CN108291905B

CN108291905B - 用于检测错误折叠蛋白的装置及其使用方法

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Publication number: CN108291905B
Application number: CN201680041285.0A
Authority: CN
Inventors: 温迪·L·戴维斯; 丹尼尔·利文森
Original assignee: Gestvision Inc
Current assignee: Gestvision Inc
Priority date: 2015-07-15
Filing date: 2016-07-15
Publication date: 2020-09-11
Anticipated expiration: 2036-07-15
Also published as: US20210318299A1; TW201716778A; US11073516B2; MX2022010954A; BR112017028627A2; JP2018527587A; DK3322985T3; CN111965343B; CN111965343A; WO2017011727A1; US10564153B2; ES2903034T3; JP6885608B2; AU2016293547B2; PT3322985T; US20230251251A1; AU2023201820A1; AR105379A1; AU2016293547A1; TW202208853A

Abstract

本发明涉及诊断装置以及使用这些装置来检测与哺乳动物疾病或病症相关的目标蛋白的方法。具体地，目标蛋白可以是哺乳动物中与某些错误折叠的蛋白病症相关的错误折叠的蛋白，所述哺乳动物包括疑似患有或处于患有这些病症的风险的那些哺乳动物。

Description

用于检测错误折叠蛋白的装置及其使用方法

背景技术

根据美国妇产科医师协会(American College of Obstetricians andGynecologists)的研究，包括先兆子痫在内的妊娠高血压病症使全世界约10％的妊娠复杂化，并且是孕产妇和胎儿发病和死亡的主要原因[参考：Hypertension in Pregnancy,Report of the American College of Obstetricians and Gynecologists’Task Forceon Hypertension in Pregnancy,Obstetrics and Gynecology 122VOL.122,NO.5,2013年11月(ACOG 2013指南)]。此外，这些病况是早产和相关围产期并发症的主要原因[参考：Ananth CV,Vintzileos AM.J Matern Fetal Neonatal Med.2006:19(12):773-82]。妊娠高血压可分为1)先兆子痫-子痫，2)慢性高血压3)伴有叠加先兆子痫的慢性高血压或4)妊娠期高血压。

先兆子痫-子痫是一种了解不多的妊娠相关病况，是孕产妇死亡、早产和产妇医疗费用上涨的主要原因。在全球范围内，7.6万名孕妇的死亡是由于先兆子痫。先兆子痫是造成美国五分之一的与妊娠有关的死亡的原因，这种病况会导致癫痫、器官衰竭和死亡。妊娠约20周左右后最常见，而在产后期间的女性则处于危险之中。该病况会导致癫痫或抽搐，称为子痫。先兆子痫可分为轻度、重度、较不严重或较严重或无严重特征的先兆子痫、或有严重特征的先兆子痫。HELLP综合征是先兆子痫的亚型，其特征为患者具有溶血、肝酶升高和血小板计数降低的症状。出现不寻常的症状汇编(compilation of symptoms)的先兆子痫被称为非典型先兆子痫。

唯一已知的治疗方法是分娩婴儿，因此，先兆子痫是医学上指出的早产的主要原因，估计为所有早产的17％。据估计，美国医疗系统用于由于先兆子痫的分娩和母亲和婴儿的照顾的费用超过130亿美元。今天，先兆子痫的诊断仍然是一个挑战，因为它的特征只是其症状：最常见的是高血压和存在尿液蛋白。改善先兆子痫诊断的研究通常为寻找血液中上调或下调的已知生物标志物，但是已经产生全球有用诊断产品的发现却很少。

研究利用患有严重先兆子痫并由于诊断先兆子痫而需要医学上指示的分娩(MIDPE)的女性的尿液标本和无偏质谱蛋白分析方法而进行，并且发现了SERPINA-1和白蛋白的独特的非随机切割产物。关于SERPINA-1片段错误折叠并形成超分子聚集体的倾向的认识致使出现了先兆子痫可能是错误折叠病症这一提议，与阿尔茨海默氏病不同。[参见美国专利号8,263,342和Buhimschi等人的Am J Obstet Gynecol.2008 November；199(5):551.e1–551.16.doi:10.1016/j.ajog.2008.07.006.]。

此外，在患有先兆子痫的女性的尿液中发现了错误折叠的蛋白，其基于蛋白与刚果红(CR)染料(“刚果红”)结合。与构象状态依赖性抗淀粉样蛋白聚集体抗体结合的这些错误折叠的蛋白或“超分子聚集体”与高活性淀粉样前体蛋白(APP)加工途径和来自先兆子痫女性的胎盘中的淀粉样蛋白沉积物相关联。[参见Buhimschi等人，Sci.Transl.Med.6,245ra92(2014)]。斑点印迹亲和性测定法测量了洗涤后保留的CR(由于与错误折叠的蛋白结合)的比例(记为原始CR的％)，并将结果报告为刚果红保留(CRR)％。

在80名女性(40名需要医学指示的分娩，40名是“对照”健康妊娠)的可行性研究中，严重先兆子痫尿液中CRR％显著更高(P<0.001)，具有100％敏感性和特异性。在582名女性(横向和纵向队列中的)的验证性研究中，患有重度先兆子痫和在现有高血压或蛋白尿上叠加的先兆子痫的女性比其他所有临床分类具有更高的％CRR(P<0.001)。此外，诊断为患有轻度先兆子痫的女性中的75％、患有重度先兆子痫的89％、患有叠加先兆子痫的91％的CRR结果高于其他各组(P<0.05)。总体而言，在预测需要MIDPE的先兆子痫中，验证性队列中单独使用CRR具有85.9％灵敏度，85.00特异性，95％的阳性似然比(likelihood ratio)，95％的阴性似然比。CRR优于目前使用的先兆子痫临床筛查方法(与血压或尿液蛋白浸量尺(dipstick)相比，P<0.001；与美国妇产科医师协会(ACOG)推荐的临界值(cutoff)下的尿液蛋白与血压的组合相比，P＝0.004)(Buhimschi et al.,Sci.Transl.Med.6,245ra92(2014)and U.S.Patent No.9,229,009。)

刚果红也与纤维素结合，用于形成简单的基于纸的测定。将正常尿液-染料混合物施加到试纸会导致染料与纸中的纤维素结合，显现为红色紧密中心点。相反，来自具有嗜刚果红的(congophilic)尿液蛋白的女性的尿液则导致染料不再与纤维素结合，因为它与蛋白结合，而不是以弥散的方式分散成可视化的光晕。(参见美国专利申请公开号20150293115。)在涉及分娩分诊中心以排除先兆子痫的346名女性的临床研究中，使用CR简单纸试验(CRD)测试患者尿液。根据ACOG 2013指南的定义，对于先兆子痫的诊断，CRD测试显示出79％灵敏度，89％特异性，91％的阴性预测值，74％的阳性预测值[参考文献：Rood等人2016AJOG Volume 214,Issue 1,Supplement,Pages S24–S25]。CRD测试需要将尿液与染料混合，然后将尿液施加到测试纸上，结果可能难以读出和解释。

鉴于以上所述，对于可以床旁(at the point of care)使用以检测妊娠的哺乳动物，特别是女性中的可能性先兆子痫的简单诊断装置，仍然存在非常重要且尚未满足的需求。这样的装置通过提供关于女性是否处于先兆子痫风险或患有先兆子痫并因此应当立即接受治疗性干预的早期信息，有可能挽救成千上万名孕妇和她们的未出生的胎儿的生命。

本文提及的所有专利和出版物在此通过引用全部并入。

发明内容

本发明包括用于检测哺乳动物的生物样品中的至少一种蛋白的诊断装置。所述装置包括：a)样品接收材料，其中所述样品接收材料能够接收生物样品；b)检测试剂，其与生物样品中存在的至少一种蛋白反应(即结合)；c)捕获器(trap)，其与样品接收材料接触，并且能够将与生物样品中的至少一种蛋白结合的检测试剂与未与生物样品中的至少一种蛋白结合的检测试剂分离，由此与生物样品中的至少一种蛋白结合的检测试剂能够流过捕获器，并由此由捕获器捕获未与生物样品中的至少一种蛋白结合的检测试剂；d)毛细管床，其与捕获器接触，并被配置为在生物样品流过捕获器之后含有生物样品。如果在生物样品中检测到至少一种蛋白，则毛细管床显示结合的检测试剂。样品接收材料、捕获器和毛细管床被配置成依次接触。装置的样品接收材料可以包括例如检测试剂。而且，检测试剂可以在样品接收材料之上或之内。

此外，所述装置可以被装入壳体或盒中。所述壳体或盒可以包括用于生物样品施加的孔(或其他实体)，并且还可以包含用于读取所得结果的窗口。所述装置可以在各种临床和非临床环境中或在临床实验室中床旁使用。

如上所述，所述检测试剂结合生物样品中的至少一种蛋白。该至少一种蛋白可以是例如错误折叠的蛋白、蛋白聚集体、超分子蛋白聚集体及其混合物和每种蛋白的片段。所述至少一种蛋白可以包含β片层结构。另外，所述至少一种蛋白可以是嗜刚果红的。所述错误折叠的蛋白可以包括例如α-1抗胰蛋白酶(SerpinA1)、血浆铜蓝蛋白、重链IgG、轻链IgG、干扰素诱导蛋白6-16(IF16-6，G1P3)、白蛋白、其混合物或其片段或每种蛋白的片段。然而，所述错误折叠的蛋白不限于这些蛋白。例如，所述错误折叠的蛋白可以是导致或与蛋白错误折叠病症有关的任意蛋白(或蛋白的组合)。

所述检测试剂可以是例如偶氮染料、硫代黄素T或偶氮染料的类似物。可用于本发明的偶氮染料的实例是刚果红(即，4-氨基-3-[4-[4(1-氨基-4-磺酸基-萘-2-基)偶氮苯基]苯基]偶氮-萘-1-磺酸二钠)。(也可以使用刚果红的类似物，例如，式C₃₂H₂₂N₆Na₂O₆S₂的仲重氮染料(secondary diazo dye)也可以用作本文描述的与本发明装置有关的检测试剂)。刚果红可以预加载到上面提到的样品接收材料上。

本发明的装置的样品接收材料可以包括例如硝化纤维素，纤维素，玻璃纤维，棉，织造网，非织造材料，多孔塑料，聚合物和/或聚酯。所述聚酯可以是例如聚乙烯。

本发明的装置的捕获器可以包括例如硝化纤维素，纤维素，玻璃纤维，棉/玻璃纤维，织造网，非织造材料，聚合物和/或聚砜。

本发明的装置的毛细管床可以包含材料例如硝化纤维素，层析纸，聚砜和/或纤维素。

应该注意，本发明的装置在大约10分钟或更少，优选地大约5分钟或更少，更优选地大约3分钟或更少，最优选地1分钟或更少的时间内提供测试结果。此外，可以通过可视化获得定性或半定量结果。此外，如果需要，还可以获得半定量或定量结果，从而测量至少一种蛋白的量。

本发明还包括如上所述的诊断装置，其用于检测生物样品中错误折叠的蛋白、用于检测生物样品中的聚集蛋白和/或用于检测生物样品中的超分子聚集蛋白，其中所述样品获自哺乳动物，例如人、灵长类动物或基因工程化的哺乳动物。在一些情况下，所述哺乳动物可以是妊娠的。如上所述的装置可用于检测先兆子痫，当检测试剂与生物样品含有的错误折叠的蛋白、聚集蛋白和/或超分子聚集蛋白(即，与妊娠的哺乳动物的先兆子痫相关的蛋白)反应(即结合)时，其可以被诊断。所述装置的捕获器可以被配置为与所述装置的检测试剂竞争性地结合。所述装置可以被配置为包括所述样品接收材料、所述捕获器和所述毛细管床的侧流装置或条(strip)。

另外，本发明包括检测哺乳动物的生物样品中的至少一种蛋白的方法，其包括以下步骤：a)在足以使所述至少一种蛋白与所述检测试剂结合的时间和条件下，将所述哺乳动物的生物样品施加到本发明诊断装置的样品接收材料上；和b)检测所述毛细管床上检测试剂的存在，其中所述毛细管床上存在检测试剂表明所述生物样品中存在所述至少一种蛋白。

所述方法可以用于检测具有蛋白错误折叠病症或处于具有蛋白错误折叠病症风险的哺乳动物的生物样品中的至少一种蛋白。所述方法包括以下步骤：a)在足以使所述至少一种蛋白与所述检测试剂结合的时间和条件下，将所述哺乳动物的生物样品施加到上述诊断装置的样品接收材料上，和b)检测所述毛细管床上结合的检测试剂的存在，其中所述毛细管床上存在检测试剂表明所述生物样品中存在所述至少一种蛋白，并表明所述哺乳动物具有蛋白错误折叠病症。同样，所述至少一种蛋白可以是例如错误折叠蛋白、聚集蛋白、超分子聚集蛋白或其混合物、或具有β片层结构的蛋白例如嗜刚果红蛋白。所述至少一种蛋白可以是嗜刚果红的和/或可以具有β片层结构。更具体而言，错误折叠蛋白可以是例如α-1抗胰蛋白酶(SerpinA1)、血浆铜蓝蛋白、重链IgG、轻链IgG、干扰素诱导蛋白6-16(IF16-6，G1P3)、白蛋白、其混合物或片段、或每种蛋白的片段。所述蛋白错误折叠病症可以是例如先兆子痫、阿尔茨海默病、朊病毒病或帕金森病。以蛋白错误折叠病症为特征的其他疾病或症况中发现的错误折叠的蛋白，也可以使用本发明的装置检测。就使用本发明的装置诊断先兆子痫而言，可以诊断不同形式的先兆子痫，包括例如轻度先兆子痫、重度先兆子痫、非典型先兆子痫、溶血-肝酶升高-血小板计数降低(HELLP)综合征和子痫。此外，所述患者可能患有妊娠高血压病症。因此，本发明的方法可以用于区别诊断某些妊娠高血压病症，例如区分先兆子痫和高血压病况例如慢性高血压或妊娠期高血压或由于其他原因导致的高血压，或区分上述先兆子痫的类型。

用于上述方法并施加到样品接收垫的生物样品可以是例如尿液(洁净或天然捕获的)，血液，唾液，组织，组织间液，血清，血浆，脑脊液，羊水或提取的物质(例如，从鼻分泌物，耳垢，粪便物质和组织中提取的)。所述方法可用于来自哺乳动物的生物样品，所述哺乳动物例如人类、灵长类动物和基因工程化的哺乳动物。所述哺乳动物可以是妊娠的。在人的情况下，所述方法可以用于妊娠(即孕龄)约8至42周，优选妊娠约18至41周，更优选约20至41周或20周至分娩的孕妇。但是，本发明的方法也可以用于产后哺乳动物。应该注意的是，利用所述装置通过所述方法检测到的所述至少一种蛋白可以通过可视化检测从而获得定性或半定量结果或通过测量检测从而获得半定量或定量结果。在可视化之后，可以测量所述至少一种蛋白从而获得半定量或定量的结果。

另外，本发明包括一种试剂盒，其包括上述装置。所述试剂盒还可以包括校准器或对照试剂以及所述装置的使用说明书。而且，所述试剂盒可以包括样品施加器。

附图说明

图1示出了盒或壳体中的本发明的装置测试条(test strip)的照片。图1的左图显示了与生物样品接触之前壳体中的装置，具有样品孔、结果窗口和对照线。右图显示了测试已知与先兆子痫相关的错误折叠蛋白为阴性、弱阳性和阳性的尿液样品的装置结果。

图2示出了本发明装置的测试条实施方案的实例。所述条包括对照染料、显示条(display strip)(或毛细管床)、捕获器(例如，三片材料)、第二样品垫(或样品接收材料)、第一样品垫(或样品接收材料)和干燥在样品垫上的染料。

图3示出了本发明的诊断装置的一个实施方案。图3A示出了具有样品垫、捕获器和显示条的顶视图。图3B示出了与图3A相同的实施方案的侧视图。所述样本垫、捕获器和显示条可以对接在一起。图3C示出了样品垫、捕获器和显示条彼此重叠的实施方案(侧视图)。

图4显示了测试条内的不同材料配置。图4A示出了本发明的一个替代实施方案，其具有依次排列的两个样品垫、捕获器和显示条(毛细管床)，每个部件与相邻部件交叠。图4B示出了本发明的另一个替代实施方案，其具有依次交叠的两个样品垫、三层捕获器和显示条，每个部件与相邻部件交叠。

图5显示了本发明的测试条的浸量尺配置的实例。该实施方案在测试条的顶部配置有覆盖胶带。在测试条的顶部，胶带的颜色是不透明的，可以用来固定所述测试条。在中间，胶带是透明的从而为结果提供观察窗口。可以如此放置胶带以使得透明窗口例如在捕获器上方大约10mm处。窗口处的胶带可以被颜色(例如白色)包围，这使得能够容易地观察结果。在捕获器下方，胶带的颜色是不透明的以覆盖捕获器。在条的底部，胶带可以显示指示条的哪一端浸入测试样品中的箭头，并且可以显示指示将测试条浸入样品的最大水平的线。测试条的底端可以不具有覆盖胶带，以便于在浸入时芯吸测试样品。

具体实施方案

本发明是一种装置以及利用所述装置的方法。更具体地，所述装置是一种侧流层析快速测试，可以在多种临床和非临床环境中使用以便检测生物样本中的目标蛋白。所述装置可用于检测哺乳动物中的蛋白错误折叠病症。所述哺乳动物可能被怀疑患有一种或多种这样的病症或处于患这样的病症的风险中。

所述装置具有多种不同的实施方案，将在此进行描述。基本上，它包含用于检测生物样品中一种或多种目标蛋白的测试条(参见例如图1)。所述检测是通过一系列连续的反应进行的。所述测试条包括一定长度具有毛细管作用的侧流分析或层析材料，并具有第一末端，层析溶剂运送在此末端开始。它还有第二末端，层析溶剂运送在此末端结束。所述条包括位于第一和第二末端之间的多个区带(zone)或区域(region)(参见例如图2和3)。这些区带包括浸有检测试剂(例如染料)的第一区带。该检测试剂与生物学样品中的一种或多种目标蛋白特异性结合。第一区带也接收生物样品。相比之下，位于第一区带下游的第二区带保留未与生物样品中的一种或多种目标蛋白结合的检测试剂，同时允许与生物样品中的一种或多种目标蛋白结合的检测试剂被运送到第三区带。在样品通过第二区带之后，位于第二区带下游的测试条的第三区带接收所述样品。如果样品中存在目标蛋白，则第三区带将显示检测试剂。它还包括用于检测结合蛋白的检测试剂，作为生物样品中一种或多种蛋白的测量方法。在一个实施方案中，所述装置确定来自患者的生物样品中错误折叠蛋白的存在，并且允许确定患者是否患有蛋白错误折叠病症。可以通过可视化定性或半定量地确定一种或多种蛋白的存在，或者可以通过使用装置内可能存在的测量实体来进行半定量或定量。在将生物样品施加到第一区带后，第一区带释放样品中的检测试剂，并且第二区带将与一种或多种蛋白结合的检测试剂和未结合的检测试剂分离，并且仅允许结合的检测试剂被运送到第三区带，然后第三区带显示结合的检测试剂以供观察或测量。第一区带可以是样品接收材料。第二区带可以是捕获器。第三区带可以是毛细管床或显示条。

装置的具体元件或部件以及这些元件的特征或特性详细描述如下：

装置部件中使用的材料

样品接收材料、捕获器和毛细管床可由相同或不同的材料制成。这些材料在侧流装置和色层分析领域中通常是已知的[参见：EMD Millipore Rapid Lateral Flow TestStrips Considerations for Product Development，可获自EMD Millipore，比尔里卡市，马萨诸塞州]。基于影响毛细管流动并从而影响试剂沉积和测定性能的物理和化学特性来选择膜。所述材料包括例如但不限于硝化纤维素，滤纸，层析纸，纤维素，塑料聚合物，不对称聚砜膜，棉，短绒和/或玻璃纤维，聚酯，聚乙烯和聚砜。膜可以由聚合物制成，包括例如硝化纤维，聚偏二氟乙烯，尼龙和聚醚砜。垫材料经常用作样品接收材料以提供受控的样品接收，并促进流动到装置的相邻条材料。垫材料是多孔的，通常用纤维素(即滤纸)、玻璃纤维、织造网和合成非织造材料或聚酯制成。特别是如果期望将包含在样品中的外来物质从待分析样品的该部分中分离出时，例如从流体中分离出细胞物质，则可以使用过滤基质来进行样品接收。这些过滤基质可以是例如纤维素、不对称聚砜膜(包括但不限于Vivid^TM血浆分离膜和不对称亚微米(BTS)聚砜膜)。在装置条的末端，例如可以使用吸收垫作为吸芯(wick)以拉动样品通过侧流条，并且可以增加分析样品的量并提高分析灵敏度。这些吸收垫通常是纤维素或棉短绒，并基于床体积的厚度、可压缩性和均匀性来优化选择。整个条可以组装在背衬卡上，通常是塑料背衬和粘附卡。虽然这些不同的材料通常被认为是用于如本文所述的侧流装置的特定目的，但可以考虑每种材料的合适性能用于本发明的接收材料、捕获器和显示条的目的。有关材料的进一步讨论，请参阅实例。

测试条的配置中，特别是显示条中使用的其他材料在侧流技术和层析技术领域中是已知的。

装置的元件或部件

样品接收材料(样品垫)

装置的第一元件(以下称为样品接收材料或样品垫)充当海绵状物，并且保持过量的待测样品流体。接收材料吸收样品，但也允许它流动或芯吸到下一个相邻材料。它对样品中可能存在的目标蛋白以及检测试剂(例如染料)通常是惰性的，因此不与之反应，从而允许蛋白和检测试剂流过或芯吸穿过所述材料到侧流装置中的相邻材料。

样品接收材料可以浸入来自哺乳动物或患者的样品中，或者可选地，样品可以被间接地或直接地施加到样品接收材料。例如可以通过具有计量尖端的滴管、吸液管、移液管或能够重复分配患者样品的吸液管将样品施加到样品接收材料。如果样品接收材料被配置为浸入到生物样品中(例如参见图5)，则样品接收材料可以相对较长(例如但不限于约10mm)。如果样品接收材料被配置为接收通过例如滴管或吸液管施加的样品，则样品接收材料可以相对较短(在但不限于约5mm和约10mm之间)。通常，宽度可以从2mm到10mm，最通常是2.5到5mm(+0.5mm)。样品接收材料的长度和宽度可能有变化，取决于例如盒或壳体的尺寸以及生物样品与检测试剂充分混合的能力等因素。

具体地，样品接收垫充当毛细管基质，生物样品和检测试剂(例如染料)可以在其中自由混合。样品垫还可以具有干燥形式的检测试剂，适合于分析物(例如，生物样品中待检测的目标蛋白)与检测试剂之间的优化的化学反应。检测试剂可以预先装载到样品接收材料上。在一个实施方案中，当将生物样品(例如尿液)加入到样品接收垫上时，生物样品(例如尿液)溶解检测试剂，然后样品和检测试剂染料混合物通过流经样品垫传被运送过装置到相邻的材料，例如捕获器。

或者，样品垫包括一系列两个或更多个样品垫(参见例如图4)。例如，第一垫可以接收样品，第二垫可以包含检测试剂，由此生物样品从第一元件迁移到第二元件(垫)，第二元件(垫)包含干燥形式的检测试剂，适合于目标分析物和检测试剂之间的优化的化学反应。如果使用两种或更多种样品接收材料，则任一种可以包含检测试剂。优选地，第一样品接收材料包括检测试剂，第二样品接收材料不包含。

在另一个实施方案中，第一样品垫接收生物样品并被设计成分离出或保留样品中可能存在的不溶物质。过滤的样品然后流过第一样品垫或到第二垫，检测试剂被结合到第一或第二样品垫中，并允许适当混合检测试剂和样品。第二垫可以具有与第一垫相同或不同的组成。

此外，在另一个实施方案中，第一样品垫接收样品并且还含有检测试剂，第二垫为检测试剂与目标分析物的混合提供额外的时间，然后其进入条中的下一个相邻材料例如，捕获器。

在另外的实施方案中，样品接收材料包括用于检测试剂的底物并且在干燥时保持底物。检测试剂可以在样品接收材料之上或之内。一旦添加了患者样品，检测试剂就被释放。底物不会与患者样品反应或吸收患者样品，当施加患者样品时，其移动穿过基质并移动到邻近材料(例如捕获器)上。

应当注意的是，例如通过样品孔或装置用于接收样品的其他实体，可以将样品施加或放置在盒或壳体中。当样品孔或实体被组装或包装在盒或壳体内部时，可将样品孔或实体放置在例如测试条的样品接收材料上方。(参见图1)。

可用作样品接收材料或样品垫的材料在测流装置和色层分析领域中通常是已知的[参见：EMD Millipore Rapid Lateral Flow Test Strips Considerations forProduct Development,available from EMD Millipore，比尔里卡市，马萨诸塞州]，并基于影响样品接收、控制甚至毛细管流动和样品过滤的物理和化学特性进行选择。另外，如果样品接收材料也含有检测试剂，理想情况下，该材料是用于保持检测试剂并在添加试样时将其最佳释放的材料。垫材料是多孔的，通常用纤维素(例如滤纸)，玻璃纤维，织造网，合成的非织造材料或多孔塑料(例如聚酯)制成。可以用作样品接收材料的其它材料例如是聚砜不对称膜，棉/玻璃纤维材料如

8950，塑料聚合物膜例如聚乙烯(例如高密度聚乙烯)，聚四氟乙烯和多孔玻璃纤维膜(参见，例如Porex，Fairburn市，佐治亚州)。有关材料的进一步描述，请参阅实施例(即实施例2和6)。

应该注意，当检测试剂是对纤维素具有亲和力的染料时，本发明装置中使用的样品接收材料可以是纤维素，条件是存在足够的检测试剂以结合生物样品中的一种或多种改性的目标蛋白。更具体地，关于结合生物样品中的目标蛋白，例如一种或多种错误折叠的蛋白，不允许纤维素“竞争得过(out compete)”检测试剂。或者，如果纤维素所存在的基质与检测试剂的反应性比一种或多种改性目标蛋白更低，则纤维素可用于样品接收材料。(对于本文的目的，纤维素被定义为具有式(C₆H₁₀O₅)_n的有机化合物，并且特别地，是由数百至数千个β(1->4)连接的D-葡萄糖单元线性链组成的多糖)

捕获器

接下来，流体(例如，样品或与检测试剂混合的样品)从样品接收材料或样品垫流动穿过过滤器(以下称为“捕获器”)，所述捕获器被设计成保留任意未结合的检测试剂。特别地，捕获器用于将游离的检测试剂(例如染料)与侧流装置中的蛋白结合检测试剂分离。具体地，如果生物样品中不存在一种或多种目标蛋白，那么捕获材料允许样品流动通过到下一个相邻的材料，但是阻碍未结合的检测试剂的流动，保留或结合未结合的检测试剂。

捕获器邻接但优选与包含检测试剂(例如染料)的样品垫或一系列样品垫元件(参见例如图3)重叠。捕获器用于将与一种或多种测试样品目标蛋白(例如，错误折叠的一种或多种蛋白)结合的检测试剂与未与一种或多种测试样品蛋白结合的检测试剂分离，从而允许结合的检测试剂流动穿过同时保留未结合的检测试剂。或者，捕获器可以是一系列相同或不同材料的一个或多个过滤器。

不受理论的束缚，捕获器材料可含有用于检测试剂的底物，使得未结合的检测试剂结合捕获器材料并且不流至下一材料。已经与蛋白结合的检测试剂不会与捕获器中的底物结合，而是流至条中的下一个材料。底物可以是捕获器材料(例如纤维素)，或者可以是对捕获器材料的化学改性或添加。或者，捕获器材料组成的结构特征可以提供未结合的检测试剂的保留。

而且，捕获器可以由多个重叠或依次排列的材料片段组成，以优化保留未结合的检测试剂(见图4)。多个片段可以是相同的材料或由不同材料制成。过滤基质可用于捕获器，例如纤维素、热塑性聚合物如不对称聚砜膜(包括但不限于Vivid^TM血浆分离膜和不对称亚微米(BTS)聚砜膜)。有关捕获器材料的进一步描述，请参阅实施例(例如实施例2、4、5、8、13、14和16)。

出乎意料并且令人相当惊讶的是，实际上有许多硝化纤维素材料实际上效果好并允许尿液和结合了染料的蛋白流动穿过装置。例如，

AE99硝酸纤维素膜效果非常好。(参见表1)。还有纤维素材料效果相当好(例如，601、319、247，

CF1、CF3、CF4；EMI11513、5475、5493)，但也有一些纤维素材料表现不佳(例如，

270)。出乎意料地，对于使蛋白结合的CR染料流动而保持未结合的染料方面，表现良好的材料是Vivid^TM血浆分离材料(Pall公司)和不对称亚微米(BTS)聚砜膜(Pall公司)。(参见表1和2)。

当检测试剂是染料例如刚果红时，捕获器材料可以是例如滤纸、基于纤维素的和/或材料例如EMI 11513，EMI 5475，EMI 5493、1281、642，Standard 17、C048、LF1、LF1、VF2、CF1、CF3，Ahlstrom 319。捕获器长度可以是例如约5-10mm，或者它可以是一系列的片段，每个长5-10mm。

在一个实施方案中，捕获器保留游离的检测试剂(例如染料)，但允许蛋白结合的染料流过。在一个具体的实施方案中，捕获器由纤维素组成，检测试剂为刚果红。

检测试剂

检测试剂是与样品中一种或多种目标蛋白反应的物质。例如，检测试剂可以是与来自哺乳动物的生物样品(例如患者样品)中存在的一种或多种错误折叠的蛋白(例如嗜刚果红蛋白)、聚集蛋白和/或超分子聚集蛋白反应或对其具有结合亲和力的物质。检测试剂可以被预加载到试剂垫上(例如，被施加到试剂垫上、或将试剂垫浸入到检测试剂或染料中)。试剂垫可以是样品接收材料或样品接收垫。

在一个方面，检测试剂是对生物样品中的目标蛋白子集(如果存在的话)染色的染料。在一个实施方案中，检测试剂可以与错误折叠的蛋白反应。例如，染料可以是偶氮染料，例如刚果红(CR)或其类似物，缓冲的或无缓冲的。或者，其他染料可用作检测试剂，只要这些染料对生物样品或患者样品中的错误折叠的蛋白、聚集的蛋白和/或一种或多种超分子目标蛋白具有亲和性(并且可以与其结合或反应)。这类染料的实例包括但不限于刚果红类似物，例如在以下出版物中描述的那些：Sellarajah S et al,Synthesis of analoguesof Congo red and evaluation of their anti-prion activity,J Med Chem.2004Oct21；47(22):5515-34；and Hélène Rudyk et al,Screening Congo Red and itsanalogues for their ability to prevent the formation of PrP-res in scrapie-infected cells,Journal of General Virology(2000),81,1155–1164。用于检测一种或多种错误折叠的蛋白的检测试剂也可以是例如硫代黄素T。

此外，在本发明的一个方面中，检测试剂在装置中以干燥形式存在，但也可以以其它形式存在。当施加样品时，该形式的检测试剂适合于与样品最佳混合并允许与目标蛋白结合。该形式的检测试剂适合于装置的长期稳定性或保质期。在一个实施方案中，干燥的检测试剂是染料。此外，染料可以是刚果红，并且可以以例如0.1ug至800ug，更优选0.2ug至480ug，甚至更优选1ug至400ug，并且甚至更优选2.5ug至120ug的量存在于装置中。

刚果红(CR)(例如，缓冲的或非缓冲的)可以预先施加到样品接收材料上。例如，可以在试剂盒制造期间将CR溶液施加到材料上并在组装和包装之前干燥(参见图2和实施例6)。

检测试剂是可检测的，即肉眼可见的，或者例如通过目测检查和/或机械或电子阅读器检测。

本发明提供了例如在装置的制造或组装过程中，将检测试剂并入测试装置中。这是对先前的错误折叠蛋白检测装置的改进，在先前的装置中染料和生物样品需要在加入到测试中前混合。在一个优选的实施方案中，测试条包含含有检测试剂的样品接收材料。当将生物样品添加到测试装置中，进入样品接收材料时，其与样品接收材料中的检测试剂混合，并且生物样品检测试剂混合物流动穿过装置。

毛细管床(“显示条”)

具有或不具有蛋白结合检测试剂的样品(例如尿液)通过捕获器并进入毛细管床(以下称为“显示条”)，其在毛细管床上聚集。因此，显示条允许样品向条上流动，并显示是否存在检测试剂。特别地，显示条允许样品向条上流动，并显示是否存在检测试剂结合的分析物。然后可以通过人或机械方法使检测试剂或结合的试剂可视化(以获得定性结果)和/或然后测量(即半定量或定量)。最佳地，当存在目标蛋白时，显示条提供样品贯穿性的流动和检测试剂相对均匀的显示。在某些实施方案中，显示条上检测试剂的强度或浓度可以对应于样品中目标蛋白的量。在另一个实施方案中，检测试剂在显示条上向上流动的距离可以指示生物样品中目标蛋白的量。此外，检测试剂的强度和显示条向上的距离均可以指示样品中蛋白的浓度。此外，在检测错误折叠的蛋白聚集体或超分子聚集体的情况下，检测试剂的强度和显示条向上的距离均可以指示样品中存在的蛋白聚集体的大小。用于毛细管床的合适材料包括例如硝化纤维素或层析纸。而且，聚砜不对称膜提供了合适的显示条。其他合适的材料包括

膜，例如

1660和MN-260。测流条的毛细管床在下面描述的侧流条盒或壳体的结果观察窗下方对齐。有关材料的进一步详细信息，请参阅实施例(例如，实施例2、3和9)。如果存在蛋白结合的检测试剂，则窗口内可见检测试剂。(参见图1)。

吸芯

任选地，所述装置包含吸芯。吸芯可位于本发明的条或装置中的第三区带或显示条之后。当使用时，施加到装置上的生物样品(例如流体)继续从显示条移动到最终的多孔吸收材料“吸芯”中，“吸芯”充当样品收集器，并且还可以起到沿着条拉动样品的作用。吸收垫可以用作例如装置条末端的吸芯，以将样品拉动通过侧流条，并且可以增加分析样品的量并提高分析灵敏度。这些吸收垫通常是纤维素或棉短绒的，并基于床体积的厚度、可压缩性和均匀性进行最佳选择。

背衬卡

所述装置可以具有背衬卡。整个条可以组装在背衬卡(例如，可获自Lohmann，Orange，VA的那些)上，其通常是塑料背衬和粘附卡。

壳体/盒

在本发明的一个实施方案中，诊断装置被容纳、包裹或封装在壳体或盒中。所述装置可以还包括壳体或盒，包括但不限于为此目的配置的管壳(cartridge)、塑料装置或挤出塑料件，其包住该装置。几种通用的盒式壳体可以商购获得(例如，从Kanani Biologicals,Gujarat,India或者EASE-Medtrend Biotech LTD,Shanghai,China)，或者可以为了即将到来的目的而定制生产。(参见例如美国外观设计专利申请序列号29/533,647)。所述装置可以被配置在具有用于接收样品的样品孔的壳体或盒中，其中当它被组装/容纳在盒内时，样品孔位于条的样品接收材料上方。此外，所述装置可以被如此配置以使得当组装在壳体或盒中时，条的显示条或毛细管床位于壳体的结果观察窗下方。

在一个实施方案中，本发明的装置还包括能够量化结果，例如检测试剂(例如染料)在毛细管床上(即，在结果窗口中)的强度的电子阅读器，并且还可以包括显示屏幕(例如，LED屏幕)以显示结果。该阅读器可以是壳体的一部分，或是与壳体整体组装在一起的元件，例如在结果显示窗口中的元件。这样的阅读器描述于例如Venkatraman,Biosensors and Bioelectronics Volume 74,15December 2015,Pages 150–155,PCT ApplicationNo.WO2013083686A1,PCT Application No.WO2004010143 A2,and PCT ApplicationNo.WO2006010072 A2中。

覆盖胶带

有或没有壳体的装置可以还包括覆盖物，诸如保护性胶带(例如，可获自Lohmann，Orange，VA)或能够保护装置免受损坏并提供适当的测试结果读出的其他材料。例如，所述装置可以被配置成用作浸量尺，例如尿液浸量尺。在该实施方案中，侧流条可以用保护性胶带覆盖。(参见图5和实例11)

运行对照试剂

在一个优选的实施方案中，在使用所述装置之前，对照试剂可以存在于毛细管床上，在观察窗口中看得见。(参见图1和图2，实施例12)。当生物样品(例如流体)流动穿过毛细管床时，对照试剂溶解，对照试剂线散开和/或对照被带走，沿显示条向上以使得在结果窗口中看不见对照试剂，或者其是模糊的，或者可以看到或测量一些其他的差异。观察窗口中的对照试剂的变化表明加入了测试样品(例如流体)并且已经适当地穿过所述装置，例如用作运行对照。(参见实施例12)。对照试剂是视觉上可检测的，例如通过裸眼或例如通过机械检查和/或电子阅读器检测或测量。在一个实施方案中，对照试剂是酒石黄。可用作运行对照试剂的其它染料包括：FD&C蓝色1号—亮蓝FCF，E133(蓝色)，FD&C蓝色2号—靛蓝，E132(靛蓝)，FD&C绿色3号—快速绿色FCF，E143(绿松石色)，FD&C红色3号—赤藓红，E127(粉红色)，FD&C红色40号—诱惑红AC，E129(红色)，FD&C黄色5号—酒石黄，E102(黄色)，FD&C黄6号—日落黄FCF，E110(橙色)。

检测的目标蛋白

如上所述，本发明涉及一种装置和利用所述装置检测目标蛋白，更具体地，检测错折叠的蛋白、聚集的蛋白和/或超分子蛋白聚集体的方法。已知α螺旋是天然构象的功能性蛋白的主要结构基序。相反，蛋白的构象变化可导致β片层结构基序(即β片层结构)或错误折叠的蛋白，其然后倾向于引起蛋白聚集和毒性。因此，错误折叠的蛋白可以是蛋白聚集体或超分子聚集体的形式，并且可能与错误折叠的蛋白病症如先兆子痫、阿尔茨海默氏病、朊病毒病和帕金森病有关。

具体地，与通过本发明装置和方法检测的先兆子痫相关的这些错误折叠的蛋白、蛋白聚集体和/或超分子聚集体可以包括但不限于例如α-1抗胰蛋白酶(SerpinA1)，血浆铜蓝蛋白，重链IgG，轻链IgG，干扰素诱导蛋白6-16(IF16-6，G1P3)，白蛋白以及每种蛋白的片段、其混合物以及这些混合物的片段。这些蛋白与本发明的装置中使用的检测试剂(将在下面描述)具有结合亲和力。例如，这些错误折叠的蛋白是嗜刚果红的，对称为刚果红的染料具有亲和性。

本发明的装置也可用于检测除先兆子痫以外的蛋白错折叠病症。例如，所述装置可用于检测以下错误折叠的蛋白病症或病况中的错误折叠的蛋白，如阿尔茨海默氏病，脑β-淀粉样血管病，青光眼中的视网膜神经节细胞变性，朊病毒病，帕金森病和其他共核蛋白病(synucleinopathy)，Tau蛋白病，额颞叶变性(FTLD)，FLTD-FUS，肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，亨廷顿病和其他三联症，重复障碍，痴呆(英国和丹麦家族性)，遗传性脑出血伴淀粉样变，CADASIL，亚历山大病(Alexander disease)，各种淀粉样变性，Serinopathies，II型糖尿液病，包涵体肌炎/肌病，白内障，视网膜色素变性伴视紫红质突变，甲状腺髓样癌，垂体催乳素瘤，遗传性晶状体角膜营养不良，马洛里氏小体(Mallory body)，肺泡蛋白沉积症，牙源性肿瘤淀粉样蛋白变性，囊性纤维化，镰状细胞病和危重病肌病。

生物样品

待检测的一种或多种目标蛋白可以在来自哺乳动物的生物样品中。例如，生物样品可以是可能包含一种或多种目标蛋白的洁净尿液或天然捕获获得的尿液、脑脊髓液、羊水或任意体液样本(例如血液、唾液、羊水、脑脊髓液、血浆或血清)。样品也可以是来自患者的排泄物的提取物，例如来自鼻腔分泌物、粪便物质或耳垢，或者用合适的溶液提取并施加到装置上的组织样本。例如，目标蛋白可以在来自妊娠的或产后哺乳动物的生物样品中。

患者

患者可以是哺乳动物。此外，所述哺乳动物可以是妊娠的，例如孕妇，妊娠的灵长类动物或基因工程化的动物模型，其被设计为具有先兆子痫的身体症状和体征，例如用于实验室研究的那些(例如高血压和尿液蛋白)。优选地，对于先兆子痫的诊断，患者可以是任意孕妇。孕妇可能怀疑患有先兆子痫或处于患先兆子痫的风险。例如，怀疑可以基于以下：1)展现出先兆子痫的体征和症状，例如，如美国妇产科医师协会指南(ACOG)(Hypertensionin Pregnancy,Report of the American College of Obstetricians andGynecologists’Task Force on Hypertension in Pregnancy,Obstetrics andGynecology 122VOL.122,NO.5，2013年11月)特别是，例如表E-1(“ACOG 2013指南”)中公布的，和/或2)具有一种或多种先兆子痫风险因素(例如先前妊娠涉及先兆子痫的女性、有多个胎儿的女性、患有心血管或肾脏异常的女性或患有自身免疫疾病如狼疮的女性)。

试剂盒

本发明还包括用于检测样品中目标蛋白的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含这样的装置，所述装置用于检测来自妊娠的哺乳动物的样品中存在的与先兆子痫相关的错误折叠蛋白。试剂盒包含如上所述的本发明装置的任意如上所述的替代实施方案。试剂盒还可以包括用于将患者样品施加至样品接收材料的装置，例如吸液管(例如可获自Genesee Scientific,San Diego,CA的精细尖端移液管)或滴管、对照物以及装置的使用说明。因此，该装置不仅可以作为独立的实体使用，还可以以试剂盒的形式使用，这在某些临床或非临床环境中更有利。试剂盒可以包装在箔或聚酯薄膜袋中。试剂盒袋还可以单独包装，也可以多个包装，例如每包装有2、5、10、15、25、50或100个试剂盒。

装置的使用环境和使用装置的方法

例如，本发明的装置可以由医务人员、非专业医疗人士或甚至由患者自己(当患者为人类时)在临床实验室(在医院内或在医院外环境)、即时护理环境、医师办公室实验室、急诊室(例如在医院内)使用，或用作患者旁测试(near-patient testing)装置或即时护理(point-of-care)装置。此外，所述装置可以与其他诊断测定法(例如免疫测定法，例如检测与先兆子痫相关的其他蛋白(即生物标志物)的那些免疫测定法，与先兆子痫相关的其他蛋白例如sFlt-1、PlGF、PP-A、PP13、正五聚体蛋白、抑制素-A和可溶内皮因子(solubleendoglin))和/或在诊断先兆子痫中常用的其它方法或观察法(例如，血压读数、在诊断先兆子痫中使用的临床测试包括血小板计数、血清肌酸酐浓度、血清ALT(丙氨酸氨基转移酶)和AST(天门冬氨酸氨基转移酶)，以及其它体征或症状例如体重增加、头晕、头痛、视力模糊等。

例如，本发明包括在患有妊娠高血压病症的患者或可能疑似患有先兆子痫的患者中诊断先兆子痫或进行区分性诊断的方法，其包括以下步骤：a)确定妊娠患者的血压，其中妊娠患者的血压大于140/90mm/Hg可指示妊娠患者中的先兆子痫，和b)将来自患者的生物样品施加到本发明的装置，由此对患者生物样品中至少一种目标蛋白的检测提供了或支持了患者先兆子痫的诊断或充当区分性诊断。

此外，本发明还包括治疗疑似患有先兆子痫的妊娠的哺乳动物的方法，其包括以下步骤：a)将来自哺乳动物的生物样品施加到本发明的装置，从而确定指示妊娠的哺乳动物患有先兆子痫的至少一种蛋白的存在；和b)使妊娠的哺乳动物分娩以治疗先兆子痫。此外，装置也可以在分娩后使用以确定患者是否在生物样品中表达一种或多种错误折叠的蛋白。如果存在一种或多种错误折叠的蛋白，则可能需要进一步的患者管理或治疗干预(例如施用硫酸镁或其他抗高血压剂)来治疗先兆子痫，或者可使用本发明的装置监测患者来指示蛋白在生物样品中何时不再可检测到。另外，本发明的装置可以在治疗干预后使用以确定治疗是否成功或者测量生物样品中的目标蛋白的量或存在的变化(例如减少、不存在或增加)。因此，本发明的装置可以用于患者的前治疗和后治疗以确定是否有必要进一步的治疗性干预、确定治疗性干预是否有效和/或是否给予治疗性干预的替代形式或给予增加剂量的治疗剂以解决先兆子痫或其他蛋白错误折叠病症。

装置和使用该装置的方法的优点

至少由于以下原因，本发明的装置相对于现有装置是有利的：1)所述装置提供了具有较少步骤的简化测试程序；2)所述装置提供了标准化测试材料的使用以实现最佳制造；3)所述装置提供了测试试剂盒中检测试剂的改善的稳定性以提供更长的保质期；4)结果更简单，更容易阅读，同时5)保持了相对较低的成本；以及6)提供了快速结果，适于即时使用或在临床实验室环境中使用。

具体地，所提供的装置和方法远远优于已知的用于检测可能的先兆子痫的纸质试剂盒(参见例如美国专利申请公开号20150293115)，因为对于用户而言，所提供的装置需要较少的步骤，结果更易于阅读并且比纸质试剂盒更稳定，导致至少6个月，优选1年，甚至更优选2年，甚至更优选3年，甚至更优选4年，甚至更优选5年的长保质期。本发明的装置还提供了快速结果(即，从将生物样品(例如尿液)施加到装置的3分钟内，优选在2分钟内，更优选在1分钟内或更短的时间内)，适于具有极少训练的即时使用者。

本发明可以通过使用以下非限制性实施例来说明：

实施例

实施例1

样品装置

图1示出了盒或壳体中的本发明的装置测试条的照片。图1的左图显示了与生物样品接触之前壳体中的装置。右图显示了测试已知与先兆子痫相关的错误折叠蛋白为阴性、弱阳性和阳性的尿液样品的装置结果。

图2示出了本发明装置的测试条实施方案的实例。所述条包括对照染料、显示条、捕获器(例如，三片材料)、第二样品垫、第一样品垫和干燥在样品垫上的染料。

图3A示出了本发明的诊断装置的一个实施方案。图3A示出了顶视图。图B示出了与图3A相同的实施方案，但为侧视图。所述样本垫、捕获器和显示条可以对接在一起。图3C示出了样品垫、捕获器和显示条彼此重叠的实施方案(侧视图)。

图4显示了测试条内的不同材料配置。图4A示出了本发明的一个替代实施方案，其具有依次排列的两个样品垫、捕获器和显示条(毛细管床)。每个部件与相邻部件交叠。图4B示出了本发明的另一个替代实施方案，其具有依次交叠的两个样品垫、三层捕获器和显示条，每个部件与相邻部件交叠。

图5显示了本发明的测试条的浸量尺配置的实例。该实施方案在测试条的顶部配置有盖带。在测试条的顶部，胶带的颜色是不透明的，可以用来固定所述条。在中间，胶带是透明的从而为结果提供观察窗口。可以如此放置胶带以使得透明窗口例如在捕获器上方大约10mm处。窗口处的胶带可以被颜色(例如白色)包围，这使得能够容易地观察结果。在捕获器下方，胶带的颜色是不透明的以覆盖捕获器。在条的底部，胶带可以显示指示条的哪一端浸入测试样品中的箭头，并且可以显示指示将测试条浸入样品的最大水平的线。测试条的底端可以不具有覆盖胶带，以便于在浸入时芯吸测试样品。

实施例2

材料测试

测试了各种纸样材料区分具有和不具有先兆子痫的孕妇的尿液样品的能力。将刚果红(CR)染料(Sigma，St.Louis，MO)加入到尿液样品中，并向材料中加入液滴以评估适合于样品接收、捕获和显示条的特性。约3分钟后观察所得斑点，并评估先兆子痫患者和正常对照妊娠的尿液之间的视觉差异(表1)。“优异(excellent)”的结果表明该材料适合于提供来自先兆子痫患者的CR-尿液与来自对照妊娠患者的CR-尿液之间的视觉上可观察到的差异，使得该材料可用于诊断测试装置。“差(poor)”的结果表明材料不适合提供CR-先兆子痫阳性和CR-对照尿液之间的视觉上可观察到的差异。从级别上讲，“差”的结果为最不合适的材料，“稍好(subtle)”为稍好但不理想，“可以(okay)”再好一些，“好(good)”更胜一筹，“更好(better)”更有改善，“优异”为最合适的材料。聚砜不对称材料确定提供了最好的结果。某些棉材料如CF3和CF4效果好，而其他棉如Ahlstrom 270则效果不好。对于此目的，硝化纤维素和玻璃纤维材料通常效果不好。

表1

实施例3

测试条

因为BTS和Vivid已经在提供来自先兆子痫患者的CR-尿液与来自对照妊娠患者的CR-尿液之间的视觉上可观察的差异方面显示出优异的结果，因此使用

8950(棉/玻璃纤维组分)(“8950”)样品垫和BTS或Vivid^TM运行条(run strip)或毛细血管床组装测试条。将刚果红加入到尿液样品中，涡旋样品，然后将样品施加到测试条的8950末端。在BTS或Vivid^TM膜运行条上观察结果。将患有先兆子痫的女性的尿液施加到含有Vivid^TM膜的条上，产生非常清楚的信号(粉红色/红色刚果红染色)，阴性尿液显示无信号。信号与体积有关，体积减小导致信号下降。BTS条在阳性和阴性尿液之间没有显示出差异，在更高的样品体积下两者均导致阳性染色。随着施加样品体积的减少，阳性和阴性尿液的信号同样降低。

表2

这些结果表明，Vivid^TM材料适用于本发明的诊断测试装置，而BTS则表现不好。

实施例4

捕获材料评价

Vivid^TM和BTS膜作为捕获器材料被评估，所述捕获器位于样品垫和运行条(即毛细管床或显示条)之间，以确定当施加阴性尿液(即，来自未患先兆子痫的女性的不含目标蛋白的尿液)时它们是否帮助保留CR染料，允许具有先兆子痫阳性尿液的CR流过到达显示条。将测试条组装成包括8950作为样品垫，Vivid^TM膜或BTS膜，随后是

1660运行条。将添加了CR的尿液施加到8950，在

1660运行条上观察结果。

当施加阳性尿液(即，来自患有先兆子痫的女性的含有目标蛋白的尿液)-刚果红染料时，在全部条上观察到CR染色。而当施加阴性尿液-刚果红时，使用Vivid^TM薄膜捕获器制成的条为阴性，用BST膜捕获器制成的条显示出一些染料染色。当测试阴性尿液时，Vivid^TM材料是保留CR染料的有效捕获器，而当测试阳性尿液时，使CR染料流过。BTS是一个不太有效的捕获器。

实施例5

用于测试条中预加载的检测试剂的材料的评估

将刚果红染料施加到样品垫材料上并使其干燥。施加阳性尿液，并观察染料从样品垫释放的结果。

表3

理想情况下，检测试剂(即在这种情况下为染料)在施加生物样品(即，尿液)时从样品垫材料释放。包括

4894和

X-4897在内的多种材料提供了良好的染料释放，因此非常适用于诊断测试装置。此外，几种材料也提供了染料释放并且是合适的，例如Fusion材料(玻璃微纤维)和

33。

实施例6

具有染料掺入到测试条中的样品垫的评估

将包括注入了刚果红染料的

X4897和

4894的样品垫材料与Vivid^TM x捕获器和MN-260运行或显示条合并到测试条中。将尿液加入到每个条的样品垫中，并在MN-260显示条上观察结果。

结果：当加入尿液时，样品垫材料释放染料。加入先兆子痫阳性尿液导致MN260材料的阳性染色。在大多数情况下，加入先兆子痫阴性尿液不导致MN260染色；然而，在某些情况下，在MN260条的开始处有一些染色。这些结果表明，

Vivid^TM、MN260材料的配置可以提供区分先兆子痫阳性与先兆子痫阴性尿液的手段，提供一种有用的诊断测试装置。

实施例7

侧流测定盒中的测试条评估

条由注入了染料的POR-4899样品垫、接着是Vivid X膜然后是MN260显示条组装而成，其中所述POR-4899样品垫置于Fusion 5的顶部，所述Vivid X膜用作捕获器。将条放置在通用盒中，使样品垫直接位于盒的样品端口的下方，并且在盒结果窗口中可见MN260。[75μl]在样品端口加入75微升尿液，并在结果窗口观察结果。当添加阳性尿液时，在结果窗口中可见红色染色，而当加入阴性尿液时，不能观察到染色。这种配置提供了区分先兆子痫阳性和先兆子痫阴性尿液的有效诊断装置。

实施例8：

改进捕获器

有时，在条上测试的阴性尿液导致在结果条(result strip)上出现一些染料条纹(streaking)，特别是随着时间的推移。进行了额外捕获器配置的评估，来看是否能够更好地区分阳性和阴性样品，以及是否可以消除使用阴性尿液时的这种条纹。条用注入了染料的POR-4899样品垫、两个偏置但交叠的Vivid^TM X层的捕获器和MN260结果条组装而成，所述POR-4899样品垫置于Fusion 5的顶部。当通过施加阴性尿液进行测试时，双层捕获器防止了染料泄漏和条纹，由此提供了用于区分先兆子痫阳性和先兆子痫阴性尿液的改进的诊断测试装置。

实施例9

装置条配置

使用动态分配机以6μl/cm分配刚果红染料溶液来条带化(strip)POR-4899。POR-4588以4μl/cm条带化。将垫在37℃下干燥1小时并储存在干燥剂箱中。使用条带化的POR材料、一层Vivid^TM X捕获器和MN260来组装测试条。测试尿液时，POR-4899条表现好；然而，当测试阴性尿液时，含有POR-4588的条则导致染料泄漏到显示条上。当以4μl/cm条带化时，对POR-4588进行了进一步地评估，其导致清晰的尿液阴性运行。然后，当以6或8μl/cm条带化、用双Vivid^TM捕获器组装时，对POR-4588进行了评估。当测试阳性尿液时，这个具有6μl/cm染料条的条组件给出了最好的结果，当测试阴性尿液时，只有最少量的染料渗漏或条纹。此外，具有3层Vivid^TM捕获器和以8μl/cm条带化的POR-4588的条的评估给出了良好的结果和更强的阳性信号。

表4

染料垫	刚果红分配速率	捕获器	阳性/阴性区分
				POR-4899	6μl/cm	单层Vivid<sup>TM</sup>捕获器	√
POR-4588	4μl/cm	单层Vivid<sup>TM</sup>捕获器	假阳性
				POR-4588	6μl/cm	双层Vivid<sup>TM</sup>捕获器	√
POR-4588	8μl/cm	双层Vivid<sup>TM</sup>捕获器	√

当测试先兆子痫阴性尿液时，配置有以8μl/cm施加的刚果红的POR-4599和双vivid捕获器的装置产生清晰的阴性结果，当测试先兆子痫阳性尿液时，产生强烈的阳性结果，因此是首选的诊断测试装置配置。

实施例10

浸量尺形式测试设计的评估

使用以6、8或10μl/cm条带化的POR-4588、3层Vivid^TM捕获器和MN260来组装测试条。将条浸入60μl尿液中。尿液成功地吸上条，并且8μl/cm条带化的版本提供了最佳阳性测试结果与清晰的阴性测试结果。因此，可以以这种方式配置诊断测试装置的合适的浸量尺形式，并且其对于诊断目的的区分先兆子痫阳性尿液与先兆子痫阴性尿液是有用的。

实施例11

进一步评估诊断测试装置配置

由两个

样品垫(一个用染料条带化)、3层Vivid^TM捕获器和MN260制成的测试条在盒/壳体中进行测试，并用作测试尿液的浸量尺。也许是因为样品到样品垫上的中心斑点上的受控的流动，良好的染料吸收，沿条的中心向上流动，和运行条结果的更均匀染色，盒式壳体改善了结果。五个阴性尿液均检测为阴性；5个阳性尿液产生2个弱阳性、3个阳性结果。作为浸量尺，将测试条放入试管中的100μl尿液中。在3分钟时，所有阳性和阴性尿液的结果都是阴性的。然而，给予更多的时间，5分钟时，阳性尿液结果是2个弱阳性、3个阳性，而阴性尿液仍是阴性。因此，这些测试配置是合适的先兆子痫诊断测试装置。

实施例12

运行对照的评估

该实验的目的是研究指示样品何时成功沿条向上运行的对照，“运行对照”。当测试阴性生物样品并在显示条或结果条上未观察到染色时，很难判断其是否为阴性结果，或者测试是否未能正确运行(即，发生了实际上没有添加样品、样品添加不足或样品沿条向上芯吸不足)。在整个运行条材料上喷涂水溶性着色剂条纹，如此放置以使得当组装在壳体中时，其能够在盒结果窗口的顶部可见。通过样品端口将尿液样品施加到样品垫上，并通过结果窗观察流动。当样品到达对照染料条纹时，条纹溶解并与样品一起运行。运行对照条纹的消失提供了一个容易观看的指征，即样品已成功运行穿过该条。对照不影响尿液测试的阅读结果。对照条染料的一个实例是酒石黄。可用作运行对照的其他染料包括：FD&C蓝色1号—亮蓝FCF，E133(蓝色)，FD&C蓝色2号—靛蓝，E132(靛蓝)，FD&C绿色3号—快速绿色FCF，E143(绿松石色)，FD&C红色3号—赤藓红，E127(粉红色)，FD&C红色40号—诱惑红AC，E129(红色)，FD&C黄色5号—酒石黄，E102(黄色)，FD&C黄6号—日落黄FCF，E110(橙色)。

实施例13

捕获器替代材料的研究

用2个

样品垫(第一个用刚果红(CR)染料条纹化)、表5中列出的多种替代捕获材料和MN260运行条来组装测试条。在组装的测试条上测试了阴性尿液样本，并且评估了每个捕获器的以下能力：1)当样品中不存在目标蛋白时，保留CR染料的能力，和2)不保留蛋白结合的CR的能力。

表5

结果：大多数这些捕获器材料显示有区分嗜刚果红蛋白阳性生物样品(嗜刚果红阳性尿液)与嗜刚果红蛋白阴性生物样品(嗜刚果红阴性尿液)的潜力。

为了进一步提高在测试阴性样品时检测试剂(CR)的保留，然后使用三层表6中所述的选择性捕获材料来制备测试条。

表6

捕获器材料	测试阴性样品的结果	测试阳性样品的结果
			EMI 11513	阴性	弱阳性
642	阴性	阳性
			C048	阴性	弱阳性
CF1	阴性，轻微溢出	阳性

结果：三层捕获器有效地保留未结合的CR检测试剂以防进入显示条。然而，在测试阳性样品时，用EMI 11513和C048制作的三层捕获器配置也降低了信号结果强度。在这些测试的捕获器中，用642制作的三层捕获器为阳性和阴性样品均提供了最佳结果。

实施例14

捕获器材料的进一步研究

为了进一步研究用作本发明诊断测试装置的捕获器的合适材料，用2个

样品垫(第一个用CR染料(8μl/cm)条带化)、表7中描述的捕获器和MN260运行条组装了条。每个配置的条都用嗜刚果红阴性尿液样品，两个弱阳性嗜刚果红蛋白样品和两个强阳性嗜刚果红蛋白样品进行了测试。

表7单层捕获器材料的研究

出乎意料地，5493结果比5475更不强烈，5493的吸收性比5475多约4倍和毛细上升速度比5475快2倍。这些结果表明，较少的吸收和较慢的毛细管上升对于稳健的信号是优选的。类似地，CF3比CF1弱，具有两倍的吸收。材料238的信号比237弱，具有两倍的芯吸率，319显示出最强的纸质线(paper line)着色结果，芯吸速度最慢。MN640是一种运行较快的材料，其信号比MN615弱。

结果显示，对于更强健的信号而言，具有较低吸收性、较慢毛细管上升或芯吸率的材料可能是优选的材料。

实施例15

诊断测试装置的评估

组装完整的测试条，其包含注入了染料的

样品垫、Vivid^TM膜条捕获器和MN260毛细管床膜，所述

样品垫置于Fusion 5(由GE制造的专有单层基质膜)的顶部。将条放在一个普通的LFA盒内。将尿液样品加入到圆形样品孔中，并在3分钟时在矩形窗口中观察结果。

结果：阴性尿液的窗口中未观察到染料，弱阳性尿液观察到淡粉色，并且强阳性尿液样品观察到强粉色。这些结果表明，对于检测样品中的嗜刚果红蛋白来诊断先兆子痫的诊断测试装置而言，这是合适的配置。

实施例16

最佳捕获材料的进一步评估

组装完整的测试条，其包含注入了染料的

样品垫；第二

垫(无染料)；11513、5475、319、247或CF1的单层或双层捕获器；带有Whatman 470吸芯的MN260膜毛细管床。MN260含有酒石黄染料的运行对照条纹。将测试条置于LFA样盒中，所述LFA样盒最适于将测试样品添加到注入了染料的

垫上，并且观察窗口位于MN260膜中心上方，以使得在运行测试之前能够观察到酒石黄染料，而在测试运行之后不能观察到。将尿液样品加入到圆形样品孔中，并在3分钟时在矩形窗口中观察结果。

结果

在3分钟时，在阴性尿液的窗口中未观察到染料，在弱阳性尿液中观察到浅粉色，并且在强阳性尿液样品中观察到强粉红/红色。此外，在添加样品前黄色酒石黄染料条纹是明显的，可以观察到与样品的芯吸一起行进，在3分钟时几乎不可见或完全消失。这些结果表明，对于检测样品中的嗜刚果红蛋白来诊断先兆子痫的诊断测试装置而言，这是合适的配置。

实施例17

本装置的结果对比CRD测试结果

通过测试105份临床尿液样本，来对本发明的测试装置进行评估，其中所述105份临床尿液样本来自疑似先兆子痫女性的刚果红点(CRD)测试研究(Rood等人，2016AJOG,214(1)s24-s25)。选择样品以提供27个强阳性、28个阴性和50个弱阳性样品。通过％CRR确定样品的阴性/阳性状态(Irina A.Buhimschi等人，Sci.Transl.Med.6,245ra92(2014))。将样品加入到测试装置中，并在3分钟时对结果进行视觉评分，阴性(-或0)、弱阳性(+或1)或强阳性(++或2)。

结果显示，在103/105个样品(98％)中的测试装置结果与CRD结果一致。与先兆子痫的判定性诊断(基于ACOG指南：Hypertension in Pregnancy Report of the AmericanCollege of Obstetricians and Gynecologists’Task Force on Hypertension inPregnancy,2013 Obstetrics&Gynecology 122(5):1122-1131)相比较，本发明装置的测试结果表现出91％的灵敏度；64％的特异性，82％的准确性，83％的阳性预测值，79％的阴性预测值。

在将测试样品加入到测试的样品孔中时，沿条向上行进的液体的前端在30秒内可见。在大约1分钟时，前端碰到黄色染料对照条纹，并在大约1.5分钟时行进至窗口的末端。在30秒或更多时间，随着液体的前端行进进入结果窗口，强阳性结果清晰可见。在1.5min时，全部结果窗口被着色。弱阳性结果比强阳性结果花费更长的时间来决定，因为在加入样品后约1-3分钟时，液体前端通常呈现阴性，在结果窗口中显色。图1显示了结果的实例。

实施例18

使用尿液样品对照来评估装置

组装装置测试条，其包含注入了染料(120μg/装置)的

4588样品垫；第二

垫(无染料)；双层Ahlstrom 319的捕获器；带有Whatman 470吸芯的MN260膜毛细管床。MN260含有酒石黄染料的运行对照条。将测试条置于LFA样盒中，所述LFA样盒最适于将测试样品添加到注入了染料的

垫上，并且观察窗口位于MN260膜中心上方，以使得在运行测试之前能够观察到酒石黄染料，而在测试运行之后不能观察到。

将来自五(5)位确诊先兆子痫患者的尿液样本汇集在一起以形成阳性测定对照。刚果红斑点杂交试验证实了嗜刚果蛋白的存在(Buhimschi 2014)。磷酸盐缓冲盐水(10mM磷酸盐，pH 7.4，150mM NaCl)用作阴性对照，并用于制备阳性测定对照的稀释系列。制备以下稀释液(按样品与缓冲液总体积的比例)：未稀释、1：4、1：8、1：15、1：40。稀释系列的每个尿液样本均在装置上一式两份地进行测试。

结果：特定稀释度的每个尿液样品的每个重复在装置上表现出相同的染色密度。测试结果如下表所示。

表8：汇集尿液样本的稀释系列的测试结果

稀释液	测试结果
		未稀释	+++
1:4	++
		1:8	+
1:10	+
		1:15	+
1:40	-

这些数据证明，诊断装置可以检测到嗜刚果红蛋白，并且效果是可滴定的。这些数据还表明，所述装置对应于嗜刚果红蛋白浓度的增加呈现出渐进的红色视觉量表。

Claims

1.一种用于检测哺乳动物的生物样品中的至少一种蛋白的诊断装置，其包括：

a)样品接收材料，其中所述样品接收材料能够接收生物样品；

b)检测试剂，其中所述检测试剂存在于所述样品接收材料上或内，并与所述生物样品中存在的至少一种蛋白结合，其中所述检测试剂选自由偶氮染料、硫代黄素T和偶氮染料的类似物组成的组；

c)捕获器，其中所述捕获器与样品接收材料接触，并且(i)将与所述生物样品中的所述至少一种蛋白结合的检测试剂与未结合的检测试剂分离，(ii)允许与所述生物样品中的所述至少一种蛋白结合的检测试剂能够流过所述捕获器，以及(iii)保持未结合的检测试剂，阻碍未结合的检测试剂的流动，或结合未结合的检测试剂，其中所述捕获器是选自以下的材料：硝化纤维素、纤维素、玻璃纤维、棉纤维、织造网、非织造材料、不对称聚砜膜、聚偏二氟乙烯和聚醚砜；

d)毛细管床，其中所述毛细管床与所述捕获器接触，并且所述毛细管床被配置为在所述生物样品流过所述捕获器之后含有所述生物样品，

其中，所述样品接收材料、所述捕获器和所述毛细管床被配置为依次接触，并且

其中，如果所述生物样品中存在所述至少一种蛋白，则所述毛细管床显示检测试剂。

2.权利要求1所述的诊断装置，其中所述样品接收材料包括所述检测试剂。

3.权利要求1所述的诊断装置，其中所述检测试剂是干燥的形式。

4.权利要求1所述的诊断装置，其中在所述生物样品施加到所述样品接收材料后，所述样品接收材料释放所述检测试剂到所述生物样品中。

5.权利要求4所述的诊断装置，其中所述样品接收材料是用于混合所述检测试剂与所述生物样品的基质。

6.权利要求5所述的诊断装置，其中在混合检测试剂和生物样品后，所述样品接收垫释放混合的检测试剂和生物样品到邻近所述样品接收垫的所述捕获器。

7.一种包装权利要求1所述的诊断装置的壳体或盒。

8.权利要求1所述的诊断装置，其中所述检测试剂与至少一种蛋白结合，所述至少一种蛋白选自由错误折叠的蛋白、蛋白聚集体、超分子蛋白聚集体、错误折叠的蛋白片段、蛋白聚集体片段、超分子蛋白聚集体片段以及其混合物组成的组。

9.权利要求8所述的诊断装置，其中所述错误折叠的蛋白选自由α-1抗胰蛋白酶(SerpinA1)、血浆铜蓝蛋白、重链IgG、轻链IgG、干扰素诱导蛋白6-16(IF16-6，G1P3)、白蛋白及其片段组成的组。

10.权利要求1所述的诊断装置，其中所述至少一种蛋白是嗜刚果红的。

11.权利要求1所述的诊断装置，其中所述偶氮染料是刚果红。

12.权利要求11所述的诊断装置，其中所述刚果红预加载到所述样品接收材料上。

13.权利要求1所述的诊断装置，其中所述样品接收材料包括选自由硝化纤维素、纤维素、玻璃纤维、棉、织造网、非织造材料、多孔塑料、聚合物和聚酯组成的组的材料。

14.权利要求13所述的诊断装置，其中所述聚酯是聚乙烯。

15.一种包括权利要求1所述的装置的试剂盒。

16.权利要求15所述的试剂盒，其还包括校准剂或对照试剂。