CN108226510A

CN108226510A - 一种快速检测大豆花叶病毒的胶体金试纸条

Info

Publication number: CN108226510A
Application number: CN201810035657.XA
Authority: CN
Inventors: 李凯; 智海剑; 盖钧镒; 任锐; 高乐
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-01-15
Filing date: 2018-01-15
Publication date: 2018-06-29

Abstract

本发明公开了一种快速检测大豆花叶病毒(SMV)的胶体金免疫试纸条的制备方法及其检测方法。该试纸条由样品垫、胶体金垫、NC膜、吸水滤纸和背衬组成。所述胶体金垫上包被有胶体金标记的SMV单克隆抗体，由小鼠杂交瘤细胞株BALB/c‑SMV‑CP‑9H7分泌产生；NC膜上设置有检测线和控制线，检测线上包被有SMV‑CP的多克隆抗体，控制线上包被有蛋白A。本发明的“SMV胶体金免疫试纸条”能快速、灵敏、准确、成本低、操作简便地检测中国的SMV，非常适合对田间大批量样品进行现场初筛，对农业生产上SMV病害监测和预警具有重要意义。

Description

一种快速检测大豆花叶病毒的胶体金试纸条

技术领域

本发明属于病原物检测技术领域。更具体地，涉及一种大豆花叶病毒(SMV)胶体金免疫快速检测试纸条。

背景技术

大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)是侵染大豆的主要病毒之一。SMV引起的大豆花叶病毒病严重影响大豆的产量和品质。快速、准确检测相关病毒是生产上病害预警、防控、减少损失的重要手段之一。在科学研究中，植物病毒的检测方法主要有生物学检测法、电镜技术、血清学检测法(酶联免疫吸附反应(Enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)等)和分子生物学检测法(包括PCR技术、核酸探针技术等)等。生物学检测法(Biological detection method)又叫指示植物病毒检测法，是利用病毒在寄主植物上的局部或系统症状，来初步判定病毒的种类。但由于该方法费时费力，易受环境条件的影响，缺乏充足的依据，已很少采用。电镜技术(Electron microscopy)是将感病植物组织制成检测样本，在电子显微镜下观察，根据病毒粒子的形态、大小、以及细胞的超微结构等，来判断病毒的种类，是最直接的检测方法。血清学方法(Serological methods)是利用抗原、抗体蛋白的体外特异性结合来检测病毒。该方法是SMV等植物病毒定性、定量分析最常用、有效的方法之一，包括酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)和免疫荧光技术(Immunofluorescence)等。目前使用最广泛的是ELISA测定，是将抗原、抗体包被在固相支持物上，借助与抗原、抗体结合的酶同底物的反应来检测相应的抗体或抗原，一般用双抗体夹心法(DAS-ELISA)。ELISA具有特异性强、快速、易于标准化等优点，但也存在抗体制备时间长、存在假阳性等缺点。Zhu等(2016)首次开发了一种实用、快速，基于双抗体夹心原理的SMV侧流测定法(LFA)，可以用于检测大豆叶片和种子中的SMV。分子生物学方法(Molecular biology method)是通过检测病毒核酸(DNA或RNA)来证实病毒的存在，灵敏度高，特异性强，检测病毒范围更广，并可进行大批量检测。包括核酸杂交(Nucleic acidhybridization)技术、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等。我国科研人员建立了基于TaqMan-MGB荧光定量IC/TC-RT-PCR和多重RT-PCR的能检测SMV等多种病毒的检测体系(蔡伟等，2016；沈建国等，2016)。分离病毒照电镜虽然是诊断病毒的有效手段，其特异性强，但非常费时费力，需要专业的技术人员，不适合推广使用。血清学检测方法比较费时、费力。免疫荧光、ELISA等方法虽然具有微量、特异、快速、准确的优点，但需要比较完备的试验仪器和经验丰富的技术人员来操作和判断结果，检测一批样品整个流程需要4～8小时，对于基层工作场所很难做到。PCR及核酸探针的诊断更需要有特殊的仪器和药品，技术含量很高，一般只适于实验室诊断或研究应用，很难在基层推广。因此，迫切需要建立一种简单、快速、灵敏、廉价且适合于基层应用的病毒诊断方法。

1971年胶体金作为标记物开始用于免疫组织化学。Faulk等应用电镜免疫胶体金染色法观察沙门氏菌。许多学者进一步证实胶体金能稳定迅速地吸附蛋白质，而蛋白质的生物活性无明显改变。它可以作为探针进行细胞表面和细胞内多糖、蛋白质、多肽、抗原、激素、核酸等生物大分子的精确定位，也可以用于日常的免疫诊断，进行免疫组织化学定位。胶体金溶液是指分散相粒子直径在l～150nm之间的金溶胶，属于多相不均匀体系，颜色呈桔红色到紫红色。免疫胶体金层析技术(Gold immune chromatography assay，GICA)作为一种新的免疫学检测方法，是20世纪80年代在免疫胶体金标记技术基础上建立起来的一种新型独特的诊断技术。这项技术将胶体金标记技术、免疫检测技术、层析分析技术、单(多)克隆抗体技术和新材料技术等多种方法有机结合在一起，具有简单、快速、准确、无污染、操作简单和无需特殊设备等优点，在医学、动植物检疫、食品安全监督各领域得到了日益广泛的应用。20世纪90年代初到中期，胶体金标记免疫层析诊断技术开始进入商业化应用。利用这种技术开发的胶体金快速检测试纸条具有操作简便、快捷、可单份检测、便于保存、不需特殊设备等优点，可在现场(临床)对目标病原进行初筛，节省大量的人力、物力。

目前，胶体金试纸条在国内主要应用于医学领域和畜牧兽医领域，植物病毒方面很少见到。在农牧领域，较少有成熟的产品，更多的出现在相关的科研项目中。孙艳等(2011)应用胶体金技术进行了黄瓜细菌性角斑病(Pseudomona.s.syringaepv.Lachrymans)的快速检测研究。国内涉及到烟草病毒病检测的商用胶体金试纸条非常少。国外的商品化试纸条非常昂贵，价格在50～60元人民币/张，不适于生产上大批烟苗的检测使用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种快速检测大豆花叶病毒的胶体金试纸条，及时准确诊断SMV病害。

本发明第一个目的是提供一种产生SMV-CP蛋白的特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株BALB/c-SMV-CP-9H7，于2017年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14881，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明第二个目的是提供一种SMV-CP蛋白的特异性单克隆抗体，该特异性单克隆抗体由上述小鼠杂交瘤细胞株BALB/c-SMV-CP-9H7分泌产生。

本发明第三个目的是提供一种SMV-CP蛋白的特异性单克隆抗体在制备SMV病毒检测制剂或产品方面的应用。

本发明的第四个目的是提供一种快速检测SMV病毒的胶体金试纸条，该试纸条由样品垫、胶体金垫、NC膜、吸水滤纸和背衬组成；所述样品垫、胶体金垫和NC膜，按从左至右、从上至下的顺序依次结合在背衬同一面上，胶体金垫和NC膜的一端重叠，所述吸水滤纸结合在NC膜的另一端；所述NC膜上设置有检测线(T线)和质控线(C线)，且T线位于胶体金垫和C线之间的位置；所述胶体金垫上包被有胶体金标记的SMV-CP蛋白的特异性单克隆抗体，T线上包被有SMV-CP的多克隆抗体；C线上包被有蛋白A(A型金黄色葡萄球菌分离而得的一种细胞壁蛋白，具有不在抗原结合点而与免疫球蛋白结合的性质)。

进一步的，所述SMV-CP蛋白的特异性单克隆抗体由上述小鼠杂交瘤细胞株BALB/c-SMV-CP-9H7分泌产生。

本发明的第五个目的是提供一种快速检测SMV病毒的胶体金试纸条在SMV病毒检测中的应用。

进一步的，所述SMV病毒为中国的SMV病毒。

上述快速检测SMV病毒的胶体金试纸条在SMV病毒的检测方面，具有很好的应用前景。其基本原理如下：该试纸条采用双抗体夹心法，即胶体金标记和NC膜包被的都是特异性抗体，该试纸条金标抗体为SMV-CP单克隆抗体，NC膜包被的是SMV-CP多克隆抗体。检测时，当待测液中有SMV时，检测液层析到金标抗体处时，病毒与SMV-CP单抗特异性结合，并且继续往T线位置层析，与T线处的SMV-CP多抗结合，形成单抗-病毒-多抗结合物，并且富集停留在T线处，从而肉眼能够识别出一道清晰的红线，其余的金标抗体继续层析到C线处与蛋白A结合，形成一道清晰的红线，此为阳性；当检测液中没有SMV时，在层析过程中金标抗体不会停留在T线处，在T线处肉眼看不到任何条带，金标抗体继续层析到C线蛋白A处，形成清晰红色条带，此为阴性。检测时，不管是阳性还是阴性结果，C线都必须显现，否则结果判定为无效。注意在检测时，病毒的提取过程中，不应将沉淀物质带进检测液中，防止堵塞NC膜，无法层析。

本发明具有以下有益效果：本发明首次针对植物病毒构建了SMV病毒的检测试纸条，创新性很强，开发的SMV单重病毒快速检测试纸条利用胶体金免疫层析技术，结合了色谱层析和免疫反应的原理，实现了快速、准确地定性检测SMV的目的，可以在田间快速、大规模的检测样品，检测结果准确、可靠。与ELISA方法相比，本发明的试纸条具有快速、灵敏、直观、成本低廉、操作简便、对人体无害、易于大量样本的检测等特点，诊断及时准确。更重要的是，本发明的试纸条检测的病毒的特异性很强，是专门针对中国的SMV的检测。该试纸条采用的关键抗体是专门针对中国大豆产区的SMV的流行株系SC7构建得到，所制备的针对性的单克隆抗体灵敏度非常高，可以达到10^-2mg/mL，对中国的SMV的快速检测具有重要的意义。另外，本发明的整个产品体积小、携带方便，不需要仪器设备，操作简单。可现场检测，在5～10min内即可出结果；结果可由肉眼根据T线颜色的深浅进行判断，非常适合对大批量样品进行现场初筛，在实际生产中很有应用价值，具有强大的推广应用前景。

附图说明

图1：SMV-CP-His蛋白表达SDS-PAGE分析。

泳道M是蛋白Marker；泳道1是未受诱导；泳道2是受诱导；泳道3是0.5mM IP个浓度梯度诱导的上层清液；泳道4是0.5mM IP个浓度梯度诱导。

图2：SMV-CP-His蛋白纯化SDS-PAGE分析。

泳道M是蛋白Marker；泳道1是未纯化蛋白；泳道2是溢流道；泳道3是洗脱液。

图3：抗体纯化后SDS-PAGE电泳纯度检测。

图4：胶体金免疫试纸条检测结果判断图。

图5：胶体金免疫试纸条对不同SMV株系(SC3、SC7、SC15和SC18)的检测。

其中SC3、SC7、SC15和SC18为SMV不同株系，4.2和4.3为检测样品(阴性结果)，CK-为阴性对照，PBS为磷酸缓冲液，SC3原为没有稀释的SC3原液。

图6：胶体金免疫试纸条对不同稀释浓度大豆叶片研磨液的灵敏度检测分析。

分别为SC7阳性样品原液、SC7阳性样品5倍稀释、SC7阳性样品10倍稀释、SC7阳性样品50倍稀释。

生物保藏信息说明

分类命名：小鼠杂交瘤细胞株BALB/c-SMV-CP-9H7，于2017年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.14881，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，而不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1：基因合成-原核蛋白表达(即特异抗原制备)

1.SMV-CP蛋白编码基因的获得

采用PAS(PCR-based Accurate Synthesis)方法合成SMV-CP蛋白编码基因的核苷酸序列，在其两端加酶切位点Nde I和Xba I。

2.基因片段和pCzn1载体的酶切和连接

将含有酶切位点Nde I和Xba I的SMV-CP蛋白的编码基因片段和pCzn1载体用限制性内切酶Nde I和Xba I进行双酶切，分别得到SMV-CP蛋白的编码基因酶切片段和载体酶切片段。酶切体系为：43.0μL载体(pCzn1)质粒、1.0μLNde I、1.0μLXba I和5.0μl 10×Buffer，37℃过夜反应。然后用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收载体酶切片段。

将SMV-CP蛋白的编码基因酶切片段连接至pCzn1载体的Nde I和Xba I酶切位点之间，获得重组质粒pCzn1-SMV-CP。连接体系为：16μL基因酶切片段、1μL载体(pCzn1)酶切片段、1μL T4DNA连接酶和2μL10×Buffer，16℃反应过夜。

3.酶切基因片段和pCzn1载体的转化

将重组质粒pCzn1-SMV-CP转入TOP10克隆菌株。转化步骤为：

(1)取100μL TOP10感受态细胞冰上融化，加入重组质粒并轻轻混匀，冰上静置25分钟；

(2)42℃热激45秒，迅速放回冰上静置2分钟；

(3)加入700μL2YT培养基或LB培养基，震荡60分钟(37℃，200rpm)；

(4)5000rpm离心1分钟，留取100μL上清轻轻吹打重悬，并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上；

(5)将平板放于37℃培养箱中倒置过夜培养。

挑取阳性单克隆，进行扩大培养、PCR检测和测序验证。测序结果如SEQ ID NO.1所示，包括SMV-CP编码基因区域，Nde I和Xba I酶切位，以及His标签。

4.将重组质粒pCzn 1-SMV-CP载体转化至大肠杆菌Arctic Express

(1)将质粒1μL加入100μL感受态细菌中，冰上静置20min；

(2)42℃热激90sec，迅速置冰中5min；

(3)加入600μL LB培养液；

(4)11℃，220rpm振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/ml Amp的LB平板，37℃倒置过夜培养。

5.IPTG诱导pCzn1-SMV-CP载体融合蛋白的表达

(1)挑取单克隆，接种于3ml LB培养液(含有50μg/mLAMP氨苄青霉素)，11℃220rpm震荡过夜培养；

(2)次日按1：100接种于含50μg/mlAMP的30mL的LB培养液中，37℃220rpm震荡培养至菌体OD600为0.6-0.8(约2h)；

(3)取出1ml菌液，10000g室温离心2min，弃上清，用100μL 1×上样缓冲液重悬菌体；

(4)向重悬菌液中加入IPTG至终浓度为0.5mM，11℃220rpm振摇过夜培养，诱导融合蛋白表达；

(5)取出1ml培养物，10000g室温离心2min，弃上清，用100μL 1×上样缓冲液重悬菌体，4000g室温离心10min，弃上清，用磷酸缓冲液(PBS)重悬菌体；重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬。

(6)进行12％SDS-PAGE检测分析，考马斯亮蓝染色显带，结果如图1所示。

6.融合蛋白的Ni柱亲和纯化

(1)利用低压层析系统，上清溶液以0.5ml/min流速上样至Ni-IDABinding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱；

(2)用Ni-IDABinding-Buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；

(3)用Ni-IDAWashing-Buffer(20mMTris-HCl、20mM咪唑、0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；

(4)用Ni-IDA Elution-Buffer(20mMTris-HCl、250mM咪唑、0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；

(5)上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20mMTris-HCl，0.10M NaCl，pH8.0进行透析过夜；

(6)进行12％SDS-PAGE分析,结果如图2所示。

实施例2：SMV-CP蛋白特异抗体制备

(一)SMV-CP蛋白单克隆抗体制备

1.动物免疫

以SMV-CP蛋白为抗原进行，按100μg蛋白/只小鼠的量，皮下初次免疫6只SPFBALB/c雌性小鼠。

初次免疫两周后，皮下第一次加强免疫，免疫量为50μg蛋白/只；

第一次加强免疫两周后，皮下第二次加强免疫，免疫量为50μg蛋白/只；

第二次加强免疫两周后，皮下第三次加强免疫，免疫量为50μg蛋白/只；

第二次加强免疫一周后，眼眶取血，测血清效价。

2.免疫效价检测：

用“SMV-CP”，2μg/ml，4℃包被过夜，1％BSA封闭液，37℃封闭1h；血清从500倍开始3倍梯度稀释，空白对照(blank)为封闭液，阴性对照(negative)为阴性血清500倍稀释。

表1免疫效价检测(效价为大于最大OD只/2的最小OD对数所对应的稀释度)

根据结果选取6号免疫小鼠做细胞融合实验。

2.1细胞融合实验

取6号免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞，采用PEG法进行融合。融合细胞用含HAT的DEME完全培养基进行筛选培养。

2.1.1实验器材

灭菌的手术器械(包括3把剪刀、3把镊子、1个细胞筛、1个注射器内芯、1个平皿)，湿盒，2个500mL烧杯，2个50mL离心管，3个15mL离心管。

2.1.2实验试剂

IMDM培养基、DMEM完全培养基(含20％血清)；1％青链霉素(Gibco，货号15140-122，100mL)；胎牛血清(四季青，160715)10mL；PEG4000(Sigma，P718 1-5ml)；HAT(Sigma，货号H0137-10VL)；HT(Sigma，货号H0262-10VL)

2.1.3骨髓瘤细胞制备

融合前一周，用含10％FBS DMEM培养基扩大培养SP2/0细胞。到融合时，细胞长满大约6瓶T25细胞培养瓶，在融合当天收集SP2/0细胞到50ml离心管中，1000rpm,5min离心。弃上清，然后再加入20ml DMEM基础培养基，吹散细胞然后计数。

2.1.4脾细胞制备

四次免疫后血清ELISA效价在1：10000以上的小鼠，在融合前3天终免，腹腔注射抗原100ug。融合当天用颈椎脱臼法安乐死要融合的小鼠。用75％酒精浸泡5min.无菌取脾脏，把脾脏放入内有10mlDMEM基础培养的培养皿中。取筛网放入另一个平皿中，将脾脏转移到筛网上，用注射器内心研磨脾脏。加入DMEM到筛网上，冲洗筛网，使脾细胞更多的收集到平皿中。将细胞移至10ml离心管中，用不含血清的DMEM洗脾细胞两次，1000rpm离心5min，收集脾细胞计数。

2.1.5细胞融合

混合骨髓瘤细胞和脾细胞，使骨髓瘤细胞同脾细胞数量比在1：20为宜。把细胞放到50ml离心管中，用DMEM基础培养基稀释，然后离心1000rpm 5min。弃上清，摇动离心管使细胞均匀。缓慢加入0.8ml 50％PEG，反应90秒，然后加入20-30ml DMEM培养基终止PEG，把融合的细胞放到37℃水浴锅中反应10分钟。1000rpm，5min，弃上清然后加入HAT DMEM培养基.把融合的细胞铺到96孔板中，每孔100μL。然后将细胞培养板放到CO₂培养箱中培养。融合后4天查看，杂交瘤细胞克隆率在50％以上，有少量的细胞碎片，细胞生长状态良好。融合10天后开始进行筛选检测。

2.1.6亚克隆：

吹打阳性孔中细胞，计数，在离心管中加入N/4ml DMEM培养基(N为细胞计数结果)，取100ul细胞悬液到离心管中，吹匀后留1ml，补加DMEM到4ml，吹匀，留100ul(约2滴)在管底。在离心管中加DMEM至5ml，混匀后滴加至96孔板的前三行，每孔一滴管底留1.8-2ml左右，补加DMEM至5ml，吹匀后滴加至96孔板的D、E、F三行，每孔一滴，管底留1.5-1.8ml左右，补加DMEM至2.8-3ml左右，吹匀后滴加至96孔板的G、H行，每孔一滴，7-10天后在显微镜下观察，检测有克隆生长的孔，标记出单克隆的孔，尽可能挑取阳性的单克隆细胞进行再次亚克隆，检测至100％阳性后，挑出单克隆孔扩大培养定株。

2.2单克隆细胞筛选：

用“SMV-CP”包被，对挑选的克隆采用ELISA方法，做第一次筛选，得到12株阳性杂交瘤细胞株。

2.2.1试剂：

包被液：PBS缓冲液，pH7.4；封闭液：1％BSA in PBST；洗液：PBS-T(0.05％吐温，PBS)；

显色液：1％A液+10％B液(A液：TMB in DMSO；B液：0.1％H₂O₂in柠檬酸缓冲液)；终止液：1M盐酸；二抗：山羊抗小鼠IgG/HRP

2.2.2实验步骤：

1)用包被液稀释“SMV-CP”，终浓度为5ug/ml，100ul/孔，4℃，过夜；后用洗液洗涤3次。

2)用1％BSA封闭液封闭，200ul/孔，37℃，1h，后用洗液洗涤1次。

3)加入一抗(细胞培养上清)、阴性对照(SP2/0培养上清)、空白对照(PBS)、阳性对照(阳性血清PBS 1000倍稀释)，均为100ul/孔，37℃孵育，1h，后用洗液洗涤3次，浸2s。

4)加入PBS稀释20000倍的二抗(山羊抗小鼠IgG/HRP)，100ul/孔，37℃孵育，1h，后用洗液洗涤4次，浸2s。

5)显色，显色液100ul/孔，显色时间为5min左右。

6)每孔加入100ul终止液终止反应。

7)波长450nm测吸光值，记录保存数据。

2.3单克隆细胞二次筛选：

将12株阳性的细胞株，用“SMV-CP”蛋白再次包板，采用ELISA方法，做第二次筛选，得到8株阳性杂交瘤细胞株。

将筛选出来的8株阳性细胞株进行亚类鉴定，最后得到6株IgG类型的阳性杂交瘤细胞株。2.3.1实验试剂

包被抗体：(Souther Biotech)、封闭液：1％BSA+3％蔗糖in PBS、显色液、0.2ml A液+10ul30％H₂O₂in 10ml B液、各型亚类二抗:(Southern Biotech)。

2.3.2实验步骤：

1)用100nM PBS(pH7.4)稀释包被抗体至0.5ug/ml，每孔加100μl，4℃，过夜。

2)PBST洗2次，每孔加入200ul封闭液，37℃，孵育2h。

3)PBST洗2次，每孔加入100ul杂交瘤上清，37℃，孵育1h。

4)PBST洗3次，用封闭液1:10000或1:20000稀释的HRP标记的抗体100ul每孔，分别适当的孔中，37℃，孵育1h。

5)PBST洗3次，每孔加50ul底物溶液，10-20min内450nm波长测吸光度值，记录保存数据。

表2筛选出来的8株阳性细胞株进行亚类鉴定

细胞株编号	针对免疫原的OD值	亚型
			1	2.063	lgG1
2	1.897	lgG2a
			3	1.453	lgG1
4	1.632	lgG2b
			5	1.035	lgG2b
6	1.078	lgG2b
			7	1.196	lgG2a
8	2.035	lgG1
			阴	2.176	lgG2a
孔	2.018	lgG1
			阳	1.453	lgG2a

最终得到8株产生SMV-CP的特异单抗的杂交瘤细胞株，选取一株最好的编号为BALB/c-SMV-CP培育保存，并于2017年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC NO.14881。

3.SMV-CP单克隆抗体制备

3.1培养小鼠杂交瘤细胞株BALB/c-SMV-CP-9H7细胞；

3.2Protein A过柱纯化得到CMV特异抗体。

(二)SMV-CP蛋白多克隆抗体制

1.动物免疫

以SMV-CP蛋白为抗原进行BCA蛋白浓度测定后，免疫2只新西兰白兔(2-2.5kg)，皮下免疫400ug/次，2-3周免疫一次，免疫4次。采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对SMV-CP蛋白的效价，待效价大于1：50,000进行最终采血制备抗血清，并准备纯化。

2抗体纯化

将蛋白SMV-CP与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将所得抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4度透析过夜，隔日进行纯度，浓度和效价测定。

3抗体鉴定

通过ELISA检测纯化抗体的效价，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒对所得抗体进行浓度测定；通过SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察纯化抗体的纯度。

(1)纯化抗体间接ELISA效价检测，具体操作如下：

1)根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记

2)用磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)包被抗原蛋白(SMV-CP蛋白、SC7天然样品和CK天然样品)，稀释成需要的浓度，混匀后加入板条中(5ug/ml,100ul/孔)，4℃冰箱过夜。

3)包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200ul封闭液，37℃恒温箱1h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次

4)纯化抗体按1/500，2倍稀释，每孔100ul，37℃恒温箱1h

5)取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100ul稀释好的酶标二抗(山羊抗兔-HRP，1/5000)，37℃恒温箱1小时。

6)取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100ul TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃，15min。

7)每孔加入100ul 1M HCL溶液，终止反应。在酶标仪上450nm读数，将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。

表3抗体间接Elisa结果

(2)抗体浓度：0.89mg/mL体积：2.0ml

缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)

(3)纯化后抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，如图3可见抗体纯化后纯度在90％以上。

4.抗体HRP标记

1)将D3713纯化抗体用1*PBS，4℃透析过夜；

2)称取足量HRP，用双蒸水溶解。称取足量NaIO4，用双蒸水溶解；

3)每毫升HRP溶液中加入200ul NaIO4溶液，避光反应；

4)加入1/10体积的乙二醇。用200倍以上体积1mM醋酸钠溶液4℃透析过夜；

5)将HRP取出，加入碳酸盐溶液(0.5M，pH 9.5)调整pH值；

6)按照质量比HRP:抗体＝1:1的比例将抗体与HRP混合，室温避光反应；

7)加入4mg/ml的硼氢化钠至终浓度50ul/ml，室温避光反应；

8)将上述溶液用PBS(PH7.4)，4℃透析过夜，换液两次；

9)加10％硫柳汞至终浓度为0.01％，按1:1比例加入甘油，分装1.0ml/管，-20℃避光保存。

5.抗体HRP标记效价检测

HRP标记抗体效价，具体结果如下，

包被抗原:SMV-CP蛋白、SC7天然样品、CK天然样品

包被浓度：5ug/ml,100ul/孔

包被缓冲液:磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)

表4标记抗体间接Elisa结果

6.多克隆抗体夹心ELISA检测

(1)多克隆抗体夹心ELISA检测，具体操作如下：

1)根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记

2)用PBS包被液将SMV-CP多克隆抗体稀释成需要的浓度，混匀后加入板条中，每孔100ul，4℃冰箱过夜。包被抗原：SMV-CP多克隆抗体包被浓度：5ug/ml,100ul/孔包被缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)

4)SMV-CP蛋白、SC7天然样品、CK天然样品，1ug/ml起始，2倍稀释，每孔100ul，37℃恒温箱1h

5)二抗反应取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100ul稀释好的酶标二抗，酶标二抗：SMV-CP多克隆抗体-HRP，1/4000。37℃恒温箱1小时。

6)显色取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100ul TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃，15min。

7)终止反应每孔加入100ul 1M HCL溶液，终止反应。即刻在酶标仪上450nm读数。

(2)SMV-CP多克隆抗体夹心ELISA检测效价，具体结果如下，

包被抗原:SMV-CP多克隆抗体

包被浓度:5ug/ml,100ul/孔

包被缓冲液:磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)

二抗：SMV-CP多克隆抗体-HRP，1/4000

表5多克隆抗体夹心Elisa结果

实施例3：制备SMV-CP胶体金快速检测试纸条

1试剂和耗材

(1)SMV-CP抗体

(2)胶体金颗粒(20nm)

(3)8964玻纤用于金标结合垫(捷宁生物)

(4)GF-06玻纤用于样品处理垫(捷宁生物)

(5)金标复溶液(钟鼎生物)

(6)样品稀释液(钟鼎生物)

(7)抗体稀释液(钟鼎生物)

2实验仪器

(1)XYZ3060胶体金点样系统(Biodot)

(2)切条机(Biodot)

(3)高速低温离心机

(4)电子天平

(5)除湿机HD165A(百奥)

(6)37℃恒温箱

3实验方法及结果

3.1金标抗体制作

(1)胶体金PH调整：取1mL胶体金(20nm)于1.5ml离心管中，向其中加入43μL碳酸钾(0.2M)，混匀。

(2)标记SMV-CP单抗：向调好PH的胶体金溶液中缓慢加入20μg SMV-CP单抗，室温下在摇床中反应10min。

(3)胶体金剩余位点封闭与稳定：胶体金与抗体反应好后，加入10％BSA使其终浓度为2％，室温下在摇床中反应10min。

(4)纯化：将封闭好的金标溶液11000rpm/min 4℃离心15min，离心结束后轻轻取出离心管，小心吸取并弃去上清液，然后用金标复溶液将沉淀定溶到原体积的50％轻轻混匀。

(5)干燥：将复溶后的金标抗体铺到5mm宽的胶体金结合垫(8964玻纤)上，然后放在干燥间干燥。

3.2胶体金试纸条组装

(1)NC膜包被：用抗体稀释液将SMV-CP单抗稀释到0.4mg/ml(经过筛选该浓度为最适浓度，再高则会出现假阳性)，用点膜机包被在NC膜上。

(2)样品垫的处理：将配有一定离子浓度表面活性剂和封闭蛋白的溶液添加到样品垫上放于干燥间干燥。

(3)试纸条的组装：于衬板自上而下依次黏贴预处理过的吸水板、包被过的NC膜、金标结合垫和样品垫。

其基本原理如下：该试纸条采用双抗体夹心法，即胶体金标记和NC膜包被的都是特异性抗体，该试纸条金标抗体为SMV-CP单克隆抗体，NC膜包被的是SMV-CP多克隆抗体。如图4，检测时当待测液中有SMV时，检测液层析到金标抗体处时，病毒与SMV-CP单抗特异性结合，并且继续往T线位置层析，与T线处的SMV-CP多抗结合，形成单抗-病毒-多抗结合物，并且富集停留在T线处，从而肉眼能够识别出一道清晰的红线，其余的金标抗体继续层析到C线处与蛋白A结合，形成一道清晰的红线，此为阳性；当检测液中没有SMV时，在层析过程中金标抗体不会停留在T线处，在T线处肉眼看不到任何条带，金标抗体继续层析到C线蛋白A处，形成清晰红色条带，此为阴性。

3.3胶体金试纸条使用

(1)称取含有不同SMV株系(SC3、SC7、SC15和SC18)的大豆叶片各0.2克，样品于1.5ml EP管中用一次性研磨棒将其研磨粉碎，将粉碎后的样品转移至2ml EP管中，再加入1.8ml0.1M PH 7.4的PBS，放入混匀器中10分钟，8000r/min离心10分钟取出上清待检(此上清液须至少用纯水稀释10倍后使用)；

(2)取出试纸条放于水平桌面上(尽快使用)，注意不要触碰NC膜；

(3)用移液枪或滴管吸取70ul待检样品缓慢逐滴滴加在试纸条加样孔上，7-10分钟判读结果。如图5，不同SMV株系(SC3、SC7、SC15和SC18)在T线和C线处均出现一道清晰的红线，此为阳性；阴性对照，在T线处肉眼看不到任何条带，C线蛋白A处，形成清晰红色条带。检测时，不管是阳性还是阴性结果，C线都必须显现，否则结果判定为无效。注意在检测时，病毒的提取过程中，不应将沉淀物质带进检测液中，防止堵塞NC膜，无法层析。

3.4夹心反应验证及优化

判断引起假阳性的原因可能是疏水性引起，在样品垫中添加另一种表面活性剂吐温-20(0.5％)。使用该样品垫再检测，发现基本消除了假阳性。

如图6，1号为SC7阳性样品原液、2号为SC7阳性样品5倍稀释、3号为阳性样品10倍稀释、4号为阳性样品50倍稀释。其中1号条理论上显色要深于其他号，但可能是因为叶片中提取出的物质造成基质效应，还有可能是倒钩效应(过多的病毒提前与NC膜上的抗体结合从而导致竞争了能够被肉眼识别的金标抗体探针的反应)。但SC7阳性样品稀释10倍和20被时，T线颜色深于原液和稀释50倍，除原液外，C线颜色均较深。所以建议待测样品提取后最好用纯水稀释10倍后使用。检测结果应以滴加样品后的6-10分钟内的为准。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种快速检测大豆花叶病毒的胶体金试纸条

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1047

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tatcgccgaa aggcacactt aattattaag aggtaataca ccatgaatca caaagtgcat 60

catcatcatc atcatatgtc ggggaaagag aaggaaggag atatggacgc gggcaaagat 120

cccaagaaga atacttcctc gtccaaagga gctggtacta gctcgaagga tgtgaatgtg 180

ggctccaaag gtaaggtagt gccacgcctt caaaagatca cacgtaaaat gaatttgcca 240

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gtagaccttt ttaacacccg tgcaacgcgc acccaatttg aagcctggta taatgccgtt 360

aaagatgagt acgaattaga cgacgagcaa atgggcgtag taatgaacgg ttttatggta 420

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caaatcatgc atcacttttc ggatgcagcc gaagcctata tcgaaatgcg caactcagag 600

tctccttaca tgccccgtta tggtttactt cgcaatcttc gtgatcgcga gttggctcgc 660

tacgctttcg atttctacga ggtcacgtca aaaacaccaa accgtgcgcg tgaagccatt 720

gctcaaatga aggcggcagc attgagtggc gtgaataaca aacttttcgg gttagacggc 780

aatatcagca caaattcgga gaatactgaa cgccacaccg cacgcgacgt gaaccaaaac 840

atgcatacct tattagggat gggtcctcaa cagtaatcta gataggtaat ctctgcttaa 900

aagcacagaa tctaagatcc ctgccatttg gcggggattt ttttatttgt tttcaggaaa 960

taaataatcg atcgcgtaat aaaatctatt attatttttg tgaagaataa atttgggtgc 1020

aatgagaatg cgcaggccct tcgtctc 1047

Claims

1.一种产生SMV-CP蛋白的特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株BALB/c-SMV-CP-9H7，其特征在于，于2017年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14881，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

2.一种SMV-CP蛋白的特异性单克隆抗体，其特征在于，所述特异性单克隆抗体由权利要求1所述的小鼠杂交瘤细胞株BALB/c-SMV-CP-9H7分泌产生。

3.一种SMV-CP蛋白的特异性单克隆抗体在制备SMV病毒检测制剂或产品方面的应用。

4.一种快速检测SMV病毒的胶体金试纸条，其特征在于，所述试纸条由样品垫、胶体金垫、NC膜、吸水滤纸和背衬组成；所述样品垫、胶体金垫和NC膜，按从左至右、从上至下的顺序依次结合在背衬同一面上，胶体金垫和NC膜的一端重叠，所述吸水滤纸结合在NC膜的另一端；所述NC膜上设置有检测线和质控线，且检测线位于胶体金垫和质控线之间的位置；所述胶体金垫上包被有胶体金标记的SMV-CP蛋白的特异性单克隆抗体，检测线上包被有SMV-CP的多克隆抗体；质控线上包被有蛋白A。

5.根据权利要求4所述的快速检测SMV病毒的胶体金试纸条，所述SMV-CP蛋白的特异性单克隆抗体由权利要求1所述小鼠杂交瘤细胞株BALB/c-SMV-CP-9H7分泌产生。

6.一种快速检测SMV病毒的胶体金试纸条在检测SMV病毒中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述SMV病毒为中国的SMV病毒。