CN108267515A - 一种检测待测物中d-苦杏仁苷和/或l-苦杏仁苷含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测待测物中D‑苦杏仁苷和/或L‑苦杏仁苷含量的方法，包括使用液相色谱法检测，所述液相色谱法的检测条件包括：色谱柱为苯基色谱柱；流动相由乙腈和水构成，乙腈作为流动相A，水作为流动相B；流动相A和流动相B的体积比为1～5:95～99。该方法对D‑苦杏仁苷和L‑苦杏仁苷有较高的分离度。

Description

一种检测待测物中D-苦杏仁苷和/或L-苦杏仁苷含量的方法

技术领域

本发明属于医药化工领域，具体涉及一种检测待测物中D-苦杏仁苷和/或L-苦杏仁苷含量的方法。

背景技术

苦杏仁为蔷薇科植物山杏、西伯利亚杏、东北杏或杏的干燥成熟种子。性味苦，微温，有小毒；归肺、大肠经。具有降气止咳平喘，润肠通便之功效，多用于咳嗽气喘，胸满痰多，肠燥便秘。

根据《中华人民共和国药典》(2015年版)记载，苦杏仁药材为蔷薇科植物山杏Prunus armeniaca L.var.ansu Maxim.、西伯利亚杏Prunus sibirica L.、东北杏Prunusmandshurica(Maxim.)Koehne或杏Prunus armeniaca L.的干燥成熟种子。夏季采收成熟果实，除去果肉及核壳，取出种子，晒干。

苦杏仁苷是常见的氰苷类物质，也是传统中药苦杏仁中的有效成分，迄今已成为医药上常用的祛痰止咳剂、辅助性抗癌药物。苦杏仁中除了含有苦杏仁苷外，一般还含有β-葡萄糖苷酶。苦杏仁苷在β-葡萄糖苷酶的作用下生成葡萄糖和扁桃腈，而扁桃腈可以自发或经羟基腈裂解酶产生氢氰酸和苯甲醛。少量氢氰酸具镇静作用，可以麻痹咳嗽中枢，体现杏仁的平喘镇咳等效果；而大量的氢氰酸进入人体后则发生中毒危险。氰基易与氧化型细胞色素氧化酶分子中的Fe³⁺结合，阻断氧还电子传递，抑制呼吸酶活性，发生细胞窒息，最后导致呼吸麻痹死亡。因此苦杏仁中所含的苦杏仁苷既是其有效成分又是内源性毒性成分。

苦杏仁苷在苦杏仁药材及制剂中通常以D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷两种形式存在，由于D-苦杏仁苷、L-苦杏仁苷化学性质接近，二者的色谱行为也较为一致，D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷分别如下式I和II所示：

发明内容

发明人发现，目前《中华人民共和国药典》(2015年版)尚未区分规定D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷的含量标准，同时也尚未有很好的检测方法能够将二者成功分离。

本发明发明人惊奇地发现，使用本申请公开实施方案的方法能够快速有效地分离和检测D-苦杏仁苷和/或L-苦杏仁苷，且分离度较高。

进一步，本申请公开实施方案的方法能够对苦杏仁药材中D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷进行定量测定，能够弥补《中华人民共和国药典》(2015年版)中关于苦杏仁药材及相关制剂标准在定量苦杏仁苷时无法准确测定L-苦杏仁苷的含量的空白，可为日后有关L-苦杏仁苷科学研究提供可靠的检测方法，同时对进一步制定中成药中苦杏仁苷的安全限量标准提供依据及方法支撑。

本发明的一个目的是提供一种检测待测物中D-苦杏仁苷和/或L-苦杏仁苷含量的方法。

本发明第一方面提供一种检测待测物中D-苦杏仁苷和/或L-苦杏仁苷含量的方法，包括使用液相色谱法检测，所述液相色谱法的检测条件包括：

色谱柱为苯基色谱柱；

流动相由乙腈和水构成，乙腈作为流动相A，水作为流动相B；流动相A和流动相B的体积比为1～5:95～99。

在一个实施方案中，本发明任一项的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：检测波长为205～210nm，例如207nm。

在一个实施方案中，本发明任一项的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：流动相流速为0.8～1.2mL/min，例如1mL/min。

在一个实施方案中，本发明任一项的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：色谱柱的柱温为20～40℃，例如30℃。

在一个实施方案中，本发明任一项的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：

优选地，色谱柱长度200～300mm，例如250mm；

优选地，色谱柱的直径3～6mm，例如4.6mm；

优选地，色谱柱的填料粒径为3～10μm，例如5μm；

优选地，色谱柱的填料孔径为12nm。

在一个实施方案中，本发明任一项的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：色谱柱为YMC-Pack Ph色谱柱。

在一个实施方案中，本发明任一项的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：采用外标法定量。

在一个实施方案中，本发明任一项的方法，所述液相色谱法的液相色谱法为高效液相色谱法。

在一个实施方案中，本发明任一项的方法，D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷的色谱峰分离度大于或等于2.0。

在一个实施方案中，本发明任一项的方法，根据D-苦杏仁苷色谱峰计算的理论塔板数大于或等于7000。

在一个实施方案中，本发明任一项的方法，包括以下步骤的一步或多步：

a)对待测物进行前处理，获得样品溶液；

b)用液相色谱法检测样品溶液中D-苦杏仁苷和/或L-苦杏仁苷的含量；

c)根据样品溶液中D-苦杏仁苷和/或L-苦杏仁苷的含量，计算待测物中D-苦杏仁苷和/或L-苦杏仁苷的含量。

在一个实施方案中，本发明任一项的方法，其中，所述待测物是植物，例如植物果实，例如苦杏仁药材。

在一个实施方案中，本发明任一项的方法，包括对苦杏仁药材进行前处理的步骤，所述前处理的步骤包括以下一步或多步：

1)将苦杏仁药材粉碎、过筛，收集通过筛网的苦杏仁药材粉末；

优选地，步骤1)中，过筛为过2号筛；

2)用甲醇浸提苦杏仁药材粉末，获得提取液；

优选地，步骤2)中，每0.25g苦杏仁药材粉末用25mL甲醇浸提，

优选地，步骤2)中，在超声条件下浸提，超声的时间为20～40分钟，

优选地，步骤2)中，浸提前对含有苦杏仁药材粉末的甲醇称重，浸提后用甲醇补足损失的重量；

3)过滤提取液，取续滤液，将续滤液用甲醇水溶液稀释定容；

优选地，步骤3)中，每5mL续滤液用50％(v/v)甲醇水溶液定容至50mL；

优选地，步骤3)中，过滤定容后的溶液，取续滤液；

优选地，步骤3)中，过滤使用的滤纸是定量滤纸。

在一个实施方案中，“分离度”定义为相邻两组分色谱峰的保留时间之差与两峰底宽度之和一半的比值，即(式中t_R1、t_R2分别为组分1、2的保留时间；W₁、W₂分别为组分1、2色谱峰的峰宽。

在一个实施方案中，，术语“理论塔板数”是指色谱的柱效参数之一，用于定量表示色谱柱的分离效率。

在一个实施方案中，“理论塔板数”以n来表示，即(式中t_R为组分的保留时间；W为色谱峰的峰宽。

在一个实施方案中，理论塔板数根据D-苦杏仁苷的色谱峰计算获得。

在一个实施方案中，苯基色谱住为苯基官能团由来的π电子色谱柱。

本申请公开实施方案的有益效果

1)本申请公开实施方案的液相色谱检测方法，能够较好地分离D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷，分离度较高；

2)本申请公开实施方案的液相色谱检测方法，平衡时间短，测定速度快；

3)本申请公开实施方案的液相色谱检测方法准确度高；

4)本申请公开实施方案的液相色谱检测方法精密度高；

5)本申请公开实施方案的液相色谱检测方法重现性好；

6)本申请公开实施方案的液相色谱检测方法灵敏度高；

7)本申请公开实施方案的液相色谱检测方法，线性方程的线性较好；

8)本申请公开实施方案中对苦杏仁药材的前处理方法，该方法获得的药材样品溶液稳定性好；

9)本申请公开实施方案的液相色谱检测方法，能够为日后有关L-苦杏仁苷科学研究提供可靠的检测方法，同时对进一步制定中成药中苦杏仁苷的安全限量标准提供依据及方法支撑；

10)本申请公开实施方案的液相色谱检测方法，对日后L-苦杏仁苷标准品的分离纯化及制备具有启迪或指导的作用。

附图说明

图1为实施例1药材样品溶液的高效液相色谱图；

图2为实施例1对照样品溶液的高效液相色谱图；

图3为对比例1药材样品溶液的高效液相色谱图；

图4为对比例1对照样品溶液的高效液相色谱图。

图1～4中，色谱峰1是L-苦杏仁苷的色谱峰，色谱峰2是D-苦杏仁苷的色谱峰。

具体实施方式

下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

实施例1

在一个具体实施方案中，检测苦杏仁药材中D-苦杏仁苷和/或L-苦杏仁苷含量的方法包括以下步骤：

1、制备药材样品溶液

用苦杏仁药材制备药材样品溶液，步骤如下：

(1)将苦杏仁药材粉碎，粉末过二号筛；

(2)称取苦杏仁药材粉末，用甲醇溶解；具体地，精密称取苦杏仁药材粉末0.25克，精密加甲醇25mL溶解；

(3)在超声下提取；具体地，超声时间为30分钟，超声处理后，用甲醇补足损失重量；

(4)将提取液过滤；具体地，滤膜为定量滤纸；

(5)取续滤液，用50％(v/v)甲醇水溶液定容；具体地，精密量取续滤液5mL，用50％(v/v)甲醇水溶液定容成50mL；

(6)将上述溶液过滤，取续滤液，即为药材样品溶液；具体地，滤膜为定量滤纸；

(7)液相色谱进样前，将药材样品溶液过滤；具体地，滤膜孔径为0.22μm。

2、制备对照样品溶液

精密称取D-苦杏仁苷，L-苦杏仁苷对照品各适量，加50％(v/v)甲醇水溶液制成每1ml约含D-苦杏仁苷20μg和L-苦杏仁苷20μg的混合溶液，即得对照样品溶液。

3、制备标准溶液

取D-苦杏仁苷标准品加甲醇分别配成12.12μg/mL、24.24μg/mL、60.59μg/mL、121.18μg/mL、181.76μg/mL、242.35μg/mL和363.53μg/mL的7种标准溶液。取L-苦杏仁苷标准品加甲醇分别配成1.52μg/mL、3.03μg/mL、6.06μg/mL、12.12μg/mL、24.24μg/mL、60.59μg/mL和121.18μg/mL的7种标准溶液。

4、高效液相色谱检测

(1)检测仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪；SPD-M20A紫外检测器；Labsolutions数据处理软件系统。

(2)色谱条件：

色谱柱：具有苯基官能团由来的π电子色谱柱，即苯基色谱柱YMC-Pack Ph，长度×直径＝250mm×4.6mm，填料粒径5μm，填料孔径12nm；

流动相：乙腈为流动相A，水为流动相B，流动相A与B的体积比为5:95，流动相流速：1.0mL/min；

进样量：10μL；

检测器的检测波长为207nm。

(3)使用上述检测仪器和色谱条件，检测7种标准溶液中的D-苦杏仁苷和/或L-苦杏仁苷，以标准溶液浓度为横坐标，以D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷色谱峰面积为纵坐标进行线性回归，得到线性方程：

D-苦杏仁苷：y＝10656x-6764.4，R＝0.9998；

L-苦杏仁苷：y＝10340x-1958.5，R＝0.9999。

两个线性方程的R＝0.9998～0.9999，说明该方法呈现良好的线性。

(4)使用上述检测仪器和色谱条件，检测药材样品溶液及对照样品溶液中的D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷色谱峰，采用外标法定量，即将D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷色谱峰面积代入上述线性方程，计算药材样品溶液中D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷的含量。

图1为实施例1药材样品溶液的高效液相色谱图，图2为实施例1对照样品溶液的高效液相色谱图；图1～2中，色谱峰1是L-苦杏仁苷的色谱峰，色谱峰2是D-苦杏仁苷的色谱峰。

5、计算

根据药材样品溶液中D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷的含量计算苦杏仁药材中D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷的含量，公式如下：

苦杏仁药材中D-苦杏仁苷质量(g)＝样品溶液中D-苦杏仁苷含量(μg/mL)×50mL×稀释倍数/1000000

苦杏仁药材中L-苦杏仁苷质量(g)＝样品溶液中L-苦杏仁苷含量(μg/mL)×50mL×稀释倍数/1000000其中，稀释倍数＝初始加入甲醇体积(mL)/5mL

本实施例中稀释倍数等于5。

苦杏仁药材中D-苦杏仁苷重量百分含量(wt％)＝苦杏仁药材中D-苦杏仁苷质量(g)×100％/苦杏仁药材样品称样量(g)

苦杏仁药材中L-苦杏仁苷重量百分含量(wt％)＝苦杏仁药材中L-苦杏仁苷质量(g)×100％/苦杏仁药材样品称样量(g)

药材样品溶液和对照样品溶液中D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷含量、保留时间、峰面积、分离度和理论塔板数的结果如下表1所示：

表1

*理论塔板数根据D-苦杏仁苷的色谱峰计算获得

由表1可知，药材样品溶液中D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷的含量分别为32.70μg/mL和2.05μg/mL，对照样品溶液中D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷的含量分别为20.90μg/mL和22.81μg/mL。

由表1进一步可知，对于药材样品溶液和对照样品溶液，D-苦杏仁苷、L-苦杏仁苷二者的保留时间分别约为约23.3min和约25min，说明该实施例检测方法对D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷的平衡时间较短，检测速度较快。

由表1进一步可知，D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷的分离度都高于2，说明该实施例检测方法对D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷的分离度较高。

由表1进一步可知，该实施例检测方法的理论塔板数不低于7000。

根据表1的数据，进一步计算得到步骤1的苦杏仁药材中D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷的含量分别为3.27％和0.21％。

5、精密度实验：

分别配制浓度为24.24μg/mL的D-苦杏仁苷标准品溶液和浓度为3.03μg/mL的L-苦杏仁苷标准品溶液，按照步骤4的高效液相色谱检测方法分别检测，重复进样6次，并计算RSD。结果显示，D-苦杏仁苷标准品溶液和L-苦杏仁苷标准品溶液的RSD结果分别为0.87％和1.02％，RSD较低。精密度实验说明，实施例1的检测方法的精密度良好。

6、稳定性实验

按步骤1制备药材样品溶液后，在不同时间段分别测定5次，即分别在起始(刚制备完成)、6h后、12h后、24h后和36h后的时间点将10μL样品注入高效液相色谱中，按照步骤4的高效液相色谱方法测定D-苦杏仁苷色谱峰面积和L-苦杏仁苷色谱峰面积，计算5次测定二者色谱峰面积的RSD分别为1.85％和1.24％，RSD较低。稳定性实验结果表明，实施例1的步骤1制备的药材样品溶液在36小时内稳定。

7、重现性实验

按照步骤1的方法，用苦杏仁药材制备6份药材样品溶液，并按步骤4的高效液相色谱检测方法检测6份药材样品溶液中D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷的含量，计算二者6个测量值的RSD为1.92％和1.46％。重现性实验结果表明，实施例1的检测方法的重现性良好。

8、加样回收率实验

按照步骤1的方法，称取苦杏仁药材各0.12g制备成6份药材样品溶液，进一步，在6份药材样品溶液中分别加入D-苦杏仁苷3.9mg和L-苦杏仁苷0.25mg，得到6份加样溶液。按步骤4的高效液相色谱检测方法分别检测6份加样溶液中D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷的含量，并按下式计算加样回收率，并计算RSD。

加样回收率＝(加标品苦杏仁苷含量-样品苦杏仁苷含量)/标准品加入量×100％

结果显示D-苦杏仁苷的加样回收率的平均值为98.86％，RSD为0.64％；L-苦杏仁苷的加样回收率的平均值为97.33％，RSD为0.87％。加样回收率接近100％，且RSD较低，说明实施例1检测方法的准确度较高。

综上，实施例1的检测方法能够快速，准确地对苦杏仁药材中的D-苦杏仁苷、L-苦杏仁苷进行定量检测，该检测方法具有选自：分离度好、平衡时间短、测定速度快、准确度、精密度、灵敏度和分离度较高的优点。

对比例1

对比例1的高效液相色谱检测方法如下：

检测仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪；SPD-M20A紫外检测器；Labsolutions数据处理软件系统。

色谱条件：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，即C₁₈色谱柱(YMC-Pack ODS-A，长度×直径＝250×4.6mm，填料粒径5μm，填料孔径12nm)；

流动相：乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为8：92；检测波长207nm；

流速为1.0mL/min；

进样量：10μl。

参照实施例1的方法获得药材样品溶液和对照样品溶液，用对比例1的高效液相色谱检测方法检测，外标法定量。图3为对比例1药材样品溶液的高效液相色谱图，图4为对比例1对照样品溶液的高效液相色谱图，图3～4中，色谱峰1是L-苦杏仁苷的色谱峰，色谱峰2是D-苦杏仁苷的色谱峰。

高效液相色谱检测结果如表2所示：

表2

*理论塔板数根据D-苦杏仁苷的色谱峰计算获得

由表2可知，对比例1的检测方法对L-苦杏仁苷和D-苦杏仁苷的分离度较低，均小于2。

最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (13)

1.一种检测待测物中D-苦杏仁苷和/或L-苦杏仁苷含量的方法，包括使用液相色谱法检测，所述液相色谱法的检测条件包括：

色谱柱为苯基色谱柱；

流动相由乙腈和水构成，乙腈作为流动相A，水作为流动相B；流动相A和流动相B的体积比为1～5:95～99。

2.根据权利要求1所述的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：检测波长为205～210nm，例如207nm。

3.根据权利要求1所述的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：流动相流速为0.8～1.2mL/min，例如1mL/min。

4.根据权利要求1所述的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：色谱柱的柱温为20～40℃，例如30℃。

5.根据权利要求1所述的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：

优选地，色谱柱长度200～300mm，例如250mm；

优选地，色谱柱的直径3～6mm，例如4.6mm；

优选地，色谱柱的填料粒径为3～10μm，例如5μm；

优选地，色谱柱的填料孔径为12nm。

6.根据权利要求1所述的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：色谱柱为YMC-PackPh色谱柱。

7.根据权利要求1所述的方法，所述液相色谱法的检测条件包括：采用外标法定量。

8.根据权利要求1所述的方法，所述液相色谱法的液相色谱法为高效液相色谱法。

9.根据权利要求1所述的方法，D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷的色谱峰分离度大于或等于2.0。

10.根据权利要求1所述的方法，根据D-苦杏仁苷色谱峰计算的理论塔板数大于或等于7000。

11.根据权利要求1所述的方法，包括以下步骤的一步或多步：

a)对待测物进行前处理，获得样品溶液；

b)用液相色谱法检测样品溶液中D-苦杏仁苷和/或L-苦杏仁苷的含量；

c)根据样品溶液中D-苦杏仁苷和/或L-苦杏仁苷的含量，计算待测物中D-苦杏仁苷和/或L-苦杏仁苷的含量。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述待测物是植物，例如苦杏仁药材。

13.根据权利要求12所述的方法，包括对苦杏仁药材进行前处理的步骤，所述前处理的步骤包括以下一步或多步：

1)将苦杏仁药材粉碎、过筛，收集通过筛网的苦杏仁药材粉末；

优选地，步骤1)中，过筛为过2号筛；

2)用甲醇浸提苦杏仁药材粉末，获得提取液；

优选地，步骤2)中，每0.25g苦杏仁药材粉末用25mL甲醇浸提，

优选地，步骤2)中，在超声条件下浸提，超声的时间为20～40分钟，

优选地，步骤2)中，浸提前对含有苦杏仁药材粉末的甲醇称重，浸提后用甲醇补足损失的重量；

3)过滤提取液，取续滤液，将续滤液用甲醇水溶液稀释定容；

优选地，步骤3)中，每5mL续滤液用50％(v/v)甲醇水溶液定容至50mL；

优选地，步骤3)中，过滤定容后的溶液，取续滤液；

优选地，步骤3)中，过滤使用的滤纸是定量滤纸。