CN108300759A - 基于荧光染料toto-1分析检测parp-1活性的方法 - Google Patents

基于荧光染料toto-1分析检测parp-1活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于TOTO‑1荧光染料分析检测PARP‑1活性的方法。所述方法步骤如下：(1)激活DNA、PARP‑1(多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶‑1)、NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)混合反应，PARP‑1催化合成带大量负电荷的PAR聚合物(聚ADP‑核糖)；(2)得到的产物用ExoIII切除双链。释放出PAR；(3)将TOTO‑1(噻唑橙二聚体‑1)与产物PAR聚合物作用，利用荧光光谱仪对产物溶液进行检测。本发明利用TOTO‑1与产物PAR聚合物结合后产生的荧光信号的增强作用，观察荧光信号强度变化，可用于检测PARP‑1酶。本发明具有简便、快速、灵敏度高、而且无需标记DNA探针的优点。

Description

基于荧光染料TOTO-1分析检测PARP-1活性的方法
技术领域
本发明属于一种定量检测PARP-1(多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1)活性的技术，通过TOTO-1与PAR的吸附作用，引起TOTO-1荧光信号的增强，检测荧光信号实现在临床检测的应用，具体涉及TOTO-1荧光染料定量检测生物酶的应用领域。
背景技术
PARP，也称聚ADP核糖聚合酶，是一类存在于多数真核细胞中的蛋白质翻译后修饰酶，这个家族包含18种酶，其中PARP-1含量最高，是一种在正常生理活动和疾病的发生发展中都起关键作用的细胞功能调节剂。在基因稳定和肿瘤的发生发展、炎症和应激反应、代谢和能量消耗、昼夜节律等方面都起重要的调节作用。它们主要存在于细胞核内，少量存在于细胞质内，是催化PAR(聚腺苷二磷酸核糖)合成的酶，PARP-1是一种聚ADP核糖聚合酶，其在正常细胞和肿瘤细胞中表达水平的差异、以及该差异在临床药物或PARP-1抑制剂共存时的变化对研究肿瘤的发生发展和疗效评价有重要意义。在此基础上，运用抑制剂抑制PARP参与介导的肿瘤细胞DNA损伤修复，更是当前研究热点之一。
PARP活性检测的传统技术主要有酶联免疫法，使用抗-PAR的单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠lgG二抗，建立检测沉积在免疫组蛋白上的PAR的比色方法或化学发光方法；或者采用放射性NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的方法来测定了PARP的酶活性。但此类方法有的需要标记，具有成本高、需要样品量较大、灵敏性差、检测时间长的缺点，而且有时候会得到假阳性结果。目前，Hergenrother等采用化学定量NAD+的方法间接测定了PARP-1的酶活性，可用于小分子抑制剂的高通量筛查；并合成了ADP-ribose-pNP 显色底物，发展了简单、灵敏的比色方法来评价PARP的活性。然而，这种方法需要繁琐的合成。因此，该方法存在很多局限性。
近年来，为解决PARP分析方法的弊端，研究者们已经开发了许多简单、可执行的分析方法并将之应用到PARP活性的检测中，例如比色检测、荧光检测、电化学检测等。例如，湖南大学聂舟教授利用PAR对荧光蛋白scGFP与阳离子聚合物CCP间荧光共振能量转移效率的调节作用，建立了PARP活性的荧光检测方法；南京师范大学戴志晖教授利用六氨合钌做指示剂，根据PAR静电吸附六氨合钌的量建立了PARP的电化学检测新方法；受以上方法的启发，我们建立了一种基于TOTO-1(噻唑橙二聚体-1)荧光检测PARP-1活性的方法，此方法无需标记，易操作，而且与上述的比色方法相比，具有稳定性高、检测线低、检测范围广的优点。
发明内容
发明目的：针对现有技术的问题，提供了一种基于荧光染料TOTO-1分析检测PARP-1 活性的方法。本发明中利用PARP-1催化合成的聚ADP核糖链与TOTO-1孵育后会有荧光信号增强作用，它具有灵敏度高、准确性好、无标记等优点。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于TOTO-1分析检测PARP-1活性的方法，所述包括以下步骤：
(1)激活DNA、PARP-1、NAD+混合反应，PARP催化合成带大量负电荷的PAR 聚合物(聚ADP-核糖)；
(2)得到的产物用ExoⅢ切除双链，释放出所述PAR。
(3)将TOTO-1与产物PAR孵育1h，利用荧光光谱仪对产物溶液进行检测。
作为本发明改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述激活DNA为两条特定序列的单链DNA：
单链DNA1:5’-CCCGTGCGTGCGCGAGTGAGTTG-3’
单链DNA2：5’-CAACTCACTCGCGCACGCACGGG-3’
形成激活双链DNA的方法为：所述两条定序列的单链DNA在95℃水浴5分钟慢慢冷却至室温，形成杂交的双链DNA(双链DNA)，其与聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶 (PARP-1)结合，以激活PARP-1的活性。
作为本发明改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述步骤(1)具体如下：用反应缓冲溶液将PARP配置成不同的浓度，在含有双链DNA、NAD+的反应缓冲溶液中滴加不同浓度的PARP,30～38℃反应1～2h。
作为本发明改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述双链DNA浓度为25～200nM。
作为本发明改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述NAD+浓度为100～500μM
作为本发明改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述反应缓冲溶液为含有 KCl、MgCl2、Zn(OAc)2的pH 7.2～7.4的50mM Tris-HCl，所述KCl初始浓度为50mM， MgCl2初始浓度为2Mm，Zn(OAc)2初始浓度为50μM。
作为本发明改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述步骤(3)具体如下：取TOTO-1荧光材料加入到已反应的PARP-1溶液中，反应40～60min，对其溶液荧光光谱检测。
作为本发明改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述缓冲溶液为pH 7.4的PBS缓冲溶液。
作为本发明改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述PBS缓冲溶液为含有KCl、NaCl、Na2HPO4、KH2PO4的pH7.4水溶液，所述KCl初始浓度为2.7mM，NaCl 初始浓度为137mM，Na2HPO4初始浓度为10mM，KH2PO4浓度为2mM。
作为本发明改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述TOTO-1的最终浓度为25～300nM。
相对于现有技术，本发明具有以下优点有益效果：
(1)本发明无需标记，简化了检测方法，避免了标记DNA探针而导致检测成本高、操作烦琐，重现性差的缺陷。
(2)本发明利用TOTO-1可与单链DNA作用，同时与PolyA结合时荧光信号较强，同时，扩增产物PAR是一种聚ADP结构，与A碱基结构类似，所以将这种现象用于 PARP-1的检测，简单、实用。
(3)本发明有效利用了纳米材料的特性，不需要借助精密仪器检测，简化了检测方法，极大地降低了病毒检测成本，本发明具有成本低、快速、简便、敏感且特异性好的优点。
(4)本方法可成功检测加入血清中的PARP的活性，具有一定的临床意义。
附图说明
图1PAR形成示意图。
图2基于TOTO-1荧光检测PARP-1活性的流程图。
图3TOTO-1与PAR结合的激发发射光谱。
图4TOTO-1检测PARP-1原理图。图A：a:TOTO-1；b:双链DNA经ExoⅢ反应后的荧光强度；c:双链DNA、PARP-1经ExoⅢ反应后的荧光强度；d:双链DNA、NAD+经ExoⅢ反应后的荧光强度；e:双链DNA、NAD+、热失活PARP-1经ExoⅢ反应后的荧光强度；f:双链DNA、NAD+、0.8UPARP-1经ExoⅢ反应后的荧光强度。图B：a:TOTO-1； b:TOTO-1与NAD+；c:TOTO-1与PARP-1；d:TOTO-1与ExoⅢ；e:TOTO-1与NAD+、Exo Ⅲ；f:TOTO-1与NAD+、PARP-1；g:TOTO-1与NAD+、PARP-1、ExoⅢ。
图5显示了检测PARP-1活性的荧光光谱变化图。A：在不同的PARP浓度下，得到的荧光光谱图(PARP-1浓度(1U＝45ng)：(a)0(b)0.02(c)0.1(d)0.2(e)0.5(f)0.8(g)1.1(h)1.5(i)2(j)3)；B：荧光强度与PARP-1浓度的标准曲线；插图：荧光强度与PARP-1浓度之间的线性关系；从图中可以看出PARP-1在0.01U到1.5U呈良好的线性关系。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
本实验中用到的试剂和仪器：
多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)购于Trevigen(美国)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)购于阿拉丁，TOTO-1购于Thermo Fisher Scientific(美国)，荧光光谱仪(Fluoromax-4,Horiba JobinYvon,Japan)。
激活DNA序列：
ssDNA1:5’-CCCGTGCGTGCGCGAGTGAGTTG-3’
ssDNA2：5’-CAACTCACTCGCGCACGCACGGG-3’
实施例1：
基于TOTO-1分析荧光染料检测PARP-1活性的分析方法，检测步骤是：
DNA杂交步骤：在DNA杂交缓冲溶液(10mM Tris-HCl,pH 7.4,0.1M NaCl)中加入两条特定的DNA单链，95℃水浴5分钟慢慢冷却至室温，形成杂交的双链DNA双链 DNA)
PARP-1催化合成PAR的步骤：用反应缓冲溶液将PARP-1配置成不同的浓度，在含有双链DNA、NAD+的反应缓冲溶液(50mM Tris-HCl,pH 7.4,50mM KCl,2mM MgCl2, 和50μM Zn(OAc)2)中滴加0.1U PARP-1，37℃反应1h。
ExoⅢ切除DNA双链，释放出扩增好的PAR步骤：加入2μL溶解于10X的ExoⅢ缓冲溶液的ExoⅢ溶液，ExoⅢ最终浓度1.6U/μL，37℃反应两小时。
PARP-1活性检测步骤：取5μL 10μMTOTO-1加入到已生成PAR的溶液中，孵育 1h后，对其溶液进行记录和紫外–可见光谱检测。实验结果如图5显示，PARP-1在0.02～ 1.5U呈良好的线性关系，检测限时0.02U。
参考例
TOTO-1荧光强度，双链DNA经ExoⅢ反应后的荧光强度；双链DNA、PARP-1经 ExoⅢ反应后的荧光强度；双链DNA、NAD+经ExoⅢ反应后的荧光强度；双链DNA、 NAD+、热失活PARP-1经ExoⅢ反应后的荧光强度；双链DNA、NAD+、0.8U PARP-1 经ExoⅢ反应后的荧光强度光谱图分别参见图4Aa-f。
对比例
为了证明激活DNA对PARP-1活性测试的必须性，进行空白试验测试，与实施例1 不同的是，在其他条件不变的情况下，在缺少激活DNA时进行PARP-1的荧光强度测试(也就是进行TOTO-1与PARP-1、NAD+、ExoIII混合溶液的荧光光谱)，测试结果如图4B g所示。
为了证明活性PARP-1对检测的必要性，进行空白试验实测，与实施例1不同的是，在其他条件不变的情况下，使用失活PARP-1进行荧光强度测试，测试结构如图4Ad所示。
实施例2
双链DNA与实施例1不同的是：选用不同浓度的PARP-1(1U＝45ng)：(a)0(b)0.02(c)0.1(d)0.2(e)0.5(f)0.8(g)1.1(h)1.5(i)2(j)3，得到荧光光谱如图5所示，可见在0～3U 范围内，PARP-1在0.02～1.5U呈良好的线性关系，检测限为0.02U。
尽管上面对本发明的实施例进行了描述，但本发明部限于上述具体的实施方式，上述具体的实施方式仅仅是示意性的，并不是限制性的，本领域技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所请求保护的范围情况下，还可以作出多种衍生形式，这些构思均属于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于TOTO-1(噻唑橙二聚体-1)分析检测PARP-1(多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1)活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)激活DNA、PARP-1、NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)混合反应，PARP催化合成带大量负电荷的PAR聚合物(聚ADP-核糖)；
(2)将得到的产物用ExoIII切除双链，释放出所述PAR；
(3)将TOTO-1与产物PAR孵育，利用荧光光谱仪对产物溶液进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述激活DNA为两条特定序列的单链DNA：
单链DNA1：5’-CCCGTGCGTGCGCGAGTGAGTTG-3’
单链DNA2：5’-CAACTCACTCGCGCACGCACGGG-3’
形成激活双链DNA的方法为：所述两条定序列的单链DNA在95℃水浴一段时间慢慢冷却至室温，形成杂交的双链DNA，其与所述PARP-1结合，以激活PARP的活性。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体如下：用反应缓冲溶液将PARP配置成不同的浓度，在含有双链DNA、NAD+的反应缓冲溶液中滴加不同浓度的PARP，温育一段时间。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述双链DNA浓度为25～200nM。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述NAD+浓度为100～500μM。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述反应缓冲溶液为含有KCl、MgCl2、Zn(OAc)2的pH 7左右的Tris-HCl缓冲液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体如下：得到的产物用ExoIII切除双链。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体如下：取TOTO-1加入到已反应好的PAR溶液中，反应一段时间，对其溶液进行荧光光谱检测。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为pH 7.4的PBS缓冲溶液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述TOTO-1的最终浓度为25～300nM。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101139629A (zh) * 2006-09-08 2008-03-12 上海主健生物工程有限公司 一种通过parp1基因检测肺癌易感性的试剂盒
EP1841461B1 (de) * 2005-01-30 2010-04-14 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Iniizierbares mittel zur zielgerichteten behandlung von retinalen ganglienzellen
US20100330583A1 (en) * 2009-06-26 2010-12-30 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for identification of PARP function, inhibitors, and activators

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1841461B1 (de) * 2005-01-30 2010-04-14 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Iniizierbares mittel zur zielgerichteten behandlung von retinalen ganglienzellen
CN101139629A (zh) * 2006-09-08 2008-03-12 上海主健生物工程有限公司 一种通过parp1基因检测肺癌易感性的试剂盒
US20100330583A1 (en) * 2009-06-26 2010-12-30 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for identification of PARP function, inhibitors, and activators

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YUANYUAN XU等: "Stable and Reusable Electrochemical Biosensor for Poly(ADP-ribose)Polymerase and Its Inhibitor Based on Enzyme-Initiated Auto-PARylation", 《ACS APPL. MATER. INTERFACES》 *
魏应亮: "PARP1 在结直肠癌的表达及对SW620增殖与凋亡的影响", 《消化肿瘤杂志》 *

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