一步优选的，反应温度为5～10℃。
优选的，上述反应时间为2～38h，更优选的反应时间为2～6h。
优选的，上述反应体系的pH值为1～10，更优选的，pH值为6～7。
优选的，上述反应结束后，所得产物经HPLC分离纯化得氯霉素中间体。
本发明的有益效果是：
(1)本发明制备氯霉素中间体的方法，从廉价且易获得的原料开始，利用醛缩酶对底物硝基苯甲醛和甘氨酸进行反应获得。该反应降低原料成本，解决现有技术操作复杂、污染大、产率低等缺点。
(2)本发明方法转化率高，目标产物得率高，使得氯霉素中间体的工艺简单，所用醛缩酶经大肠杆菌发酵易得，生产成本和产品质量优于化学法，适合工业化生产。
附图说明
图1产物氯霉素中间体(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸的HPLC检测图；
图2为2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸顺反构型标准品的HPLC检测结果；
图3为氯霉素中间体核磁共振的表征图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1一种氯霉素中间体的制备方法
(1)苏氨酸醛缩酶的制备
苏氨酸醛缩酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)由LTA基因编码，将基因序列优化后进行人工合成的基因片段，插入到表达质粒pET-22b得到重组表达质粒pET-22b-LTA01。pET-22b-LTA01质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)用来表达苏氨酸醛缩酶。挑取含有重组质粒的单克隆接种到50mL LB液体培养基(50微克/mL氨苄青霉素)，37℃，200rpm，过夜培养。吸取20mL培养液转接到1L LB液体培养基(50微克/mL氨苄青霉素)，37℃，200rpm振荡培养。当OD600为0.6时，加入IPTG终浓度为0.5mM，30℃诱导16-20h后，停止培养，5000rpm离心10min，收获菌体。菌体用适量PBS稀释后，超声波破碎，即得苏氨酸醛缩酶的粗酶液。
(2)氯霉素中间体的制备方法
取1.8g对硝基苯甲醛和9g甘氨酸，投入500ml反应瓶中，瓶中事先加入含40％v/v乙醇-乙酸乙酯助溶剂的乙酸缓冲液(pH5.5 0.1M)200mL。搅拌桨转速300rpm，使底物充分混匀。然后加入PLP(磷酸吡哆醛)使体系终浓度达0.6mM，20ml粗酶液，用10M NaOH的调节pH到6.0左右，30℃反应26h。反应结束后对产物进行HPLC分离纯化(如图1和表1)，获得氯霉素中间体，其为顺式构型，具体命名为(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸，其结构式为：
将本实施例产物氯霉素中间体与2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸顺反构型标准品的HPLC检测结果(图2和表2)进行对比，进一步证实了本发明产物氯霉素中间体确实为顺式构型，即(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸。
表1产物氯霉素中间体(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸的HPLC检测结果
注：N.A表示未知，
顺式表示(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸；
反式表示(2S,3S)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸。
表2为2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸顺反构型标准品的
注：顺式表示(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸；
反式表示(2S,3S)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸。
另外，进一步对本发明所得产物氯霉素中间体进行核磁共振(NMR)表征，所得表征图如图3所示，说明本发明所得产物氯霉素中间体为(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸。
对本实施例的转化率进行检测，底物对硝基苯甲醛转化率达91.79％，目标产物(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸得率为45.9％。
实施例2一种氯霉素中间体的制备方法
(1)苏氨酸醛缩酶的制备
苏氨酸醛缩酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)由LTA基因编码，将基因序列优化后进行人工合成的基因片段，插入到表达质粒pET-22b得到重组表达质粒pET-22b-LTA02。pET-22b-LTA02质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)用来表达苏氨酸醛缩酶。挑取含有重组质粒的单克隆接种到50mL LB液体培养基(50微克/mL氨苄青霉素)，37℃，200rpm，过夜培养。吸取20mL培养液转接到1L LB液体培养基(50微克/mL氨苄青霉素)，37℃，200rpm振荡培养。当OD600为0.6时，加入IPTG终浓度为0.5mM，30℃诱导16-20h后，停止培养，5000rpm离心10min，收获菌体。菌体用适量PBS稀释后，超声波破碎，即得苏氨酸醛缩酶的粗酶液。
(2)氯霉素中间体的制备方法
取3.02g对硝基苯甲醛和15g甘氨酸，投入500ml反应瓶中，瓶中事先加入含30％(V/V)二甲基亚砜溶剂的磷酸缓冲液(pH5.5 0.1M)200mL。搅拌桨转速300rpm，使底物充分混匀。然后加入PLP(磷酸吡哆醛)使体系终浓度达0.5mM，20ml粗酶液，用10M NaOH的调节pH到7.0，5℃反应4h，反应体系中，对硝基苯甲醛和甘氨酸的浓度分别为0.1M、1M。对硝基苯甲醛转化率达99％，反应结束后对产物进行HPLC分离纯化，获得氯霉素中间体，其为顺式构型，具体命名为(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸，得率48％。
实施例3一种氯霉素中间体的制备方法
(1)苏氨酸醛缩酶的制备
苏氨酸醛缩酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示)由LTA基因编码，将基因序列优化后进行人工合成的基因片段，插入到表达质粒pET-22b得到重组表达质粒pET-22b-LTA03。pET-22b-LTA03质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)用来表达苏氨酸醛缩酶。挑取含有重组质粒的单克隆接种到50mL LB液体培养基(50微克/mL氨苄青霉素)，37℃，200rpm，过夜培养。吸取20mL培养液转接到1L LB液体培养基(50微克/mL氨苄青霉素)，37℃，200rpm振荡培养。当OD600为0.6时，加入IPTG终浓度为0.5mM，30℃诱导16-20h后，停止培养，5000rpm离心10min，收获菌体。菌体用适量PBS稀释后，超声波破碎，即得苏氨酸醛缩酶的粗酶液。
(2)氯霉素中间体的制备方法
取3.02g对硝基苯甲醛和15g甘氨酸，投入500ml反应瓶中，瓶中事先加入含20％(V/V)乙醇的磷酸缓冲液(pH5.5 0.1M)200mL。搅拌桨转速300rpm，使底物充分混匀。然后加入PLP(磷酸吡哆醛)使体系终浓度达0.6mM，20ml粗酶液，用5M NaOH的调节pH到7.0，20℃反应2h，反应体系中，对硝基苯甲醛和甘氨酸的浓度分别为0.1M、1M。对硝基苯甲醛转化率达92.1％，反应结束后对产物进行HPLC分离纯化，获得氯霉素中间体，其为顺式构型，具体命名为(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸，得率44.2％。
实施例4一种氯霉素中间体的制备方法
(1)苏氨酸醛缩酶的制备
苏氨酸醛缩酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示)由LTA基因编码，将基因序列优化后进行人工合成的基因片段，插入到表达质粒pET-22b得到重组表达质粒pET-22b-LTA04。pET-22b-LTA04质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)用来表达苏氨酸醛缩酶。挑取含有重组质粒的单克隆接种到50mL LB液体培养基(50微克/mL氨苄青霉素)，37℃，200rpm，过夜培养。吸取20mL培养液转接到1L LB液体培养基(50微克/mL氨苄青霉素)，37℃，200rpm振荡培养。当OD600为0.6时，加入IPTG终浓度为0.5mM，30℃诱导16-20h后，停止培养，5000rpm离心10min，收获菌体。菌体用适量PBS稀释后，超声波破碎，即得苏氨酸醛缩酶的粗酶液。
(2)氯霉素中间体的制备方法
取3.02g对硝基苯甲醛和15g甘氨酸，投入500ml反应瓶中，瓶中事先加入含20％(V/V)二甲基甲酰胺的磷酸缓冲液(pH5.5 0.1M)200mL。搅拌桨转速300rpm，使底物充分混匀。然后加入PLP(磷酸吡哆醛)使体系终浓度达0.7mM，20ml粗酶液，用5M NaOH的调节pH到6.0，10℃反应6h，反应体系中，对硝基苯甲醛和甘氨酸的浓度分别为0.1M、1M。对硝基苯甲醛转化率达94.1％，反应结束后对产物进行HPLC分离纯化，获得氯霉素中间体，其为顺式构型，具体命名为(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸，得率46.2％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 邦泰生物工程（深圳）有限公司
深圳市邦泰绿色生物合成研究院
<120> 一种酶法合成氯霉素中间体的方法
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Pro Asp Lys Ser Gln Gln Phe Ala Ser Asp Asn Tyr Ser Gly Ile
1 5 10 15
Cys Pro Glu Ala Trp Ala Ala Met Glu Lys Ala Asn Gln Gly His Glu
20 25 30
Arg Ala Tyr Gly Asp Asp Gln Trp Thr Ala Arg Ala Ser Glu Tyr Phe
35 40 45
Arg Lys Leu Phe Glu Thr Asp Cys Glu Val Phe Phe Ala Phe Asn Gly
50 55 60
Thr Ala Ala Asn Ser Leu Ala Leu Ser Ser Leu Cys Gln Ser Tyr His
65 70 75 80
Ser Val Ile Cys Ser Glu Thr Ala His Val Glu Thr Asp Glu Cys Gly
85 90 95
Ala Pro Glu Phe Phe Ser Asn Gly Ser Lys Leu Leu Thr Ala Arg Ser
100 105 110
Glu Ala Gly Lys Leu Thr Pro Asp Ser Ile Arg Glu Val Ala Leu Lys
115 120 125
Arg Gln Asp Ile His Tyr Pro Lys Pro Arg Val Val Thr Ile Thr Gln
130 135 140
Ala Thr Glu Val Gly Ser Val Tyr Arg Pro Glu Glu Leu Lys Ala Ile
145 150 155 160
Ser Ala Thr Cys Lys Glu Leu Gly Leu Asn Leu His Met Asp Gly Ala
165 170 175
Arg Phe Ser Asn Ala Cys Ala Phe Leu Gly Cys Thr Pro Ala Glu Leu
180 185 190
Thr Trp Lys Ala Gly Val Asp Val Leu Cys Phe Gly Gly Thr Lys Asn
195 200 205
Gly Met Ala Val Gly Glu Ala Ile Leu Phe Phe Asn Arg Glu Leu Ala
210 215 220
Glu Asp Phe Asp Tyr Arg Cys Lys Gln Ala Gly Gln Leu Ala Ser Lys
225 230 235 240
Met Arg Phe Leu Ser Ala Pro Trp Val Gly Leu Leu Glu Asp Gly Ala
245 250 255
Trp Gln Arg His Ala Ile His Ala Asn Arg Cys Ala Gln Leu Leu Ser
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Arg Asn Lys Gly Trp Arg Phe Tyr Thr Phe Ile Gly Ser Gly Gly Ala
305 310 315 320
Arg Phe Met Cys Ser Trp Asp Thr Glu Glu Ala Arg Val Arg Glu Leu
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<400> 2
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20 25 30
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245 250 255
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<211> 346
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Ser Ala Thr Cys Lys Glu Leu Gly Leu Asn Leu His Met Asp Gly Ala
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Pro Leu Glu Glu Leu Val Arg Ile Lys Ala Trp Cys Met Glu Asn Gly
165 170 175
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180 185 190
Ser Gly Val Pro Leu Lys Gln Tyr Gly Glu Ile Phe Asp Ser Ile Ser
195 200 205
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225 230 235 240
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385

Claims (10)

1.一种酶法合成氯霉素中间体的方法，其特征在于，该方法采用硝基苯甲醛和甘氨酸为底物，在醛缩酶催化作用下，反应获得氯霉素中间体，其结构式为：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醛缩酶为苏氨酸醛缩酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列选自SEQID NO：1～4中的一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中，硝基苯甲醛和甘氨酸的浓度分别为0.04～0.1M、0.5～1M。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中还含有溶剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述溶剂为助溶剂的缓冲溶液，所述助溶剂包括但不限于二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺中的至少一种，所述缓冲溶液包括但不限于磷酸缓冲液、乙酸缓冲液中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中还含有磷酸吡哆醛。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述磷酸吡哆醛在反应体系中的浓度为0.1～0.7mM。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应温度为0～50℃。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系的pH值为1～10。
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