CN108276468B

CN108276468B - 一种甘草次酸酯及其制备方法和在制备抗病毒药物中的应用

Info

Publication number: CN108276468B
Application number: CN201810205157.6A
Authority: CN
Inventors: 梁剑平; 刘宇; 王震; 梁妍; 郝宝成; 王学红; 郭文柱; 赵凤舞; 杨珍; 贾忠; 张新刚; 陈虹
Original assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Current assignee: SHANDONG DEXIN BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2018-03-13
Filing date: 2018-03-13
Publication date: 2019-12-31
Anticipated expiration: 2038-03-13
Also published as: CN108276468A

Abstract

本发明公开一种甘草次酸酯，具有如下化学结构式：

Description

一种甘草次酸酯及其制备方法和在制备抗病毒药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种甘草次酸酯及其制备方法和在制备抗病毒药物中的应用。

背景技术

我国是世界上认识和研究甘草最早的国家，东汉成书的《神农本草经》中即有记载, 并将它列为上品。此后历代本草经对甘草皆有记载,经查我国利用甘草治疗疾病已有250。多年的历史，被历代名医尊为众药之王。1977年《中国药典》正式将乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草作为药用甘草植物收载。我国学者对甘草属药用植物从系统分类、生态资源、化学成分、质量评价以及生产加工等诸方面进行了大量的科学研究。自1964年荷兰学者发表甘草提取物对治疗胃溃疡有较好疗效后，引起国内外药学工作者的广泛重视，此后国外学者从细胞水平到动物体内代谢以及人体生物利用度进行了广泛的研究，为临床合理用药提供了重要依据，进一步丰富和加深了对甘草有效成分预防和治疗某些疾病机制的认识。

甘草次酸为甘草中的主要有效成分，属于五环三萜类化合物，具有治疗心血管疾病、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、免疫调节、抗氧化、肾上腺皮质激素样作用等药理活性。目前，对其药理作用的研究主要集中在抗肿瘤活性方面，其抗肿瘤作用主要表现为对肿瘤的起始、促进和发展3个阶段均有抑制作用。通过对其进行结构改造，合成出结构其衍生物-甘草次酸。甘草酸在抗肿瘤与病毒方面也进行了一些研究发现，甘草次酸可与线粒体的呼吸链相互作用产生过氧化氢、氧化琉基，破坏肿瘤与病毒的核苷酸，如果钙离子同时存在，使线粒体膜通透性转运孔打开，伴有细胞色素C和凋亡诱导因子的释放。

六茜素为鹿蹄草科植物鹿蹄草或普通鹿蹄草的有效成分氢醌类化合物，又名鹿蹄草素、甲基氢醌，化学名为2-甲基-1,4-苯二酚。临床研究表明，鹿蹄草素具有抗菌作用强、抗菌谱广、毒性低等特点，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等20多种病原菌有较强的抑制作用，尤其对多种病菌引起的呼吸道、胃肠道、泌尿及生殖系统感染疾病具有良好的疗效，且优于其他抗菌药。

发明内容

本发明的目的在于根据上述背景技术的现状，提供了一种甘草次酸酯，该化合物表现出明显的抗病毒活性。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明六茜素-甘草次酸酯的IR光谱图；

图2是本发明六茜素-甘草次酸酯的1HNMR图谱；

图3是本发明六茜素-甘草次酸酯的13CNMR图谱。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

(一)本发明六茜素-甘草次酸酯的合成

1.1仪器与试药

1.1.1仪器

JJ—500型电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)；AB135—S型电子分析天平(梅特勒–托利多仪器有限公司)；DF—101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)；RY—1型显微熔点仪(天津市分析仪器厂)；SHZ—D(Ⅲ)型循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)；RE-2000旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；KQ500DE 型数控超声波发生器(昆山市超声仪器有限公司)；AC—P400型核磁共振仪(瑞士Bruker 公司)；IR200FT-IR傅立叶变换红外光谱仪(美国Nicolet公司)。

1.1.2试药

六茜素：纯度99.2％，中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，自制；甘草次酸(C₃₀H₄₆O₄)：纯度不少于97.0％，西安融升生物科技有限公司，其余试剂均为化学纯试剂。

1.2方法与结果

1.2.1合成部分

1.2.1.1六茜素-甘草次酸酯的制备：精密称取23.5g甘草次酸与10.5g六茜素置于100mL的圆底烧瓶中，并加入其中50mL二氯甲烷溶解，用微波加热控制反应温度12℃，伴随机械搅拌，滴加10mL的50％NaOH(mg/ml)溶液，30min滴加完毕后，继续搅拌4h。反应完毕后，分液漏斗分液，再用旋转蒸发除去有机溶剂，得到大量沉淀。沉淀物加入 5％氢氧化钾溶液洗，除去未反应的六茜素和甘草次酸，真空干燥。整个反应过程，利用薄层层析法跟踪检测。层析条件石油醚/乙酸乙酯(4:1，v/v)。最终的到浅黄色固体(86.9 mg)，经NMR、IR确定其结构。

1.2.1.2六茜素-甘草次酸酯的结构确定

IR光谱(见图1)：3328cm^-1为羟基氧氢键的伸缩振动峰(υOH)，2962-2884cm-1 为饱和烷烃碳氢键的伸缩振动峰(υCH)，1737cm^-1、1695cm^-1、1659cm^-1为羰基的伸缩振动峰(υC＝O)；1602cm^-1、1587cm^-1、1501cm^-1为苯环中碳碳双键骨架伸缩振动信号； 1458cm^-1、1389cm^-1为甲基的变形振动峰(δCH3)；1206cm^-1、1140cm^-1为碳氧键的伸缩振动峰(υC-O)。

1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm：8.086、7.576、7.471为邻甲基对苯酚中苯环上的氢信号，5.740、4.803、2.442、1.398、1.239、1.221、1.156、1.045、0.958、0.851为甾体母核上的氢信号，2.934～0.795为甾体母核和其它饱和碳上氢信号，以上数据说明甾体结构和邻甲基对苯酚的存在，同样13CNMR图谱也证明了以上结论，见图2和图3。

1.2.1.3六茜素-甘草次酸酯的合成工艺优化

1.2.1.3.1原料配比的影响

固定反应温度为12℃，反应4h，二氯甲烷50mL，50％NaOH 10mL。考察甘草次酸酯与六茜素的摩尔比对产物收率的影响，结果见表1-1。

表1-1原料配比对收率的影响

由表1-1可知，随着甘草次酸酯与六茜素摩尔比的提高，产物收率増加明显，当甘草次酸酯与六茜素摩尔比达到1:1.70时，收率最高，再继续增加摩尔比，产物收率有所下降。因此，甘草次酸酯/六茜素的摩尔比可控制在1:1～2，较佳的摩尔比为1:1.42～2，最佳的摩尔比为1:1.70，

1.2.1.3.2油水体积比对收率的影响

固定甘草次酸酯与六茜素摩尔比为1:1.70，反应温度为12℃，反应4h，二氯甲烷50mL，考察50％NaOH溶液用量对产物收率的影响，结果见表1-2。

表1-2 50％NaOH用量对收率的影响

由表1-2可知，其他条件相同时，随着50％NaOH用量的增加，收率有一些增加，但变化不太明显，可能是因为50％NaOH在反应过程中起着脱水的作用，将另一产物水迅速的除去，有利于反应向右的进行。因此，50％NaOH与二氯甲烷的体积比可控制在2.5～ 20:50，较佳的量为10:50。

1.2.1.3.3反应时间对收率的影响

固定甘草次酸酯与六茜素摩尔比为1:1.70，反应温度为12℃，二氯甲烷50mL，50％NaOH 10mL。考察反应时间对产物收率的影响，结果见表1-3。

表1-3反应时间对收率的影响

由表1-3可知，随着反应时间的增加，产物收率略有增加，但增加的不明显。反应时间控制在2-8h均可，从成本和收率的角度，反应时间确定为4h较为有利。

1.2.1.3.4反应温度对收率的影响

固定甘草次酸酯与六茜素摩尔比为1:1.70，反应时间4h，二氯甲烷50mL，50％NaOH10mL。考察反应温度对产物收率的影响，结果见表1-4。

表1-4反应温度对收率的影响

由表1-4可知，反应温度对收率的影响较大。从6到24℃时，开始随着温度先增加后降低。当温度达到12℃时，收率达到最高。因此，反应温度可控制为6～24℃，最佳的反应温度为12℃。

1.3讨论

六茜素结构中存在酚羟基，甘草次酸有羧基，他们之间的酯化可直接采用在强碱的条件下脱水成酯，由于甘草次酸的分子结构中存在三个活性中心，即羧基、羰基和羟基，为了避免生成多个产物，本发明采取了相转移方法将生成的目标化合物及时转移到有机相，减少副反应的发生。

(二)六茜素的制备

2.1.六茜素的反应路线

2.2.甲基苯醌的制备

将水50g置于200mL反应三口瓶中，搅拌下加入硫酸22g，冷却后4℃滴加2-甲基苯胺5g。加毕，搅拌至全溶，再分批加入软锰矿粉20g，于18±2℃保温搅拌8h，静置过夜。次日水蒸气蒸馏，即得甲基苯醌-水混合物。

2.3.甲基氢醌(六茜素)的制备

在300mL三口瓶中，将上述甲基苯醌-水混合物加水140g稀释后，通二氧化硫进行还原，直至黄色结晶全溶。继续搅拌1h，待反应液澄清后，用乙醚萃取(3×10mL)。旋转蒸发仪减压回收乙醚，得甲基氢醌粗品。

甲基氢醌粗品2.2g加去离子水6.6g、二氧化硫水溶液2.2g，通二氧化硫至pH＝2，搅拌加热。全溶后，加0.5g活性炭脱色，趁热过滤。滤液冷却结晶，过滤，水洗后甩干，减压干燥得六茜素精品，熔点125-126℃。

(三)六茜素-甘草次酸酯对鸡法氏囊病的治疗试验

长期以来，病毒性疾病严重影响着畜禽的正常生长和生产。鸡患法氏囊病后免疫器官受到破坏，造成免疫抑制，从而降低鸡对多种病毒和细菌的防御能力，其危害性很大，造成的经济损失很严重。本试验的目的是评价六茜素-甘草次酸酯对鸡法氏囊病的治疗效果及其与甘草次酸的药效对比，筛选最佳用药剂量。六茜素-甘草次酸酯为人工化学合成的化合物，初步试验证明具有抗病毒、抗菌消炎、增强机体免疫力之功能。用六茜素-甘草次酸酯与甘草次酸治疗人工感染鸡法氏囊病，结果六茜素-甘草次酸酯治疗组比甘草次酸治疗组鸡的存活率高23.4％，鸡的相对增重率高12.06％。

3.1材料与方法

3.1.1试验材料

3.1.1.1受试药物：六茜素-甘草次酸酯，本发明所制。

3.1.1.2对照药物：甘草次酸(C₃₀H₄₆O₄)纯度不少于97.0％，西安融升生物科技有限公司。六茜素纯度不少于98.0％，实验室自制。

以上试验药物均采用5％吐温-80助溶配成饮水剂。

3.1.1.3试验动物35日龄公雏，由甘肃凯悦鸡场提供。

3.1.1.4攻毒毒种IBDV：购自中国兽药监察所。

3.1.2试验方法

3.1.2.1将法氏囊病毒用生理盐水按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5倍稀释备用。

3.1.2.2攻毒剂量测定取试验鸡20只，随机分成4组，分别按每只鸡0.4ml(其中0.2ml 点眼、0.2ml滴鼻)。攻毒72h后，10^-1稀释组全部死亡，10^-2稀释组死亡3只，10^-4稀释组死亡2只，10^-5稀释组无死亡。故将攻毒量定为10^-2稀释，每只鸡0.4ml，其中0.2ml 点眼，0.2ml滴鼻。

3.1.2.3试验分组将上述35日龄公雏随机分为7组，每组30只。将六茜素-甘草次酸酯按0.2％、0.1％、0.05％(W/W)的高、中、低3个浓度组以饮水方式分别给予1、2、3 组试验鸡群。药物对照组1甘草次酸，药物对照组2六茜素，均按0.2％浓度以饮水方式分别给予第4、5组，第6组为空白对照组(不攻毒不给药)，第7组为阳性对照组(攻毒不给药)。

3.1.2.4试验方法，饮用药液5％吐温-80助溶、现用现配，雏鸡攻毒发病后连续用药 5d，停药后观察15d。每天记录发病及死亡情况，试验前后记录平均体重。

3.1.2.5试验观察雏鸡攻毒65h后，出现羽毛松乱、无光泽、排白色水样粪便，精神沉郁，进食减少或不食，扎堆，颈部躯干震颤等现象，出现部分死亡。对病死鸡只进行剖检,可见胸肌、腿肌有点状或条状出将病死鸡法氏囊组织乳剂与IBDV标准阳性血清作琼脂扩散沉淀试验，结果全部为阳性。

给药48h后，第1、2、3、4组鸡采食量增加，第3天停止死亡，精神、食欲明显改善，症状明显好转，第5天症状基本消失，食欲、精神、粪便均恢复正常。

3.2试验结果

试验结束后，统计各组死亡鸡数，死亡率、存活率，试验前后记录平均体重，结果见表2-1。

表2-1试验各组死亡鸡数、死亡率、存活率及增重情况

结果表明，以0.2％、0.1％、0.05％浓度饮水病毒六茜素-甘草次酸酯和0.2％浓度饮用甘草次酸，均能大幅提高感染法氏囊病鸡的成活率，其死亡率也远远低于阳性对照组，而且能一定程度地提高感染鸡的相对增重率。

3.3小结

通过以上试验结果可以看出，六茜素-甘草次酸酯治疗鸡法氏囊病效果显著，其高、中、低剂量组饮水给药优于甘草次酸对照治疗组。与甘草次酸相比，六茜素-甘草次酸酯具有明显的增重作用，且无残留、无毒副作用。临床推荐用药剂量为0.1％，用药时间为5d一个疗程。

(四)六茜素-甘草次酸酯的急性毒性试验

4.1.材料与方法

4.1.1试验材料

六茜素-甘草次酸酯：自制；小白鼠由兰州大学实验动物中心提供，体质量为(17.00 ±1)g。动物房及实验室温度为(24±1)g光照黑暗每12h更替。试验小白鼠于试验前在动物房适应一周，塑料笼饲养，每周更换垫料3次，自由摄食摄水。

4.1.2试验方法

预试验试验前对小白鼠进行7d喂养观察，观察期内小白鼠自由饮水、采食，每日空腹称量体质量，淘汰自然死亡小白鼠。预试验期内选取40只小白鼠，随机分为，5组，每组8只，雌雄各半。按100、200、400、800mg/kg剂量1次性灌胃给药，确定正式试验的剂量范围。

急性毒性试验另取只小白鼠20随机分为2组。给药组以最大质量浓度(1.0g/mL)、最大容积(0.8mL)1次性灌胃受试药物，对照组用等体积生理盐水，给药后连续观察7d，测定最大给药量。正式试验时，将小白鼠随机分为4组(对照组和个给药组，给药组药剂量分别为800、400、200mg/kg)，每组10只，雌雄各半，共40只。灌胃前后6h禁食(自由饮水)，试验组均按每只小白鼠的体质量计算给药量，金属灌胃器一次性灌胃给药。对照组小白鼠保持自由采食和饮水。给药后每天观察小白鼠的采食、饮水、死亡、精神、被毛和自主活动等，连续观察7d。及时解剖死亡小白鼠，记录病变情况，并在第8天称量所有小白鼠体质量并解剖，观察腹腔内液体情况和实质性器官的病理变化。

4.2.结果与分析

经口1次灌服后，各试验组小白鼠均未见死亡病例，按寇式改良法不能计算出该制剂的半数致死量(LD₅₀)。该结果表明本发明的六茜素-甘草次酸酯的LD₅₀大于800mg/kg，按药物毒性分级标准，认为该药物无毒。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种甘草次酸酯，具有如下化学结构式：

。

2.权利要求1所述甘草次酸酯的制备方法，包括：六茜素与甘草次酸在由非水溶性有机溶剂和碱性水溶液构成的油水两相体系中反应，得到所述的甘草次酸酯。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述六茜素与甘草次酸的摩尔比为1:1～1:2。

4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述六茜素与甘草次酸的摩尔比为1:1 .4～1:2。

5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述六茜素与甘草次酸的摩尔比为1:1 .7。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述非水溶性有机溶剂为二氯乙烷；和/或所述碱性水溶液为氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述碱性水溶液为浓度为50％的氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述碱性水溶液与非水溶性有机溶剂的体积比为2 .5:50～20:50。

9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：六茜素与甘草次酸的反应温度为6～24℃。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：六茜素与甘草次酸的反应温度为12℃。

11.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：六茜素与甘草次酸的反应时间为0.5～8h。

12.权利要求1所述甘草次酸酯的用途，其特征在于，所述甘草次酸酯在制备抗病毒药物中的应用。

13.权利要求1所述甘草次酸酯的用途，其特征在于，所述甘草次酸酯在制备治疗鸡法氏囊病药物中的应用。