CN108290844B - 一种取代的萘环化合物及药物组合物及其应用 - Google Patents

一种取代的萘环化合物及药物组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

提供了一种取代的萘环化合物及药物组合物及其应用，所述萘环化合物为如式（I）所示的化合物，或其多晶型、药学上可接受的盐、前药、立体异构体、同位素变体、水合物或溶剂合物。所述萘环化合物可作为丙型肝炎病毒抑制剂，具有更好的丙肝病毒蛋白NS5B抑制活性，及更好的药效学/药代动力学性能，因此更适合于制备治疗丙型肝炎病毒感染的药物。

Description

一种取代的萘环化合物及药物组合物及其应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种丙型肝炎病毒抑制剂、药物组合物及其应用。
背景技术
HCV(Hepatitis C Virus，丙型肝炎病毒)是一种RNA病毒，其属于黄病毒科(Flaviviridae family)中的丙型肝炎病毒属(Hepacivirus genus)。包裹HCV病毒粒子包含正股RNA基因组，其在单个不间断的开放读码框中编码全部已知的病毒-特异的蛋白质。开放读码框包括大约9500个核苷酸并且编码单个约3000个氨基酸的巨大多蛋白。多蛋白包括芯蛋白，包裹蛋白E1和E2，膜结合蛋白P7，和非结构性蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。
近年来，丙肝的发病人数呈逐年上升趋势，2006年-2010年分别为70681例、92378例、108446例、131849例和163174例。
2011年以前，HCV的治疗药物为干扰素和利巴韦林。这两种药物，通过调节免疫系统或开启细胞内的各种抗病毒基因，建立了一个不利于病毒复制的环境，实际上是针对宿主细胞。由于药物作用于体内的每一个细胞，因此这些药物有许多副作用。新的直接作用抗病毒药物可直接靶向病毒，这一点有很大的优势。在直接作用的抗病毒药物中，蛋白酶抑制剂，NS5A抑制剂和NS5B聚合酶抑制剂是正在研究的抗HCV三大类药物。2014年获美国FDA批准的HCV药物有两个，分别是吉利德的Harvoni和艾伯维的Viekira Pak，均为复方制剂。
其中，艾伯维的Viekira Pak主要由ombitasvir，paritaprevir和dasabuvir组成，可以用于治疗慢性基因1型(GT1)丙型肝炎病毒感染患者，也可用于HCV/HIV-1合并感染(丙肝病毒合并人类免疫缺陷病毒1型)患者和肝移植患者。Dasabuvir是该复方制剂中不可缺少的NS5B聚合酶抑制剂。
此外，索非布韦是目前世界上第一个在短期内可以彻底治愈丙肝的良药。它以口服途径直达病灶，方法简单副作用很小，深受患者的追捧。索非布韦由美国吉利德公司生产，2013年在美国上市，经临床试验证实可有效治疗基因1、2、3、4型丙肝，包括对肝移植、肝癌以及HCV/HIV-1合并感染的临床试验。这一突破为全世界的丙肝患者带来了福音。美国吉利德公司去年已经将丙肝新药索非布韦的授权扩大至埃及，埃及是全球丙肝发病率最高的国家。随后同意印度生产索菲布韦仿制药。截至目前，共有8家印度制药公司拿到了吉利德的授权，可以将索菲布韦销往全球91个发展中国家(中国被排除在外)。索非布韦目前在我国处于空白，一边是大量的需求，一边是无药上市，面对如此尴尬的窘境，一些大医院正在尝试通过视频远程海外医疗解决这一难题。一些等不及的患者，不得不考虑出国看病。
因此，本领域仍需要开发对丙型肝炎病毒蛋白NS5B有抑制活性或更好药效学性能的化合物。
发明内容
针对以上技术问题，本发明公开了一种取代的萘环化合物及其药物组合物作为丙型肝炎病毒抑制剂，其具有更好的丙肝病毒蛋白NS5B抑制活性和/或具有更好药效学/药代动力学性能。
对此，本发明采用的技术方案为：
一种丙型肝炎病毒抑制剂，如式(I)所示的萘环化合物化合物，或其多晶型、药学上可接受的盐、前药、立体异构体、同位素变体、水合物或溶剂化合物，
Figure GPA0000253282230000031
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23、R24、R25各自独立地为氢、氘、卤素或三氟甲基；
附加条件是R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23、R24和R25中至少一个是氘代的或氘。
采用此技术方案，氘在药物分子中的形状和体积与氢基本上相同，如果药物分子中氢被选择性替换为氘，氘代药物一般还会保留原来的生物活性和选择性。同时发明人经过实验证实，碳氘键的结合比碳氢键的结合更稳定，可直接影响一些药物的吸收、分布、代谢和排泄等属性，从而提高药物的疗效、安全性和耐受性。
优选的，氘在氘代位置的氘同位素含量至少是大于天然氘同位素含量(0.015％)，较佳地大于30％，更佳地大于50％，更佳地大于75％，更佳地大于95％，更佳地大于99％。
具体地说，在本发明中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23、R24和R25各氘代位置中氘同位素含量至少是5％，较佳地大于10％，更佳地大于15％，更佳地大于20％，更佳地大于25％，更佳地大于30％，更佳地大于35％，更佳地大于40％，更佳地大于45％，更佳地大于50％，更佳地大于55％，更佳地大于60％，更佳地大于65％，更佳地大于70％，更佳地大于75％，更佳地大于80％，更佳地大于85％，更佳地大于90％，更佳地大于95％，更佳地大于99％。
优选的，式(I)中化合物的R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23、R24和R25中，至少其中一个R含氘，更佳地两个R含氘，更佳地三个R含氘，更佳地四个R含氘，更佳地五个R含氘，更佳地六个R含氘，更佳地七个R含氘，更佳地八个R含氘，更佳地九个R含氘，更佳地十个R含氘，更佳地十一个R含氘，更佳地十二个R含氘，更佳地十三个R含氘，更佳地十四个R含氘，更佳地十五个R含氘，更佳地十六个R含氘，更佳地十七个R含氘，更佳地十八个R含氘，更佳地十九个R含氘，更佳地二十个R含氘，更佳地二十一个R含氘，更佳地二十二个R含氘，更佳地二十三个R含氘，更佳地二十四个R含氘，更佳地二十五个R含氘。
作为本发明的进一步改进，R1、R2和R3各自独立地为氘或氢。
作为本发明的进一步改进，R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12各自独立地为氘或氢。
作为本发明的进一步改进，R13和R14各自独立地为氘或氢。
作为本发明的进一步改进，R15和R16各自独立地为氘或氢。
作为本发明的进一步改进，R17、R18、R19、R20、R21和R22各自独立地为氘或氢。
作为本发明的进一步改进，R23、R24和R25各自独立地为氘或氢。
在另一优选例中，R1、R2、R3是氘。
在另一优选例中，R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12是氘。
在另一优选例中，R13、R14是氘。
在另一优选例中，R15、R16是氘。
在另一优选例中，R17、R18、R19、R20、R21、R22是氘。
在另一优选例中，R23、R24、R25是氘。
作为本发明的进一步改进，所述化合物选自下述化合物或其药学上可接受的盐：
Figure GPA0000253282230000051
Figure GPA0000253282230000061
在另一优选例中，所述化合物不包括非氘代化合物。
本发明还公开了一种药物组合物，其含有药学上可接受的载体和如上所述的所述的丙型肝炎病毒抑制剂，或其晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物、立体异构体、前药或同位素变体的药物组合物。
作为本发明的进一步改进，该药物组合物还包含其他化合物，例如，干扰素或干扰素/利巴韦林组合，或其它HCV抑制剂(如，HCV聚合酶抑制剂或HCV蛋白酶抑制剂)。
本发明还提供了一种制备药物组合物的方法，包括步骤：将药学上可接受的载体与如上所述的丙型肝炎病毒抑制剂，或其晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物进行混合，形成药物组合物。
本发明还公开了一种如上所述的丙型肝炎病毒抑制剂的用途，其特征在于：用于制备治疗丙型肝炎病毒感染的药物中的用途。
所述的HCV包括其多种基因型以及多种基因亚型，例如1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、5a、6a。
作为本发明的进一步改进，所述药学上可接受的载体包括助流剂、增甜剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、矫味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、崩解剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂中的至少一种。
作为本发明的进一步改进，所述药物组合物为片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、膏剂、乳剂、悬浮剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球或气溶胶。
给予本发明药物组合物的典型途径包括但不限于口服、直肠、透黏膜、经肠给药，或者局部、经皮、吸入、肠胃外、舌下、阴道内、鼻内、眼内、腹膜内、肌内、皮下、静脉内给药。优选口服给药或注射给药。
本发明的药物组合物可以采用本领域周知的方法制造，如常规的混合法、溶解法、制粒法、制糖衣药丸法、磨细法、乳化法、冷冻干燥法等。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
本文中，如无特别说明，“卤素”指F、Cl、Br、和I。更佳地，卤原子选自F、Cl和Br。
本文中，如无特别说明，“氘代”指化合物或基团中的一个或多个氢被氘所取代；氘代可以是一取代、二取代、多取代或全取代。术语“一个或多个氘代的”与“一次或多次氘代”可互换使用。
本文中，如无特别说明，“非氘代的化合物”是指含氘原子比例不高于天然氘同位素含量(0.015％)的化合物。
本发明还包括同位素标记的化合物(也称为“同位素变体”)，等同于原始化合物在此公开。可以列为本发明的化合物同位素的例子包括氢，碳，氮，氧，磷，硫，氟和氯同位素，分别如2H，3H，13C，14C，15N，17O，18O，31P，32P，35S，18F以及36Cl。其中含有上述同位素或其他同位素原子的本发明的式(I)的化合物或其多晶型、药学上可接受的盐、前药、立体异构体、同位素变体、水合物或溶剂合物都在本发明的范围之内。本发明中某些同位素标记化合物，例如3H和14C的放射性同位素也在其中，在药物和底物的组织分布实验中是有用的。氚，即3H和碳-14，即14C，它们的制备和检测比较容易，是同位素中的首选。此外，较重同位素取代如氘，即2H，由于其很好的代谢稳定性在某些疗法中有优势，例如在体内增加半衰期或减少用量，因此，在某些情况下可以优先考虑。同位素标记的化合物可以用一般的方法，通过用易得的同位素标记试剂替换为非同位素的试剂，用示例中的方案可以制备。
药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸；甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸等有机酸；以及脯氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸。另一类优选的盐是本发明化合物与碱形成的盐，例如碱金属盐(例如钠盐或钾盐)、碱土金属盐(例如镁盐或钙盐)、铵盐(如低级的烷醇铵盐以及其它药学上可接受的胺盐)，例如甲胺盐、乙胺盐、丙胺盐、二甲基胺盐、三甲基胺盐、二乙基胺盐、三乙基胺盐、叔丁基胺盐、乙二胺盐、羟乙胺盐、二羟乙胺盐、三羟乙胺盐，以及分别由吗啉、哌嗪、赖氨酸形成的胺盐。
术语“多晶型”是指化学药物分子的不同排列方式，一般表现为药物原料在固体状态下的存在形式。一种药物可以多种晶型物质状态存在，同一种药物的不同晶型，在体内的溶解和吸收可能不同，从而会对制剂的溶出和释放产生影响。
术语“溶剂合物”指本发明化合物与溶剂分子配位形成特定比例的配合物。“水合物”是指本发明化合物与水进行配位形成的配合物。
术语“前药”是指在体内通过例如在血液中水解转变成其具有医学效应的活性形式的化合物。前药为任何共价键合的载体，当将这种前药给予患者时，其在体内释放本发明化合物。通常通过修饰官能团来制备前药，该修饰使得前药在体内裂解产生母体化合物。前药包括，例如，其中羟基、氨基或巯基与任意基团键合的本发明化合物，当将其给予患者时，可以裂解形成羟基、氨基或巯基。因此，前药的代表性实例包括但不限于，本发明化合物通过其中的羟基、氨基或巯基官能团与乙酸、甲酸或苯甲酸形成的共价衍生物。另外，在羧酸(-COOH)的情况下，可以使用酯，例如甲酯、乙酯等。酯本身可以是有活性的和/或可以在人体体内条件下水解。合适的药学上可接受的体内可水解的酯包括容易在人体中分解而释放母体酸或其盐的那些。
本发明化合物可包括一个或多个不对称中心，且因此可以存在多种“立体异构体”形式，例如，对映异构体和/或非对映异构体形式。例如，本发明化合物可为单独的对映异构体、非对映异构体或几何异构体(例如顺式和反式异构体)，或者可为立体异构体的混合物的形式，包括外消旋混合物和富含一种或多种立体异构体的混合物。异构体可通过本领域技术人员已知的方法从混合物中分离，所述方法包括：手性高压液相色谱法(HPLC)以及手性盐的形成和结晶；或者优选的异构体可通过不对称合成来制备。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：第一，本发明的化合物对丙型肝炎病毒蛋白NS5A具有优异的抑制性。第二，通过氘化这一技术改变化合物在生物体中的代谢，使化合物具有更好的药代动力学参数特性。在这种情况下，可以改变剂量并形成长效制剂，改善适用性。第三，用氘取代化合物中的氢原子，由于其氘同位素效应，提高化合物在动物体内的药物浓度，提高了药物疗效。第四，用氘取代化合物中的氢原子，可以抑制某些代谢产物，提高了化合物的安全性。
具体实施方式
下面更具体地描述本发明式(I)结构化合物的制备方法，但这些具体方法不对本发明构成任何限制。本发明化合物还可以任选将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便地制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易地进行。
实施例1制备N-(6-(3-叔丁基-5-(2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-d3- 甲氧基苯基)萘-2-基)甲磺酰胺(化合物D-1)
Figure GPA0000253282230000101
具体合成步骤如下：
Figure GPA0000253282230000102
步骤1.N-(2-腈基苯基)吡啶酰胺(化合物3)的合成。
在反应瓶中加入吡啶-2-羧酸(1.23g，10mmol)，2-腈基苯胺(1.42g，12mmol)，2-(7-氧化苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，7.6g，20mmol)和N，N-二异丙基乙胺(DIPEA，5.17g，40mmol)，加入50mL DMF溶解，室温下搅拌反应4-6小时，TLC检测反应完毕后，加入乙酸乙酯稀释，依次用5％柠檬酸水溶液、水、碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤，浓缩，加入少量异丙醇重结晶得1.23g产物，收率：55.15％。
步骤2. 6-羟基-2-萘硼酸(化合物5)的合成。
向反应瓶中加入6-溴-2-萘酚(2.23g，10mmol)，加入40mL无水四氢呋喃溶解，降温至-78℃，氮气保护下滴加正丁基锂(10ml，25mmol)，反应1小时，滴加硼酸三异丙酯(2.82g，15mmol)，低温下反应0.5小时后升至室温继续反应0.5小时，TLC检测反应完毕后，加入1M稀盐酸调PH至酸性，分出有机相，水相再用乙醚萃取两次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，浓缩，柱层析纯化后得到1.13g产物，收率60.2％。
步骤3. 2-叔丁基-4，6-二碘苯酚(化合物7)的合成。
向反应瓶中加入2-叔丁基苯酚(5.0g，33.3mmol)，氢氧化钠(1.6g，40mmol)，加入65mL甲醇溶解，冰盐浴降温至-2℃，加入碘化钠(3.75g，25mmol)，然后滴加10％的次氯酸钠水溶液(11.25mL)，期间控制内温不超过2℃，重复此操作3次，最后加入少量次氯酸钠使反应液颜色由黄绿色变为茶色，升至室温继续反应1小时，TLC检测反应完毕。降温至0℃，滴加16.7％的硫代硫酸钠水溶液(25mL)，加毕，滴加浓盐酸调PH至3.0，过滤，滤饼用水洗涤，真空干燥得产物12.1g，收率：91％。
步骤4. 1-叔丁基-3，5-二碘-2-d3-甲氧基苯(化合物8)的合成。
向反应瓶中加入化合物7(4.2g，10.44mmol)，加入25mL丙酮溶解，加入氘代碘甲烷(1.85g，13.05mmol)和氢氧化钠(0.48g，12.0mmol)，室温下搅拌反应过夜，TLC检测反应完毕后，浓缩除去溶剂，加入少量正庚烷和水，分出有机相，饱和食盐水洗涤，浓缩，硅胶柱层析纯化得到亮黄色油状液体4.05g，收率：92.6％
步骤5. 1-(3-叔丁基-5-碘-4-d3-甲氧基苯基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮(化合物9)的合成。
向反应瓶中加入化合物8(5.19g，14.33mmol)、尿嘧啶(1.93g，17.2mmol)、化合物3(0.64g，2.87mmol)和磷酸钾(6.4g，30.1mmol)，加入10mL DMSO溶解，氮气鼓泡0.5小时，加入碘化亚铜(0.27g，1.43mmol)，继续鼓泡10分钟，氮气保护下加热至60℃反应18小时，TLC检测反应完毕后加入少量乙酸乙酯稀释，依次用水、饱和氯化铵和饱和食盐水洗涤，浓缩，硅胶柱层析纯化得到3.26g产物，收率：56.8％。
步骤6. 1-(3-叔丁基-5-(6-羟基萘-2-基)-4-d3-甲氧基苯基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮(化合物10)的合成。
向反应瓶中加入化合物9(1.7g，4.26mmol)和化合物5(0.84g，4.47mmol)，加入30mL四氢呋喃溶解，氮气鼓泡0.5小时，加入磷酸钾(1.81g，8.52mmol)的10mL水溶液，再加入Pd2(dba)3(39mg，0.043mmol)和配体Xantphos(113.4mg，0.196mmol)，氮气继续鼓泡0.5小时，升温至65℃反应过夜，TLC检测反应完毕后加入少量饱和食盐水，分出有机相，浓缩，硅胶柱层析纯化得到1.15g产物，收率：64.8％。
步骤7. 6-(3-叔丁基-5-(2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-d3-甲氧基苯基)萘-2-基-1，1，2，2，3，3，4，4，4-九氟丁烷-1-磺酸酯(化合物11)的合成。
向反应瓶中加入化合物10(1.15g，2.76mmol)和碳酸钾(0.57g，4.14mmol)，加入30mL DMF溶解，氮气保护下加入全氟丁烷磺酰氟(0.92g，3.04mmol)，搅拌反应过夜，TLC检测反应完毕后，加入少量水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取3-4次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，浓缩，硅胶柱层析纯化得到1.34g产物，收率：69.6％。
步骤8.N-(6-(3-叔丁基-5-(2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-d3-甲氧基苯基)萘-2-基)甲磺酰胺(化合物D-1)的合成。
向反应瓶中加入Pd2(dba)3(1.65mg，0.0018mmol)、配体Xantphos(2.54mg，0.0044mmol)和磷酸钾(108.26mg，0.51mmol)，氮气保护下加入5mL叔戊醇，加热至80℃反应0.5小时。在另一反应瓶中加入化合物11(321mg，0.46mmol)和甲基磺酰胺(66.6mg，0.7mmol)，加入10mL叔戊醇，氮气保护下加热至60℃反应0.5小时后将溶液转移至上述反应瓶，升温至85℃反应14小时。TLC检测反应完毕后，浓缩除去溶剂，加入少量乙酸乙酯溶解，用饱和食盐水洗涤，硅胶柱层析纯化得目标产物147.6mg，收率：65％。LC-MS(APCI)：m/z＝494.6(M+1)+。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ11.42(d，J＝1.9Hz，1H)，10.05(s，1H)，8.03(s，1H)，7.96(t，J＝8.3Hz，2H)，7.80(d，J＝7.9Hz，1H)，7.75-7.67(m，2H)，7.42(dd，J＝8.9，2.1Hz，1H)，7.37(d，J＝2.6Hz，1H)，7.31(d，J＝2.7Hz，1H)，5.65(dd，J＝7.9，2.2Hz，1H)，3.08(s，3H)，1.42(s，9H)。
实施例2
对以上实施例的化合物进行生物活性评价。
为了验证本文所述的化合物对HCV的作用，发明人采用HCV复制子系统(HCVReplicon System)作为评价模型。自Science1999年首次报道以来，HCV复制子系统已经成为研究HCV RNA复制、致病性和病毒持续性的最重要的工具之一，例如已经利用复制子成功地证明了HCV RNA复制所必须的5′-NCR最小区域，并且HCV复制子系统已经成功地被用作抗病毒药物的评价模型。本发明的发明人按照Science，1999，285(5424)，110-3，以及J.Virol，2003，77(5)，3007-19所描述的方法进行验证。
(1)检测化合物抗HCV 1a和1b基因型复制子活性
应用HCV-1a和HCV-1b稳定转染复制子细胞检测化合物丙型肝炎病毒基因型1a和1b复制子的抑制活性。本实验将以Dasabuvir作为阳性对照化合物。
步骤一：对化合物进行1∶3系列稀释8个浓度点，双复孔，加入96孔板中。设置DMSO为无加化合物对照。细胞培养液中的DMSO最终浓度为0.5％。
步骤二：将HCV-1a和1b细胞分别悬浮在含10％FBS的培养液中，以每孔8,000个细胞的密度种到含有化合物的96孔板中。细胞在5％CO2、37℃条件下培养3天。
步骤三：用CellTiter-Fluor(Promega)测定化合物对GT1b复制子细胞毒性。
步骤四：用Bright-Glo(Promega)检测荧光素酶测定化合物抗丙型肝炎病毒活性。
步骤五：采用GraphPad Prism软件分析数据，拟合曲线并计算EC50值和CC50值。
表1实施例D-1与对照品Dasabuvir的抗HCV基因型复制子活性对比表
编号 HCV GT1a EC<sub>50</sub>(nM) HCV GT1b EC<sub>50</sub>(nM) HCV CC<sub>50</sub>(nM)
Dasabuvir 7.61 ＜2.32 ＞5000
D-1 ＜2.32 ＜2.32 ＞5000
实验结果表明，本发明的化合物可抑制HCV的多个基因型，并通过抑制HCV NS5B蛋白的机制，发挥了优越的抗丙肝病毒作用。
(2)代谢稳定性评价
微粒体实验：人肝微粒体：0.5mg/mL，Xenotech；大鼠肝微粒体：0.5mg/mL，Xenotech；辅酶(NADPH/NADH)：1mM，Sigma Life Science；氯化镁：5mM，100mM磷酸盐缓冲剂(pH为7.4)。
储备液的配制：精密称取一定量的化合物实施例化合物的粉末，并用DMSO分别溶解至5mM。
磷酸盐缓冲液(100mM，pH7.4)的配制：取预先配好的0.5M磷酸二氢钾150mL和700mL的0.5M磷酸氢二钾溶液混合，再用0.5M磷酸氢二钾溶液调节混合液pH值至7.4，使用前用超纯水稀释5倍，加入氯化镁，得到磷酸盐缓冲液(100mM)，其中含100mM磷酸钾，3.3mM氯化镁，pH为7.4。
配制NADPH再生系统溶液(含有6.5mM NADP，16.5mM G-6-P，3U/mL G-6-P D，3.3mM氯化镁)，使用前置于湿冰上。
配制终止液：含有50ng/mL盐酸普萘洛尔和200ng/mL甲苯磺丁脲(内标)的乙腈溶液。取25057.5μL磷酸盐缓冲液(pH7.4)至50mL离心管中，分别加入812.5μL人肝微粒体，混匀，得到蛋白浓度为0.625mg/mL的肝微粒体稀释液。取25057.5μL磷酸盐缓冲液(pH7.4)至50mL离心管中，分别加入812.5μL SD大鼠肝微粒体，混匀，得到蛋白浓度为0.625mg/mL的肝微粒体稀释液。
样品的孵育：用含70％乙腈的水溶液将相应化合物的储备液分别稀释至0.25mM，作为工作液，备用。分别取398μL的人肝微粒体或者大鼠肝微粒体稀释液加入96孔孵育板中(N＝2)，分别加入2μL 0.25mM的的工作液中，混匀。
代谢稳定性的测定：在96孔深孔板的每孔中加入300μL预冷的终止液，并置于冰上，作为终止板。将96孔孵育板和NADPH再生系统置于37℃水浴箱中，100转/分钟震荡，预孵5min。从孵育板每孔取出80μL孵育液加入终止板，混匀，补充20μL NADPH再生系统溶液，作为0min样品。再向孵育板每孔加入80μL的NADPH再生系统溶液，启动反应，开始计时。相应化合物的反应浓度为1μM，蛋白浓度为0.5mg/mL。分别于反应10、30、90min时，各取100μL反应液，加入终止板中，涡旋3min终止反应。将终止板于5000×g，4℃条件下离心10min。取100μL上清液至预先加入100μL蒸馏水的96孔板中，混匀，采用LC-MS/MS进行样品分析。
数据分析：通过LC-MS/MS系统检测相应化合物及内标的峰面积，计算化合物与内标峰面积比值。通过化合物剩余量的百分率的自然对数与时间作图测得斜率，并根据以下公式计算t1/2和CLint，其中V/M即等于1/蛋白浓度。
Figure GPA0000253282230000141
对本发明化合物及其没有氘代的化合物同时测验比较，评价其在人和大鼠肝微粒体的代谢稳定性。作为代谢稳定性的指标的半衰期及肝固有清除率如表2所示。表2中采用未经氘代的化合物Dasabuvir作为对照样品。如表2所示，通过与未经氘代的化合物Dasabuvir对照，本发明化合物可以显著改善代谢稳定性，进而更适于作为丙型肝炎病毒抑制剂。
表2实施例D-1与Dasabuvir对照样的代谢稳定性对比表
Figure GPA0000253282230000142
(3)大鼠药代动力学实验
实验目的：研究大鼠给予Dasabuvir、化合物D-1后，考察本发明化合物的药代动力学行为。
实验动物：
种类及品系：SD大鼠等级：SPF级
性别及数量：雄性，6只
体重范围：180～220g(实际体重范围为187～197g)
来源：上海西普尔必凯实验动物有限公司
实验及动物合格证号：SCXK(沪)2013-0016
实验过程：
在血样采集之前，预先在EDTA-K2抗凝管中加入20L的2M氟化钠溶液(酯酶抑制剂)，于80度烘箱内烘干后，置于4度冰箱存放。
大鼠，雄性，体重187～197g，随机分为2组，于实验前一天下午开始禁食过夜但可自由饮水，给药后4h给食物。A组给予Dasabuvir 3mg/kg，B组给予式T-1化合物3mg/kg，分别于给药后15min、30min、1、2、3、5、8、10h从大鼠眼眶静脉取血100-200L左右，置于经EDTA-K2抗凝的0.5mL的Eppendorf管中，立即混匀，抗凝后，尽快将试管轻轻颠倒混匀5-6次后，血取好后放置在冰盒中，30min内把血样本在4000rpm，10min，4℃条件下离心分离血浆，收集全部血浆后立即于-20℃保存。所有时间点样品采集后测定每个时间点的血浆中的血药浓度。
根据上述所得的给药后平均血药浓度-时间数据，采用Winnonin软件，按非房室统计矩理论求算雄性SD大鼠分别i.g给予Dasabuvir(3mg/kg)、实施例化合物(3mg/kg)后的药代动力学相关参数，详见表3。
表3实施例D-1与Dasabuvir对照样的大鼠药代动力学实验对比表
Figure GPA0000253282230000151
Figure GPA0000253282230000161
实验结果表明，与Dasabuvir相比，本发明人发现本发明化合物具有比Dasabuvir更优的活性，并且具有优异的药代动力学性质，因此更适合作为抑制丙型肝炎病毒蛋白NS5B的化合物，进而适合制备治疗丙型肝炎病毒感染的药物。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则份数和百分比为重量份和重量百分比。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.化合物，其选自下述化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0002821395850000011
2.药物组合物，其含有药学上可接受的载体和权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐。
3.权利要求1所述的化合物在制备用于治疗丙型肝炎病毒感染的药物中的用途。
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