CN108207631A - 一种提高硒含量的富硒铁皮石斛苗组培方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高硒含量的富硒铁皮石斛苗组培方法，步骤如下：取富硒铁皮石斛茎段，清洗，放入0.1%的氯化汞溶液中浸泡，再用无菌水冲洗，获得无菌铁皮石斛茎段；将无菌铁皮石斛茎段浸入预处理液中，浸泡处理，然后采用无菌水冲洗茎段表面，获得预处理铁皮石斛茎段；将预处理铁皮石斛茎段沿横截面切成薄片，获得组织薄片；将组织薄片依次放入诱导培养基、增殖培养基、分化培养基、生根培养基、壮苗培养基中进行培养，获得成苗，即可。本发明组培方法能够培育出茁壮健康且硒含量高的富硒铁皮石斛苗，由于采用组培技术进行繁殖，增殖效率非常高，能够有效满足市场对富硒铁皮石斛苗的需求，具有广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及铁皮石斛培育领域，具体是一种提高硒含量的富硒铁皮石斛苗组培方法。
背景技术
硒是一种人和动物所必需的微量元素，具有清除自由基抗氧化、延缓衰老、抗癌、增强免疫力、拮抗重金属等生物学特性。硒总体分为无机硒和有机硒两大类：前者包括硒酸盐、亚硒酸盐等，无机硒对于人和动物来说吸收效果差，毒性风险大，使用不当极易造成硒中毒；后者主要是指与生物有机分子结合形态的硒，对人和动物来说有机硒吸收率高，毒性风险小，更适合补硒的要求。植物是人类和动物获取硒的主要来源。
铁皮石斛是传统名贵中草药，唐代医学经典《道藏》将其列为“中华九大仙草之首”，自唐宋以来，一直被列为皇室贡品。铁皮石斛具有独特的药用价值，以其茎入药，属补益药中的补阴药，具有益胃生津、滋阴清热之功效。含有丰富的石斛多糖，可增强机体免疫力、抗疲劳；铁皮石斛对脾胃病中常见的致病菌幽门螺杆菌有较好的抑制作用，能促进胃液的分泌，促进胃排空助消化；铁皮石斛有较好的护肝利胆作用，是治疗各种肝胆病的要药；铁皮石斛能够强筋健骨、润滑关节、抵御风湿；铁皮石斛可增强胰岛素活性，显著降低血糖水平；铁皮石斛具有较强的抗肿瘤活性，还能减轻放、化疗的副作用，提高生存质量，延长生存时间。此外，铁皮石斛还有滋阴养目、滋养肌肤、抗衰老之功效。
然而，富硒铁皮石斛对生长环境要求苛刻，成苗困难，采用传统的分株、扦插等人工繁殖方法进行繁殖，增殖速度非常低，组培技术是大量培育富硒铁皮石斛苗的有效方法，然而现有的采用组培技术培育的富硒铁皮石斛苗普遍存在硒含量较低的缺陷，亟待改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高硒含量的富硒铁皮石斛苗组培方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种提高硒含量的富硒铁皮石斛苗组培方法，步骤如下：
1）取富硒铁皮石斛茎段，采用无菌水清洗表面的污物，然后放入0.1%的氯化汞溶液中浸泡2-5min，再用无菌水冲洗3-4次，获得无菌铁皮石斛茎段；
2）将无菌铁皮石斛茎段浸入预处理液中，浸泡处理40-50min，然后采用无菌水冲洗茎段表面2-3次，获得预处理铁皮石斛茎段；
3）将预处理铁皮石斛茎段沿横截面切成薄片，获得组织薄片；
4）将组织薄片放入诱导培养基中，在20℃、无光照的条件下进行原球茎的萌发，获得原球茎；
5）将原球茎接种于增殖培养基中，在20-25℃、光照8h/d、光照强度50-60lux的条件下进行原球茎的增殖，获得增殖原球茎；
6）将增殖原球茎接种于分化培养基中，在25-30℃、光照10h/d、光照强度100-150lux的条件下进行诱导丛芽，获得诱导分化的丛芽；
7）将诱导分化的丛芽切割分离成单芽，然后接种至生根培养基中，在25-30℃、光照12h/d、光照强度200-300lux的条件下进行诱导不定根，获得长有不定根的芽苗；
8）将芽苗接种至壮苗培养基中，在25-30℃、光照12h/d、光照强度200-300lux的条件下进行培养，获得高度为6-7cm、根长为1-2cm的成苗，即可。
作为本发明进一步的方案：步骤2）中，所述预处理液由以下按照重量份的原料制成：茵陈蒿8-12份、富硒茶叶15-20份、甘草4-6份、亚硒酸钠0.1-0.2份。
作为本发明再进一步的方案：步骤2）中，所述预处理液由以下按照重量份的原料制成：茵陈蒿10份、富硒茶叶17份、甘草5份、亚硒酸钠0.15份。
作为本发明再进一步的方案：步骤2）中，所述预处理液的制备方法如下：称取茵陈蒿、富硒茶叶和甘草，分别清洗、烘干、粉碎后，合并，加入5-7倍重量的乙醇水溶液，浸泡1-2h，加热回流提取40-50min，过滤，获得回流提取液和回流提取残渣，向回流提取残渣中加入3-4倍重量的乙醇水溶液，浸泡2-3h，超声波处理30-40min，过滤，获得超声波提取液和超声波提取残渣，将超声波提取液与回流提取液合并，减压蒸发浓缩为原体积的25%，然后加入亚硒酸钠，搅拌溶解后，即得预处理液。
作为本发明再进一步的方案：所述诱导培养基采用1/2MS培养基并加入10g/L蛋白胨、0.3mg/L的亚硒酸钠和0.4g/L的壳聚糖，混合均匀后，灭菌处理，即可。
作为本发明再进一步的方案：所述增殖培养基采用1/2MS培养基并加入10g/L蔗糖、5g/L琼脂、0.3mg/L的亚硒酸钠、0.5g/L的壳聚糖和0.2g/L的吲哚乙酸，混合均匀后，灭菌处理，即可。
作为本发明再进一步的方案：所述分化培养基采用MS培养基并加入20g/L蔗糖、10g/L琼脂、0.5mg/L的亚硒酸钠、0.8g/L的壳聚糖和10mg/L 6-苄氨基嘌呤，混合均匀后，灭菌处理，即可。
作为本发明再进一步的方案：所述生根培养基采用MS培养基并加入20g/L香蕉汁、10g/L蛋白胨、0.4mg/L的亚硒酸钠、0.5g/L的壳聚糖和0.2g/L萘乙酸，混合均匀后，灭菌处理，即可。
作为本发明再进一步的方案：所述壮苗培养基采用MS培养基并加入20g/L土豆汁、15g/L蛋白胨、0.2mg/L的亚硒酸钠、0.3mg/L多效唑和0.1g/L萘乙酸，混合均匀后，灭菌处理，即可。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明组培方法能够培育出茁壮健康且硒含量高的富硒铁皮石斛苗，由于采用组培技术进行繁殖，增殖效率非常高，能够有效满足市场对富硒铁皮石斛苗的需求，具有广阔的市场前景。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
一种提高硒含量的富硒铁皮石斛苗组培方法，步骤如下：
1）取富硒铁皮石斛茎段，采用无菌水清洗表面的污物，然后放入0.1%的氯化汞溶液中浸泡2min，再用无菌水冲洗3次，获得无菌铁皮石斛茎段；
2）将无菌铁皮石斛茎段浸入预处理液中，浸泡处理40min，然后采用无菌水冲洗茎段表面2次，获得预处理铁皮石斛茎段；
其中，所述预处理液由以下按照重量份的原料制成：茵陈蒿8份、富硒茶叶15份、甘草4份、亚硒酸钠0.1份；所述预处理液的制备方法如下：称取茵陈蒿、富硒茶叶和甘草，分别清洗、烘干、粉碎后，合并，加入5倍重量的乙醇水溶液，浸泡1h，加热回流提取40min，过滤，获得回流提取液和回流提取残渣，向回流提取残渣中加入3倍重量的乙醇水溶液，浸泡2h，超声波处理30min，过滤，获得超声波提取液和超声波提取残渣，将超声波提取液与回流提取液合并，减压蒸发浓缩为原体积的25%，然后加入亚硒酸钠，搅拌溶解后，即得预处理液；
3）将预处理铁皮石斛茎段沿横截面切成薄片，获得组织薄片；
4）将组织薄片放入诱导培养基中，在20℃、无光照的条件下进行原球茎的萌发，获得原球茎，其中，所述诱导培养基采用1/2MS培养基并加入10g/L蛋白胨、0.3mg/L的亚硒酸钠和0.4g/L的壳聚糖，混合均匀后，灭菌处理，即可；
5）将原球茎接种于增殖培养基中，在20℃、光照8h/d、光照强度50lux的条件下进行原球茎的增殖，获得增殖原球茎，其中，所述增殖培养基采用1/2MS培养基并加入10g/L蔗糖、5g/L琼脂、0.3mg/L的亚硒酸钠、0.5g/L的壳聚糖和0.2g/L的吲哚乙酸，混合均匀后，灭菌处理，即可；
6）将增殖原球茎接种于分化培养基中，在25℃、光照10h/d、光照强度100lux的条件下进行诱导丛芽，获得诱导分化的丛芽，其中，所述分化培养基采用MS培养基并加入20g/L蔗糖、10g/L琼脂、0.5mg/L的亚硒酸钠、0.8g/L的壳聚糖和10mg/L 6-苄氨基嘌呤，混合均匀后，灭菌处理，即可；
7）将诱导分化的丛芽切割分离成单芽，然后接种至生根培养基中，在25℃、光照12h/d、光照强度200lux的条件下进行诱导不定根，获得长有不定根的芽苗，其中，所述生根培养基采用MS培养基并加入20g/L香蕉汁、10g/L蛋白胨、0.4mg/L的亚硒酸钠、0.5g/L的壳聚糖和0.2g/L萘乙酸，混合均匀后，灭菌处理，即可；
8）将芽苗接种至壮苗培养基中，在25℃、光照12h/d、光照强度200lux的条件下进行培养，获得高度为6-7cm、根长为1-2cm的成苗，即可，其中，所述壮苗培养基采用MS培养基并加入20g/L土豆汁、15g/L蛋白胨、0.2mg/L的亚硒酸钠、0.3mg/L多效唑和0.1g/L萘乙酸，混合均匀后，灭菌处理，即可。
实施例2
一种提高硒含量的富硒铁皮石斛苗组培方法，步骤如下：
1）取富硒铁皮石斛茎段，采用无菌水清洗表面的污物，然后放入0.1%的氯化汞溶液中浸泡3min，再用无菌水冲洗3次，获得无菌铁皮石斛茎段；
2）将无菌铁皮石斛茎段浸入预处理液中，浸泡处理42min，然后采用无菌水冲洗茎段表面3次，获得预处理铁皮石斛茎段；
其中，所述预处理液由以下按照重量份的原料制成：茵陈蒿9份、富硒茶叶16份、甘草5份、亚硒酸钠0.1份；所述预处理液的制备方法如下：称取茵陈蒿、富硒茶叶和甘草，分别清洗、烘干、粉碎后，合并，加入5.5倍重量的乙醇水溶液，浸泡1.5h，加热回流提取43min，过滤，获得回流提取液和回流提取残渣，向回流提取残渣中加入3倍重量的乙醇水溶液，浸泡2h，超声波处理35min，过滤，获得超声波提取液和超声波提取残渣，将超声波提取液与回流提取液合并，减压蒸发浓缩为原体积的25%，然后加入亚硒酸钠，搅拌溶解后，即得预处理液；
3）将预处理铁皮石斛茎段沿横截面切成薄片，获得组织薄片；
4）将组织薄片放入诱导培养基中，在20℃、无光照的条件下进行原球茎的萌发，获得原球茎，其中，所述诱导培养基采用1/2MS培养基并加入10g/L蛋白胨、0.3mg/L的亚硒酸钠和0.4g/L的壳聚糖，混合均匀后，灭菌处理，即可；
5）将原球茎接种于增殖培养基中，在22℃、光照8h/d、光照强度55lux的条件下进行原球茎的增殖，获得增殖原球茎，其中，所述增殖培养基采用1/2MS培养基并加入10g/L蔗糖、5g/L琼脂、0.3mg/L的亚硒酸钠、0.5g/L的壳聚糖和0.2g/L的吲哚乙酸，混合均匀后，灭菌处理，即可；
6）将增殖原球茎接种于分化培养基中，在27℃、光照10h/d、光照强度150lux的条件下进行诱导丛芽，获得诱导分化的丛芽，其中，所述分化培养基采用MS培养基并加入20g/L蔗糖、10g/L琼脂、0.5mg/L的亚硒酸钠、0.8g/L的壳聚糖和10mg/L 6-苄氨基嘌呤，混合均匀后，灭菌处理，即可；
7）将诱导分化的丛芽切割分离成单芽，然后接种至生根培养基中，在27℃、光照12h/d、光照强度200lux的条件下进行诱导不定根，获得长有不定根的芽苗，其中，所述生根培养基采用MS培养基并加入20g/L香蕉汁、10g/L蛋白胨、0.4mg/L的亚硒酸钠、0.5g/L的壳聚糖和0.2g/L萘乙酸，混合均匀后，灭菌处理，即可；
8）将芽苗接种至壮苗培养基中，在27℃、光照12h/d、光照强度250lux的条件下进行培养，获得高度为6-7cm、根长为1-2cm的成苗，即可，其中，所述壮苗培养基采用MS培养基并加入20g/L土豆汁、15g/L蛋白胨、0.2mg/L的亚硒酸钠、0.3mg/L多效唑和0.1g/L萘乙酸，混合均匀后，灭菌处理，即可。
实施例3
一种提高硒含量的富硒铁皮石斛苗组培方法，步骤如下：
1）取富硒铁皮石斛茎段，采用无菌水清洗表面的污物，然后放入0.1%的氯化汞溶液中浸泡4min，再用无菌水冲洗4次，获得无菌铁皮石斛茎段；
2）将无菌铁皮石斛茎段浸入预处理液中，浸泡处理45min，然后采用无菌水冲洗茎段表面3次，获得预处理铁皮石斛茎段；
其中，所述预处理液由以下按照重量份的原料制成：茵陈蒿10份、富硒茶叶17份、甘草5份、亚硒酸钠0.15份；所述预处理液的制备方法如下：称取茵陈蒿、富硒茶叶和甘草，分别清洗、烘干、粉碎后，合并，加入6倍重量的乙醇水溶液，浸泡1.5h，加热回流提取45min，过滤，获得回流提取液和回流提取残渣，向回流提取残渣中加入3.5倍重量的乙醇水溶液，浸泡2.5h，超声波处理35min，过滤，获得超声波提取液和超声波提取残渣，将超声波提取液与回流提取液合并，减压蒸发浓缩为原体积的25%，然后加入亚硒酸钠，搅拌溶解后，即得预处理液；
3）将预处理铁皮石斛茎段沿横截面切成薄片，获得组织薄片；
4）将组织薄片放入诱导培养基中，在20℃、无光照的条件下进行原球茎的萌发，获得原球茎，其中，所述诱导培养基采用1/2MS培养基并加入10g/L蛋白胨、0.3mg/L的亚硒酸钠和0.4g/L的壳聚糖，混合均匀后，灭菌处理，即可；
5）将原球茎接种于增殖培养基中，在22℃、光照8h/d、光照强度55lux的条件下进行原球茎的增殖，获得增殖原球茎，其中，所述增殖培养基采用1/2MS培养基并加入10g/L蔗糖、5g/L琼脂、0.3mg/L的亚硒酸钠、0.5g/L的壳聚糖和0.2g/L的吲哚乙酸，混合均匀后，灭菌处理，即可；
6）将增殖原球茎接种于分化培养基中，在28℃、光照10h/d、光照强度120lux的条件下进行诱导丛芽，获得诱导分化的丛芽，其中，所述分化培养基采用MS培养基并加入20g/L蔗糖、10g/L琼脂、0.5mg/L的亚硒酸钠、0.8g/L的壳聚糖和10mg/L 6-苄氨基嘌呤，混合均匀后，灭菌处理，即可；
7）将诱导分化的丛芽切割分离成单芽，然后接种至生根培养基中，在28℃、光照12h/d、光照强度250lux的条件下进行诱导不定根，获得长有不定根的芽苗，其中，所述生根培养基采用MS培养基并加入20g/L香蕉汁、10g/L蛋白胨、0.4mg/L的亚硒酸钠、0.5g/L的壳聚糖和0.2g/L萘乙酸，混合均匀后，灭菌处理，即可；
8）将芽苗接种至壮苗培养基中，在28℃、光照12h/d、光照强度250lux的条件下进行培养，获得高度为6-7cm、根长为1-2cm的成苗，即可，其中，所述壮苗培养基采用MS培养基并加入20g/L土豆汁、15g/L蛋白胨、0.2mg/L的亚硒酸钠、0.3mg/L多效唑和0.1g/L萘乙酸，混合均匀后，灭菌处理，即可。
实施例4
一种提高硒含量的富硒铁皮石斛苗组培方法，步骤如下：
1）取富硒铁皮石斛茎段，采用无菌水清洗表面的污物，然后放入0.1%的氯化汞溶液中浸泡4min，再用无菌水冲洗3次，获得无菌铁皮石斛茎段；
2）将无菌铁皮石斛茎段浸入预处理液中，浸泡处理47min，然后采用无菌水冲洗茎段表面2次，获得预处理铁皮石斛茎段；
其中，所述预处理液由以下按照重量份的原料制成：茵陈蒿11份、富硒茶叶17份、甘草4.5份、亚硒酸钠0.14份；所述预处理液的制备方法如下：称取茵陈蒿、富硒茶叶和甘草，分别清洗、烘干、粉碎后，合并，加入6倍重量的乙醇水溶液，浸泡2h，加热回流提取48min，过滤，获得回流提取液和回流提取残渣，向回流提取残渣中加入3倍重量的乙醇水溶液，浸泡2h，超声波处理38min，过滤，获得超声波提取液和超声波提取残渣，将超声波提取液与回流提取液合并，减压蒸发浓缩为原体积的25%，然后加入亚硒酸钠，搅拌溶解后，即得预处理液；
3）将预处理铁皮石斛茎段沿横截面切成薄片，获得组织薄片；
4）将组织薄片放入诱导培养基中，在20℃、无光照的条件下进行原球茎的萌发，获得原球茎，其中，所述诱导培养基采用1/2MS培养基并加入10g/L蛋白胨、0.3mg/L的亚硒酸钠和0.4g/L的壳聚糖，混合均匀后，灭菌处理，即可；
5）将原球茎接种于增殖培养基中，在25℃、光照8h/d、光照强度60lux的条件下进行原球茎的增殖，获得增殖原球茎，其中，所述增殖培养基采用1/2MS培养基并加入10g/L蔗糖、5g/L琼脂、0.3mg/L的亚硒酸钠、0.5g/L的壳聚糖和0.2g/L的吲哚乙酸，混合均匀后，灭菌处理，即可；
6）将增殖原球茎接种于分化培养基中，在25℃、光照10h/d、光照强度150lux的条件下进行诱导丛芽，获得诱导分化的丛芽，其中，所述分化培养基采用MS培养基并加入20g/L蔗糖、10g/L琼脂、0.5mg/L的亚硒酸钠、0.8g/L的壳聚糖和10mg/L 6-苄氨基嘌呤，混合均匀后，灭菌处理，即可；
7）将诱导分化的丛芽切割分离成单芽，然后接种至生根培养基中，在30℃、光照12h/d、光照强度300lux的条件下进行诱导不定根，获得长有不定根的芽苗，其中，所述生根培养基采用MS培养基并加入20g/L香蕉汁、10g/L蛋白胨、0.4mg/L的亚硒酸钠、0.5g/L的壳聚糖和0.2g/L萘乙酸，混合均匀后，灭菌处理，即可；
8）将芽苗接种至壮苗培养基中，在30℃、光照12h/d、光照强度300lux的条件下进行培养，获得高度为6-7cm、根长为1-2cm的成苗，即可，其中，所述壮苗培养基采用MS培养基并加入20g/L土豆汁、15g/L蛋白胨、0.2mg/L的亚硒酸钠、0.3mg/L多效唑和0.1g/L萘乙酸，混合均匀后，灭菌处理，即可。
实施例5
一种提高硒含量的富硒铁皮石斛苗组培方法，步骤如下：
1）取富硒铁皮石斛茎段，采用无菌水清洗表面的污物，然后放入0.1%的氯化汞溶液中浸泡5min，再用无菌水冲洗4次，获得无菌铁皮石斛茎段；
2）将无菌铁皮石斛茎段浸入预处理液中，浸泡处理50min，然后采用无菌水冲洗茎段表面3次，获得预处理铁皮石斛茎段；
其中，所述预处理液由以下按照重量份的原料制成：茵陈蒿12份、富硒茶叶20份、甘草6份、亚硒酸钠0.2份；所述预处理液的制备方法如下：称取茵陈蒿、富硒茶叶和甘草，分别清洗、烘干、粉碎后，合并，加入7倍重量的乙醇水溶液，浸泡2h，加热回流提取50min，过滤，获得回流提取液和回流提取残渣，向回流提取残渣中加入4倍重量的乙醇水溶液，浸泡3h，超声波处理40min，过滤，获得超声波提取液和超声波提取残渣，将超声波提取液与回流提取液合并，减压蒸发浓缩为原体积的25%，然后加入亚硒酸钠，搅拌溶解后，即得预处理液；
3）将预处理铁皮石斛茎段沿横截面切成薄片，获得组织薄片；
4）将组织薄片放入诱导培养基中，在20℃、无光照的条件下进行原球茎的萌发，获得原球茎，其中，所述诱导培养基采用1/2MS培养基并加入10g/L蛋白胨、0.3mg/L的亚硒酸钠和0.4g/L的壳聚糖，混合均匀后，灭菌处理，即可；
5）将原球茎接种于增殖培养基中，在25℃、光照8h/d、光照强度60lux的条件下进行原球茎的增殖，获得增殖原球茎，其中，所述增殖培养基采用1/2MS培养基并加入10g/L蔗糖、5g/L琼脂、0.3mg/L的亚硒酸钠、0.5g/L的壳聚糖和0.2g/L的吲哚乙酸，混合均匀后，灭菌处理，即可；
6）将增殖原球茎接种于分化培养基中，在30℃、光照10h/d、光照强度150lux的条件下进行诱导丛芽，获得诱导分化的丛芽，其中，所述分化培养基采用MS培养基并加入20g/L蔗糖、10g/L琼脂、0.5mg/L的亚硒酸钠、0.8g/L的壳聚糖和10mg/L 6-苄氨基嘌呤，混合均匀后，灭菌处理，即可；
7）将诱导分化的丛芽切割分离成单芽，然后接种至生根培养基中，在30℃、光照12h/d、光照强度300lux的条件下进行诱导不定根，获得长有不定根的芽苗，其中，所述生根培养基采用MS培养基并加入20g/L香蕉汁、10g/L蛋白胨、0.4mg/L的亚硒酸钠、0.5g/L的壳聚糖和0.2g/L萘乙酸，混合均匀后，灭菌处理，即可；
8）将芽苗接种至壮苗培养基中，在30℃、光照12h/d、光照强度300lux的条件下进行培养，获得高度为6-7cm、根长为1-2cm的成苗，即可，其中，所述壮苗培养基采用MS培养基并加入20g/L土豆汁、15g/L蛋白胨、0.2mg/L的亚硒酸钠、0.3mg/L多效唑和0.1g/L萘乙酸，混合均匀后，灭菌处理，即可。
本发明组培方法能够培育出茁壮健康且硒含量高的富硒铁皮石斛苗，由于采用组培技术进行繁殖，增殖效率非常高，能够有效满足市场对富硒铁皮石斛苗的需求，具有广阔的市场前景。
上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (9)
1.一种提高硒含量的富硒铁皮石斛苗组培方法，其特征在于，步骤如下：
1）取富硒铁皮石斛茎段，采用无菌水清洗表面的污物，然后放入0.1%的氯化汞溶液中浸泡2-5min，再用无菌水冲洗3-4次，获得无菌铁皮石斛茎段；
2）将无菌铁皮石斛茎段浸入预处理液中，浸泡处理40-50min，然后采用无菌水冲洗茎段表面2-3次，获得预处理铁皮石斛茎段；
3）将预处理铁皮石斛茎段沿横截面切成薄片，获得组织薄片；
4）将组织薄片放入诱导培养基中，在20℃、无光照的条件下进行原球茎的萌发，获得原球茎；
5）将原球茎接种于增殖培养基中，在20-25℃、光照8h/d、光照强度50-60lux的条件下进行原球茎的增殖，获得增殖原球茎；
6）将增殖原球茎接种于分化培养基中，在25-30℃、光照10h/d、光照强度100-150lux的条件下进行诱导丛芽，获得诱导分化的丛芽；
7）将诱导分化的丛芽切割分离成单芽，然后接种至生根培养基中，在25-30℃、光照12h/d、光照强度200-300lux的条件下进行诱导不定根，获得长有不定根的芽苗；
8）将芽苗接种至壮苗培养基中，在25-30℃、光照12h/d、光照强度200-300lux的条件下进行培养，获得高度为6-7cm、根长为1-2cm的成苗，即可。
2.根据权利要求1所述的提高硒含量的富硒铁皮石斛苗组培方法，其特征在于，步骤2）中，所述预处理液由以下按照重量份的原料制成：茵陈蒿8-12份、富硒茶叶15-20份、甘草4-6份、亚硒酸钠0.1-0.2份。
3.根据权利要求2所述的提高硒含量的富硒铁皮石斛苗组培方法，其特征在于，步骤2）中，所述预处理液由以下按照重量份的原料制成：茵陈蒿10份、富硒茶叶17份、甘草5份、亚硒酸钠0.15份。
4.根据权利要求2所述的提高硒含量的富硒铁皮石斛苗组培方法，其特征在于，步骤2）中，所述预处理液的制备方法如下：称取茵陈蒿、富硒茶叶和甘草，分别清洗、烘干、粉碎后，合并，加入5-7倍重量的乙醇水溶液，浸泡1-2h，加热回流提取40-50min，过滤，获得回流提取液和回流提取残渣，向回流提取残渣中加入3-4倍重量的乙醇水溶液，浸泡2-3h，超声波处理30-40min，过滤，获得超声波提取液和超声波提取残渣，将超声波提取液与回流提取液合并，减压蒸发浓缩为原体积的25%，然后加入亚硒酸钠，搅拌溶解后，即得预处理液。
5.根据权利要求1-4任一所述的提高硒含量的富硒铁皮石斛苗组培方法，其特征在于，所述诱导培养基采用1/2MS培养基并加入10g/L蛋白胨、0.3mg/L的亚硒酸钠和0.4g/L的壳聚糖，混合均匀后，灭菌处理，即可。
6.根据权利要求5所述的提高硒含量的富硒铁皮石斛苗组培方法，其特征在于，所述增殖培养基采用1/2MS培养基并加入10g/L蔗糖、5g/L琼脂、0.3mg/L的亚硒酸钠、0.5g/L的壳聚糖和0.2g/L的吲哚乙酸，混合均匀后，灭菌处理，即可。
7.根据权利要求6所述的提高硒含量的富硒铁皮石斛苗组培方法，其特征在于，所述分化培养基采用MS培养基并加入20g/L蔗糖、10g/L琼脂、0.5mg/L的亚硒酸钠、0.8g/L的壳聚糖和10mg/L 6-苄氨基嘌呤，混合均匀后，灭菌处理，即可。
8.根据权利要求7所述的提高硒含量的富硒铁皮石斛苗组培方法，其特征在于，所述生根培养基采用MS培养基并加入20g/L香蕉汁、10g/L蛋白胨、0.4mg/L的亚硒酸钠、0.5g/L的壳聚糖和0.2g/L萘乙酸，混合均匀后，灭菌处理，即可。
9.根据权利要求8所述的提高硒含量的富硒铁皮石斛苗组培方法，其特征在于，所述壮苗培养基采用MS培养基并加入20g/L土豆汁、15g/L蛋白胨、0.2mg/L的亚硒酸钠、0.3mg/L多效唑和0.1g/L萘乙酸，混合均匀后，灭菌处理，即可。
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|---|---|---|---|---|
| CN116369205A (zh) * | 2023-04-24 | 2023-07-04 | 安新县益农农业科技有限公司 | 一种富硒小麦育种方法 |
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| CN103168691A (zh) * | 2013-03-28 | 2013-06-26 | 浙江亚林生物科技股份有限公司 | 一种富硒、富铬铁皮石斛原球茎的培养方法 |
| CN107155898A (zh) * | 2017-07-21 | 2017-09-15 | 山东省农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一种铁皮石斛利用茎段薄片进行扩繁的方法 |
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