CN108264502A - 喹啉咔唑类荧光染料及其制法和应用 - Google Patents

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Abstract

喹啉咔唑类荧光染料及其制法和应用，所述的荧光染料具有结构通式I，其中，所述的Y‑选自卤素负离子，即I‑、Cl‑和Br‑，尤其优选I‑。本发明所提供的喹啉咔唑类荧光染料是一类双光子荧光染料，对PBS缓冲溶液和活细胞中的mtDNA具有高效且专一的识别能力，并具备较高的光稳定性和较低的生物毒性。另外，该类化合物制备路线简单，易于产业应用。

Description

喹啉咔唑类荧光染料及其制法和应用
技术领域
本发明涉及一种mtDNA特异性识别的双光子荧光探针及其制备和应用方法，属于精细化工领域。
背景技术
人线粒体基因组(mtDNA)是人类基因组首先被测序的重要组成部分，它包括16569个碱基对，为双链闭环结构。其中，mtDNA编码的酶和蛋白质与其他核DNA编码的蛋白质一起，组成完整的电子传递链，完成细胞呼吸功能，为细胞提供能量。由于mtDNA无内含子结构，缺乏组蛋白的保护，暴露在高活性氧的环境中时，其突变率与核DNA相比，高达10倍以上。众多研究表明，mtDNA的突变与众多疾病相关，包括卡恩斯赛尔综合征、莱波氏世袭视神经病变、慢性进行性外眼肌瘫痪等。因此，实时追踪检测mtDNA的损伤具有重大的意义。
荧光探针由于可以对生物分子直接量化，具有直观可视化的动态信息等优点，已经成为生物传感和生物成像领域不可或缺的工具。目前，已有众多研究用于细胞内核酸成像。然而绝大多数的研究与核DNA有关，对mtDNA的研究则相对较少。通常，mtDNA的检测方法主要有PCR和荧光原位成像，由于其较低的杂交程度和较差的重现性，因此应用方面受到限制。
双光子显微镜采用长波长的激光作为双光子激发光源，由于可以有效地避免生物体自发荧光造成的背景干扰，而被广泛应用于细胞和组织成像中。咔唑具有良好的光学性质和较大的双光子吸收截面，可以很好地应用于双光子成像。
发明内容
本发明目的在于针对现有的mtDNA识别染料存在光稳定性差、毒性较高及专一性较差的缺点，提出一种以甲基化喹啉为mtDNA识别基团，以咔唑为荧光母体的双光子荧光染料。
为实现上述目的，本发明首先提供一种具有如下结构通式I的喹啉咔唑类荧光染料：
其中，所述的Y-选自卤素负离子。
进一步地，本发明提供上述喹啉咔唑类荧光染料的制备方法，包括如下步骤：
(1)咔唑与碘甲烷按照摩尔比1:1-5反应，制备式II的化合物，反应温度为25-30℃，反应时间为0.5-2小时，反应溶剂为无水DMF或无水甲苯；
(2)式II的化合物与POCl3按照摩尔比1:1-5反应，制备式III的化合物，反应温度为80-100℃，反应时间为4-10小时，反应溶剂为无水DMF、无水甲苯、DMSO中的一种或多种；
(3)式III的化合物与N-溴代丁二酰亚胺(NBS)按照摩尔比为1:1-3反应，制备式IV的化合物，反应温度为25-30℃，反应时间为24-36小时，反应溶剂为乙酸与二氯甲烷或氯仿的混合溶剂；
(4)催化剂存在条件下，式IV的化合物与乙烯基吡啶按照摩尔比1:1-1.2在密闭容器中，于100-110℃条件下反应3-5天，制备式V的化合物，反应溶剂选自三乙胺、四氢呋喃或其混合物，所述的催化剂为醋酸钯。
(5)2-甲基喹啉与CH3Y按摩尔比1:5-10反应，制备式VI的化合物，反应温度65-110℃，反应时间24-36小时，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、甲苯中的一种或多种；
(6)式V的化合物与式VI的化合物按摩尔比1:1-1.2于60-115℃条件下反应制备通式I的化合物，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、甲苯中的一种或多种。
本发明所提供的喹啉咔唑类荧光染料是一类双光子荧光染料，对mtDNA具有高效且专一的识别能力，并且具备较高的光稳定性和较低的生物毒性。能够对PBS缓冲溶液和活细胞中的mtDNA具有特异性响应和成像的双光子荧光探针。
基于此，本发明另一方面提供所述的喹啉咔唑类荧光染料在mtDNA特异性识别和标记中的应用，尤其适用于活细胞中mtDNA的实时追踪成像。
本发明中的喹啉咔唑类荧光染料与本领域其它现有技术相比，具有如下显著的优势：1)分子合成路线简单、稳定性好，具有良好的细胞膜通透性和双光子特性，并且在生物组织中的穿透能力较强。2)对PBS缓冲溶液(10.0mM,pH＝7.4)和活细胞中的mtDNA具有良好的选择性，并且不受其它常见氨基酸和蛋白质等干扰物的影响。3)在缓冲溶液中响应速度快，响应时间仅为20s，并且可以对活细胞中mtDNA的形态变化进行实时监测。
附图说明
本发明附图7幅：
图1为PBS缓冲溶液(10.0mM,pH＝7.4)中，探针CNQ(5.0μM)对mtDNA(0-130.0μg/mL)的荧光滴定图；
图2为CNQ的荧光强度与小浓度mtDNA(0.42-2.5μg/mL)的线性关系图；
图3为CNQ与mtDNA反应时间曲线图；
图4为在不同的氨基酸(Ala,Ile,Lys,Trp,His,Tyr,Asn,Asp,Gly,GSH,Pro,Phe和Val)、蛋白质(HSA和BSA)和Yeast RNA都存在时，CNQ对mtDNA的选择性图。
图5为商业化双链DNA染料Picogreen与双光子荧光染料CNQ在MCF-7细胞中的复染图：图5a为双链DNA染料Picogreen在MCF-7细胞中荧光成像，接收范围为510-540nm；图5b是探针分子CNQ在MCF-7细胞中荧光成像图，接收范围为600-640nm；图5c为明场图；图5d为Picogreen与CNQ的复染叠加图；图5e和5f分别为图5细胞中横线部分1和2处所对应的两个通道荧光强度对比图。
图6为商业化荧光染料Mito-Tracker Green与双光子荧光染料CNQ的复染图：图6a为Mito-Tracker Green在MCF-7细胞中荧光成像图，图6b为探针分子CNQ在MCF-7细胞中荧光成像图，图6c为Mito-Tracker Green和CNQ的复染叠加图，图6d为明场图，图6e为Mito-Tracker Green和CNQ的复染系数图，图6f、6g和6h为图6细胞中横线1、2和3所示区域荧光强度图。
图7为双光子荧光染料CNQ对阿霉素诱导损伤的mtDNA的实时追踪和成像：图7a、7b、7c和7d分别为阿霉素浓度为0、2.0、5.0、和10.0μM的条件下孵育MCF-7细胞4小时后探针分子CNQ的荧光成像图，图7e、7f、7g和7h分别为7a、7b、7c和7d的放大。
具体实施方式
本发明中，所述的喹啉咔唑类荧光染料，具有如下结构通式I：
其中，所述的Y-选自卤素负离子。具体地，所述Y-可举例选自但不限于I-、Cl-和Br-。作为举例的代表性优选化合物在Y-为I-时获得，为化合物CNQ，具有如下结构式：
该探针分子CNQ在与mtDNA结合后，其荧光强度有较大的提升，而且可以对活细胞中mtDNA的损伤进行实时追踪成像，以达到在生理环境中、温和条件下、高选择性、检测方便的目的。
化合物CNQ的合成路线如下所示:
化合物CNQ的制备方法包括如下步骤：
a)以化合物1和碘甲烷为原料，制备化合物2，反应溶剂为无水DMF或甲苯，反应时间为1-2小时，反应温度为25-30℃；
b)化合物2与三氯氧磷在DMF溶液中反应，从而制备化合物3，反应溶剂为DMF或无水甲苯，反应温度80-100℃，反应时间为4-10小时；
c)化合物3与N-溴代丁二酰亚胺(NBS)反应，制备化合物4，反应溶剂为氯仿和乙酸的混合溶剂，反应温度为25-30℃，反应时间为24-36小时；
d)化合物4与乙烯基吡啶反应制备化合物5，反应溶剂为三乙胺和四氢呋喃混合溶剂，密闭反应釜中100-110℃下，反应时间为3-4天；
e)2-甲基喹啉与CH3I按照摩尔比1:5-10反应，制备甲基化的2-甲基喹啉化合物，反应温度为65-110℃，反应时间为24-36小时；
f)化合物5与甲基化的2-甲基喹啉化合物反应制备终产物CNQ，反应溶剂为甲醇或乙醇，回流条件下N2保护反应4-10小时。
以本发明所述的化合物进行检测时，其具体检测条件可根据现有技术的指导摸索确定。以探针分子CNQ为例，其在缓冲溶液中，进行标记和检测可以采用下述方法：
(1)将探针分子CNQ用DMSO溶解，制备储备液(1.0mM)，取储备液加入到PBS(10.0mM,pH＝7.4)缓冲溶液中，所加入的探针浓度为5.0μM；
(2)向缓冲溶液中逐渐加入mtDNA，使其浓度为(0-130.0μg/mL)，反应时间较为迅速，仅为20s，反应体系的温度为室温25℃；
(3)测得探针分子CNQ在加入mtDNA前后的荧光有较大的增强，其激发波长为480nm，发射波长为620nm，具有较大的Stokes位移；
(4)在一定的mtDNA的浓度范围内(0.42-2.5μg/mL)，CNQ探针分子的荧光强度和mtDNA的浓度成线性关系，其线性方程为：F＝0.07CmtDNA-0.02，相关系数R2＝0.993，检出限为55.1μg/mL。
下述非限制性实例用于对本发明做进一步的说明，不应当理解为对本发明内容任意形式的限定。
实施例1.化合物CNQ的合成
化合物CNQ的合成遵循下述合成路线：
步骤a，将0.84g的化合物1溶于10mL的无水DMF中，剧烈搅拌下，逐渐加入0.25g的NaH固体，于20分钟内加入完全，并于室温下搅拌半小时。待反应完全后，向反应体系中逐滴加入碘甲烷(0.72g)，反应三小时后，将反应液倒入200mL水中，析出米白色的固体，过滤。色谱柱分离(硅胶200-300目，石油醚:二氯甲烷＝100:1，v/v)得到无色针状晶体化合物2(661mg，反应产率：73％)。1H NMR(400MHz,acetone-d6)δ:8.12(d,J＝7.8Hz,1H),7.57-7.38(m,2H),7.25-7.13(m,1H),3.87(s,2H)；13C NMR(400MHz,acetone-d6)δ:28.3,108.7,118.7,120.0,122.6,125.6,141.1ppm。
步骤b，冰浴中，氮气保护下，向溶解有905mg化合物2的无水DMF(5mL)中缓慢滴加入三氯氧磷(0.9mL)，并剧烈搅拌0.5小时。然后将反应温度加热至80℃并保持4小时。待反应完全后，将棕褐色的反应液倒入醋酸钠溶液中，并用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋蒸，色谱柱分离(硅胶200-300目，石油醚：乙酸乙酯＝70:1，v/v)后得到淡黄色粉末3(710mg，产率为78％)1H NMR(400MHz,CD3OD)δ9.91(s,1H),8.45(s,1H),8.06(d,J＝7.8Hz,1H),7.90(d,J＝8.5Hz,1H),7.54-7.38(m,3H),7.25(t,J＝7.3Hz,1H),5.48(s,1H),3.76(s,3H)；13C NMR(400MHz,CD3OD)δ:27.8,104.2,107.8,108.3,118.1,118.6,119.6,124.1,125.5,126.5,128.6,141.0,192.5ppm.
步骤c，向含有化合物3(1.05g)混合溶剂氯仿(30mL)和乙酸(30mL)中加入980mg的NBS，并在室温下搅拌1天。减压蒸馏除去溶剂，将残留的固体色谱柱分离(硅胶200-300目，二氯甲烷：甲醇＝250:1，v/v)得到土黄色固体4(1.15g，80％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.08(s,1H),8.50(d,J＝0.7Hz,1H),8.21(d,J＝1.7Hz,1H),8.03(dd,J＝8.5,1.3Hz,1H),7.65-7.57(m,1H),7.45(d,J＝8.6Hz,1H),7.30(d,J＝8.6Hz,1H),3.85(s,3H).13C NMR(400MHz,CDCl3)δ:29.71,109.23,110.75,113.45,122.06,123.57,124.34,127.75,129.1,129.64,140.48,144.8,191.71ppm.TOF MS:m/z calculated for C14H11BrNO+[M+H]+:288.0019,found:288.0020.
步骤d，将860mg的化合物4,70mg的醋酸钯，三(邻甲基苯基)磷(300mg)的混合物加入到高压反应釜中，并加入混合溶剂三乙胺(10mL)和四氢呋喃(30mL)。密闭条件下，108℃中反应3天。待反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，色谱柱分离(硅胶200-300目，二氯甲烷：甲醇＝100:1，v/v)得到玉米黄色粉末即为化合物5(515mg，55％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.11(s,1H),8.63-8.56(m,3H),8.28(s,1H),8.03(dd,J＝8.5,1.2Hz,1H),7.74(d,J＝8.5Hz,1H),7.45(ddd,J＝20.9,14.3,9.0Hz,5H),7.09(s,1H),7.05(s,1H),3.88(d,J＝8.8Hz,3H).13C NMR:(400MHz,CDCl3)δ:29.79,109.27,109.73,119.73,123.16,123.6,123.99,124.42,126.15,127.89,129.08,129.2,133.81,140.53,142.2,145.14,150.31ppm。
步骤e，向溶解有化合物5(50mg)的甲醇溶剂中加入甲基化的2-甲基喹啉(63mg)，并滴加入4滴哌啶作为催化剂。反应体系在回流条件下氮气保护中反应4小时。反应温度降至室温后，过滤得到红色固体，色谱柱分离(硅胶200-300目，二氯甲烷：甲醇＝20:1，v/v)得到砖红色粉末(23mg，20％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.00(d,J＝8.9Hz,1H),8.91(s,1H),8.71-8.42(m,6H),8.32(d,J＝7.8Hz,1H),8.16(dd,J＝13.2,8.2Hz,2H),8.03-7.84(m,3H),7.84-7.66(m,3H),7.60(d,J＝5.7Hz,2H),7.32(d,J＝16.4Hz,1H),4.61(s,3H),3.97(s,3H)；13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:29.51,48.48,110.25,110.37,115.66,119.12,119.43,120.60,122.29,122.44,122.69,123.69,126.03,126.43,127.33,128.19,128.43,128.58,129.92,133.78,134.53,139.15,141.56,143.09,143.17,144.70,148.87,149.95,156.29。
实施例2
化合物CNQ特异性检测PBS缓冲溶液中mtDNA的试验
将CNQ用二甲基亚砜溶解，制备储备液(1.0mg/L)。取少量的储备液，加入到PBS缓冲溶液中，使得化合物CNQ的测试浓度为5μM。在紫外吸收光谱仪上测定CNQ的最大吸收在480nm。以最大吸收波长480nm为激发波长，测得最大发射波长为620nm，荧光光谱接收范围为525-800nm的荧光。(详见图1)，CNQ的荧光强度随着mtDNA浓度的增加而逐渐增大；而且CNQ的荧光强度与小浓度范围内的mtDNA(0.42-2.5μg/mL)成良好的线性关系(详见图2)，其线性方程为：F＝0.07CmtDNA-0.02，相关系数R2＝0.993，检出限为55.1μg/mL；在mtDNA存在的缓冲溶液中，CNQ对其在很短的时间(20s)内就可以响应(图3)；在不同的氨基酸(Ala,Ile,Lys,Trp,His,Tyr,Asn,Asp,Gly,GSH,Pro,Phe和Val)、蛋白质(HSA和BSA)和Yeast RNA都存在时，CNQ对mtDNA的选择性依然很好(图4)，说明该双光子荧光探针CNQ对mtDNA的特异性选择几乎不受常见氨基酸和蛋白质的干扰。
实施例3
化合物CNQ在人乳腺癌细胞(MCF-7)中特异性标记mtDNA的试验
MCF-7细胞用于荧光成像：将复苏的MCF-7细胞置于细胞培养瓶中，加入约6mL的DMEM培养基(含有10％的胎牛血清和1％的青霉素-链霉素溶液)，并置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，并观察细胞状态。待细胞状态良好并且铺满整个瓶底时，加入1mL的胰蛋白酶消化。将消化后的细胞接种于细胞培养皿中，并加入2mL的培养基继续培养。待细胞铺满瓶底约50％时，弃去原有培养基，并用PBS清洗2～3次，并分别加入CNQ(1μM)和商业化双链DNA染料Picogreen(500nM)复染，激发波长为488nm，接收波段分别为600～640nm和510～540nm，结果如图5所示。在该图中两种染料在细胞质中的复染程度较高(白色较亮的区域)，图5a为双链DNA染料Picogreen在MCF-7细胞中荧光成像，接收范围为510-540nm；图5b是探针分子CNQ在MCF-7细胞中荧光成像图，接收范围为600-640nm；图5c为明场图；图5d为Picogreen与CNQ的复染叠加图；图5e和5f分别为图5细胞中横线部分1和2处所对应的两个通道荧光强度对比图，充分说明CNQ在活细胞中可以选择性染色细胞质中的双链DNA。
进一步地，图6显示了CNQ和商业化线粒体染料(Mito-Tracker Green)复染的结果。结果表明，荧光染料CNQ与线粒体复染的皮尔森系数为0.96(白色较亮的区域为复染部分)，图6a为Mito-Tracker Green在MCF-7细胞中荧光成像图，图6b为探针分子CNQ在MCF-7细胞中荧光成像图，图6c为Mito-Tracker Green和CNQ的复染叠加图，图6d为明场图，图6e为Mito-Tracker Green和CNQ的复染系数图，图6f、6g和6h为图6细胞中横线1、2和3所示区域荧光强度图。以上实验结果充分说明荧光探针分子CNQ可以特异性的对线粒体的DNA进行选择性染色。
进一步地，将不同浓度的阿霉素分别加入到MCF-7细胞中，用来限制DNA的合成，其加入浓度分别为0、2.0、5.0和10.0μΜ，在37℃细胞培养箱中孵育4小时。移去培养基，用PBS清洗2～3次。分别用CNQ(1.0μM)进行染色，孵育半小时后，用PBS清洗，并在双光子荧光显微镜下观察，激发波长为850nm，接收波段为600～640nm。结果如图7所示。图7a、7b、7c和7d分别为阿霉素浓度为0、2.0、5.0、和10.0μM的条件下孵育MCF-7细胞4小时后探针分子CNQ的荧光成像图，图7e、7f、7g和7h分别为7a、7b、7c和7d的放大。从该实验结果可知，与对照组相比，加入阿霉素对细胞质中DNA的合成起到了很大的抑制作用。随着阿霉素浓度的增加，线粒体中DNA的形态会发生先浓缩成点状，后聚集的现象，说明该双光子荧光染料CNQ可以对线粒体中的DNA随着外界药物刺激下的形态变化进行实时监测。

Claims (5)

1.喹啉咔唑类荧光染料，具有如下结构通式I：
其中，所述的Y-选自卤素负离子。
2.根据权利要求1所述的喹啉咔唑类荧光染料，其特征在于，所述的Y-选自I-、Cl-和Br-。
3.权利要求1所述的喹啉咔唑类荧光染料的制备方法，包括如下步骤：
(1)咔唑与碘甲烷按照摩尔比1:1-5反应，制备式II的化合物，反应温度为25-30℃，反应时间为0.5-2小时，反应溶剂为无水DMF或无水甲苯；
(2)式II的化合物与POCl3按照摩尔比1:1-5反应，制备式III的化合物，反应温度为80-100℃，反应时间为4-10小时，反应溶剂为无水DMF、无水甲苯、DMSO中的一种或多种；
(3)式III的化合物与N-溴代丁二酰亚胺(NBS)按照摩尔比为1:1-3反应，制备式IV的化合物，反应温度为25-30℃，反应时间为24-36小时，反应溶剂为乙酸与二氯甲烷或氯仿的混合溶剂；
(4)催化剂存在条件下，式IV的化合物与乙烯基吡啶按照摩尔比1:1-1.2在密闭容器中，于100-110℃条件下反应3-5天，制备式V的化合物，反应溶剂选自三乙胺、四氢呋喃或其混合物，所述的催化剂为醋酸钯。
(5)2-甲基喹啉与CH3Y按摩尔比1:5-10反应，制备式VI的化合物，反应温度65-110℃，反应时间24-36小时，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、甲苯中的一种或多种；
(6)式V的化合物与式VI的化合物按摩尔比1:1-1.2于60-115℃条件下反应制备通式I的化合物，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、甲苯中的一种或多种。
4.权利要求1所述的喹啉咔唑类荧光染料在制备mtDNA特异性识别和标记试剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的mtDNA特异性识别和标记试剂用于细胞mtDNA的成像和/或活细胞中mtDNA的实时追踪成像。
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