CN108245711A - 一种胶原复合型45s5生物活性玻璃及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胶原复合型45S5生物活性玻璃材料及其制备方法和应用，该材料包括20～50wt％的Ⅰ型胶原纤维丝和50～80wt％的45S5生物活性玻璃，其中，所述Ⅰ型胶原纤维丝为胶原丰富的动物原材料经过清洗、酸解、酶解和再清洗后获得的无细胞胶原框架，再切割和研磨制得。本发明的胶原复合型45S5生物活性玻璃因为具有生物活性玻璃优良的成骨活性和胶原优良的生物学性能而获得良好的骨组织修复效果，胶原基质在可塑性45S5生物活性玻璃材料上黏附并有较好的伸展，形成了比较明显的细胞突触，细胞与支架结合牢固；其次支架的降解速度应当与骨再生速度相匹配；最后该支架孔隙率可达60～80％以上。

Description

一种胶原复合型45S5生物活性玻璃及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物活性玻璃领域，特别是指一种胶原复合型45S5生物活性玻璃及其制备方法。
背景技术
理想的植骨材料应该具备以下特点：良好的生物相容性、生物可降解性、骨传导性、骨激发性、较高的孔隙率合适的孔径范围、临床使用方便、足够的力学强度及合适的弹性模量。生物活性玻璃(Bioglass)由于其良好的生物相容性、良好的骨传导和骨激发作用而被材料学者所关注。
45S5生物活性玻璃制取：熔融法和溶胶-凝胶法两种不同制备方法制备的生物活性玻璃自开发以来，各国研究人员对其进行了广泛而深入的研究。在1969年至1979年间，Hench等人用熔融法制备的生物活性玻璃45S5在鼠的股骨、胫骨、牙槽骨以及犬科动物和灵长类动物的股骨和颌骨上进行了系统性的实验研究，对生物活性玻璃基体与骨组织界面的链接机理、结合强度、玻璃基体的表面化学反应及生物活性进了实验分析，总体的实验结果表面生物活性玻璃基体与骨组织发生了稳定的有效结合。
45S5生物活性玻璃由45wt％的SiO2结合24.5wt％的Na2O、24.5wt％的CaO和6wt％的P2O5组成，在生理环境中具有快速反应性能，玻璃表面发生适当的化学改变，形成硅胶层和富钙磷层，可诱导生成羟基磷灰石层。硅酸盐能提高成骨细胞和成纤维细胞产生I型胶原的能力，且对成骨细胞的活力没有负面影响。无机磷酸盐是成骨细胞和软骨细胞的生理调节因子，可诱导骨骼细胞的凋亡、增量调节骨桥蛋白的表达、促进成骨细胞的增值和分化。
生物活性玻璃的机械强度较低，脆性大，尤其是其抗弯强度差。生物玻璃只提供无机羟基磷灰石的原料，胶原是依靠诱导由体内生成。
胶原分为Ⅰ、Ⅱ胶原，其中Ⅰ胶原作为人体骨组织的主要结构蛋白，同时亦为细胞外的主要基质蛋白，具有良好的生物相容性、细胞相容性、可降解性，为细胞的生长提供了良好的环境，是骨组织修复和组织工程支架应用的优良材料。
Ⅰ胶原分为可溶性胶原和不溶性胶原。不溶性的定义是相对的，其不溶的原因与细胞间质成分的相互作用有关。从分子水平已经证实，可溶性胶原是一种弱抗原性材料。胶原的主要抗原位点位于分子的N末端和C末端区域。这两个肽端具有很大的种属差异性，起到主要免疫作用。当提取胶原时这两个区域被选择性地水解或去除而失活，仅在分子体的三股螺旋结构内部保留微弱的抗原性，且不足以引起明显的排斥反应，从而大大降低了胶原的抗原性。
交联在组织成熟过程中进行，在酶的作用下赖氨酰或羟脯氨酰转变为相应的醛，然后与醛亚氨或羟基形成Schiff碱或醛亚氨型化合物，这种反应自发产生。
发明内容
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题，就是提出一种胶原复合型45S5生物活性玻璃及其制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种胶原复合型45S5生物活性玻璃，包括重量百分比的如下组分：
20～50％的Ⅰ型胶原纤维丝和50～80％的45S5生物活性玻璃，其中，所述Ⅰ型胶原纤维丝为胶原丰富的动物原材料经过清洗、酸解、酶解和再清洗后获得的无细胞胶原框架，再切割和研磨制得；45S5生物活性玻璃采用熔融法制备，其颗粒直径为80-750μm，45S5生物活性玻璃须进行活性测试表明其具有生物活性。
生物活性玻璃的制备方法通常包括熔融法和溶胶凝胶法。熔融法是通过1300℃以上的高温将原料熔化后放入特定形状的模具制得相应的结构，或者将热熔料用常温水冷却降温，得到玻璃态原料，然后通过机械研磨得到特定粒径范围的精细粉体。溶胶凝胶法是在常温下通过化学合成的方法制备而成，这种制备方法不依赖于碳酸钠的含量，可制备三元成分和多孔结构的生物活性玻璃。在1969年至1979年间，Hench等人就采用熔融法制备生物活性玻璃45S5，从临床应用和商业化角度来说，熔融法制备的45S5型生物活性玻璃可以大规模生产、成本相对较低，已经广泛地应用于临床治疗，包括脊柱融合修复、骨缺损修复、牙槽骨修复、牙齿过敏、植入材料涂层等，也是目前使用范围最广的、科学研究最全面的一种生物活性玻璃。本发明的45S5生物活性玻璃采用熔融法制得，45S5型生物活性玻璃原料直径为80-750μm。
作为优选地，所述Ⅰ型胶原纤维丝的提取具体包括如下步骤：
a、在偏光显微镜进行监控的情况下，选择健康动物的胶原纤维量多的组织作为原材料，优选为皮肤组织、肌腱组织、软骨组织、骨组织中的一种或多种；常温下用酸溶液浸泡24～120小时，酸溶液为盐酸或醋酸，且酸溶液的当量浓度为1～3N，以破坏细胞的结构并溶解细胞外可溶性成分；
b、将待用的原材料取出，水清洗除酸，浸泡于浓度为5～15％蛋白酶溶液，优选为胃肠道的消化酶溶液中进行酶解处理；期间用切片刀切下一小片组织(厚度大致为100～200μm)，经脱水、透明等步骤，在偏光显微镜下观察，检查是否原材料已无细胞。
c、将原材料取出清洗，即获得无细胞胶原框架，然后将无细胞胶原框架切割成0.05～0.5cm大小的组织块；
d、将组织块研磨成直径为10～50μm，长度为300～500μm的胶原纤维丝。
本发明中可溶性胶原的提取方法完全不同于现有的可溶性Ⅰ型胶原提取工艺，本发明的制取原料来源广泛，产率可达80％以上。采用酸解破坏了细胞的结构和溶解了细胞外可溶性成分，酶促反应消除种属特异性，制取无细胞Ⅰ型胶原框架，不需要添加交联剂。
一种胶原复合型45S5生物活性玻璃的制备方法，包括如下步骤：
S1、制备Ⅰ型胶原纤维丝
a、在偏光显微镜的监控下，选择健康动物的胶原纤维量多的组织作为原材料，常温下用当量浓度为1～3N的酸溶液浸泡24～120小时，以破坏细胞的结构并溶解细胞外可溶性成分；
b、将待用的原材料取出，水清洗除酸，浸泡于浓度为5～15％的蛋白酶溶液----，中进行酶解处理10～20小时，以软化原材料的组织结构；期间用切片刀切下一小片厚度为100～200μm的组织，经脱水、透明步骤，在偏光显微镜下观察，检查是否原材料已无细胞；
c、将原材料取出清洗，即获得无细胞胶原框架，然后将无细胞胶原框架切割成0.05～0.5cm大小的组织块；
d、将组织块研磨成直径为10～50μm，长度为300～500μm的胶原纤维丝；
S2、采用熔融法制备45S5生物活性玻璃，其颗粒直径为80-750μm，其必须进行活性测试表明其具有生物活性。
S3、Ⅰ型胶原纤维丝与45S5生物活性玻璃混合
将Ⅰ型胶原纤维丝与45S5生物活性玻璃按照20～50％和50～80％的质量比例添加混合，45～60℃的温度条件下处理10～60分钟，并在0～3500r/min的频率下搅拌1～6小时；
S4、冷冻干燥
在-30～-60℃的低温条件下处理10～50分钟，然后经-30～-45℃的低温条件下冷冻2～12小时干燥处理即得。
作为优选地，所述步骤S3的处理过程中pH值为5.8～8.0。
本发明还提出了上述胶原复合型45S5生物活性玻璃在骨组织修复和组织工程支架中作为植骨材料的应用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
本发明的胶原复合型45S5生物活性玻璃因为具有生物活性玻璃优良的成骨活性和胶原优良的生物学性能而获得良好的骨组织修复效果，胶原基质在可塑性45S5生物活性玻璃材料上黏附并有较好的伸展，形成了比较明显的细胞突触，细胞(宿主成骨细胞)与支架(胶原复合型45S5生物活性玻璃)结合牢固；其次支架的降解速度应当与骨再生速度相匹配；最后该支架孔隙率可达60～80％以上。胶原复合型45S5生物活性玻璃可塑性良好，有利于宿主成骨细胞及各种生长因子、体液和血液浸入。
附图说明
图1为反应前本发明的45S5生物活性玻璃原料红外反射光谱；
图2为20小时反应后本发明的45S5生物活性玻璃的原料红外反射光谱；图中，HA双峰为羟基磷灰石，表明生物活性，双峰波数分别为602cm-1和564cm-1；
图3为偏光显微镜下猪正常皮肤呈密集的编织结构，A、B分别为40倍和100倍正交偏光镜下状态图；
图4为100倍偏光显微镜下猪皮肤胶原丝提取过程图，A为猪皮肤胶原交叉编织结构(中间产物)；B为Ⅰ型胶原纤维丝产品状态图。
具体实施方式
为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进一步的说明。
一种胶原复合型45S5生物活性玻璃的制备方法，包括如下步骤：
S1、制备Ⅰ型胶原纤维丝
a、在偏光显微镜的监控下，选择健康动物的胶原纤维量多的组织作为原材料，常温下用当量浓度为1～3N的酸溶液浸泡24～120小时，以破坏细胞的结构并溶解细胞外可溶性成分；
b、将待用的原材料取出，水清洗除酸，浸泡于浓度为5～15％的蛋白酶溶液中进行酶解处理10～20小时，以软化原材料的组织结构；期间用切片刀切下一小片厚度为100～200μm的组织，经脱水、透明步骤，在偏光显微镜下观察，检查是否原材料已无细胞；
c、将原材料取出清洗，即获得无细胞胶原框架，然后将无细胞胶原框架切割成0.05～0.5cm大小的组织块；
d、将组织块研磨成直径为10～50μm，长度为300～500μm的胶原纤维丝；
S2、采用熔融法制备45S5生物活性玻璃，其颗粒直径为80-750μm，其必须进行活性测试表明其具有生物活性。
S3、Ⅰ型胶原纤维丝与45S5生物活性玻璃混合
将Ⅰ型胶原纤维丝与45S5生物活性玻璃按照20～50％和50～80％的质量比例添加混合，45～60℃的温度条件下处理10～60分钟，并在0～3500r/min的频率下搅拌1～6小时，期间pH值为5.8～8.0；
S4、冷冻干燥
在-30～-60℃的低温条件下处理10～50分钟，然后经-30～-45℃的低温条件下冷冻2～12小时干燥处理即得。
检测试验
1)45S5生物活性玻璃活性的测试
(1)取0.1克45S5生物活性玻璃原料在200ml Tris缓冲液中反应20小时，Tris缓冲液pH为7.25，反应容器为锥形瓶；将锥形瓶放入37°度的水浴摇床中，在反应时维持175RPM的旋转速度，以模拟生物动态环境。为确定重复性，三个样品同时测定。
(2)20小时反应后，通过过滤将反应过的45S5生物活性玻璃样品与Tris缓冲液分离开。用丙酮将样品干燥后进行红外光谱(FTIR)测试，测定表面羟基磷灰石的生成。表面羟基磷灰石的生成即表明材料具有生物活性。如下图1为反应前的45S5生物活性玻璃红外反射光谱，图2为20小时反应后45S5生物活性玻璃剂的红外反射光谱。图2中，HA双峰为羟基磷灰石，表明生物活性。双峰波数分别为602cm-1和564cm-1。
2)测试胶原复合型45S5生物活性玻璃的孔径及孔隙率，结果如表1。
表1
名称 孔径(μm) 孔隙率(％)
以胶原为基质的可塑性45S5生物活性玻璃 50～500 50～91
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种胶原复合型45S5生物活性玻璃，其特征在于，包括重量百分比的如下组分：
20～50％的Ⅰ型胶原纤维丝和50～80％的45S5生物活性玻璃，其中，所述Ⅰ型胶原纤维丝为胶原丰富的动物原材料经过清洗、酸解、酶解和再清洗后获得的无细胞胶原框架，再切割和研磨制得；45S5生物活性玻璃采用熔融法制备，其颗粒直径为80-750μm，45S5生物活性玻璃须进行活性测试表明其具有生物活性。
2.根据权利要求1所述的胶原复合型45S5生物活性玻璃，其特征在于，所述Ⅰ型胶原纤维丝的提取具体包括如下步骤：
a、在偏光显微镜的监控下，选择健康动物的胶原纤维量多的组织作为原材料，常温下用当量浓度为1～3N的酸溶液浸泡24～120小时，以破坏细胞的结构并溶解细胞外可溶性成分；
b、将待用的原材料取出，水清洗除酸，浸泡于浓度为5～15％的蛋白酶溶液中进行酶解处理10～20小时，以软化原材料的组织结构；期间用切片刀切下一小片厚度为100～200μm的组织，经脱水、透明步骤，在偏光显微镜下观察，检查是否原材料已无细胞；
c、将原材料取出清洗，即获得无细胞胶原框架，然后将无细胞胶原框架切割成0.05～0.5cm大小的组织块；
d、将组织块研磨成直径为10～50μm，长度为300～500μm的胶原纤维丝。
3.根据权利要求2所述的胶原复合型45S5生物活性玻璃，其特征在于，所述酸溶液为盐酸或醋酸。
4.根据权利要求2所述的胶原复合型45S5生物活性玻璃，其特征在于，所述蛋白酶为胃肠道的消化酶。
5.根据权利要求2所述的胶原复合型45S5生物活性玻璃，其特征在于，45S5生物活性玻璃由45wt％的SiO2结合24.5wt％的Na2O、24.5wt％的CaO和6wt％的P2O5组成，在生理环境中具有快速反应性能，玻璃表面发生适当的化学改变，形成硅胶层和富钙磷层，可诱导生成羟基磷灰石层；45S5生物活性玻璃必须满足活性的测试，表明其具有生物活性。
6.一种胶原复合型45S5生物活性玻璃的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、制备Ⅰ型胶原纤维丝
a、在偏光显微镜的监控下，选择健康动物的胶原纤维量多的组织作为原材料，常温下用当量浓度为1～3N的酸溶液浸泡24～120小时，以破坏细胞的结构并溶解细胞外可溶性成分；
b、将待用的原材料取出，水清洗除酸，浸泡于浓度为5～15％的蛋白酶溶液中进行酶解处理10～20小时，以软化原材料的组织结构；期间用切片刀切下一小片厚度为100～200μm的组织，经脱水、透明步骤，在偏光显微镜下观察，检查是否原材料已无细胞；
c、将原材料取出清洗，即获得无细胞胶原框架，然后将无细胞胶原框架切割成0.05～0.5cm大小的组织块；
d、将组织块研磨成直径为10～50μm，长度为300～500μm的胶原纤维丝；
S2、采用熔融法制备45S5生物活性玻璃，45S5生物活性玻璃产品颗粒直径为80-750μm，其必须进行活性测试表明其具有生物活性；
S3、Ⅰ型胶原纤维丝与45S5生物活性玻璃混合
将Ⅰ型胶原纤维丝与45S5生物活性玻璃按照20～50％和50～80％的质量比例添加混合，45～60℃的温度条件下处理10～60分钟，并在0～3500r/min的频率下搅拌1～6小时；
S4、冷冻干燥
在-30～-60℃的低温条件下处理10～50分钟，然后经-30～-45℃的低温条件下冷冻2～12小时干燥处理即得。
7.根据权利要求6所述的胶原复合型45S5生物活性玻璃的制备方法，其特征在于，所述步骤S3的处理过程中pH值为5.8～8.0。
8.一种胶原复合型45S5生物活性玻璃在骨组织修复和组织工程支架中作为植骨材料的应用。
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