CN108207622A - 一种诱导石竹科植物开花的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种诱导石竹科植物开花的方法，具体地，本发明提供了一种诱导石竹科植物开花的方法，包括步骤：(a)将所述石竹科植物的无菌芽苗培养获得营养生长期的芽苗；(b)继续培养步骤(a)获得的所述营养生长期的芽苗，获得生殖生长转换期的芽苗；(c)对所述步骤(b)获得的所述生殖生长转换期的芽苗进行培养，生根获得开花的植株。本发明首次以石竹科植物的无菌芽苗为起始外植体，进行离体开花诱导，获得了有效的无菌花粉，建立了石竹科植物的离体开花诱导体系，为石竹的单倍体和双单倍体育种材料的培育奠定了可靠的基础。
Description
技术领域
本发明涉及石竹科植物培育领域，具体涉及一种诱导石竹科植物开花的方法。
背景技术
石竹(Dianthus caryophyllus)花色品种丰富、色泽清馨温雅，深受国内外消费者喜爱。尤其母亲节使用频度高。因此，创制石竹新种质具有较好的市场前景和经济效益。
多年来，通常以香石竹、重辣丝石竹、中国石竹作为起始材料，开展石竹的种质资源创新与创制研究，以解决石竹科植物的花瓣重数(花基数)、花色、株高、抗性及无性繁殖种性退化等问题。
杂交育种是培育石竹新品种所采用的最为常见方法。例如，以色列最大的香石竹种苗公司(Shemi种苗公司)有专门的育种专家培育新品种，主要采用杂交育种的方法。
分子育种技术在石竹的种质资源创制上也有少量应用。例如，Tanaka等利用正义RNA技术将CHS基因(查尔酮合成酶基因)导入香石竹，使花色变浅。Florigene公司将牵牛花的DFR基因导入白花的香石竹中，转化株积累了大量的花翠素，从而改变了花色。
然而，就香石竹为主的石竹的种质资源创制而言，常规杂交育种、分子育种等方法均已进入瓶颈期。目前，各大香石竹新品种培育公司和科研单位推出新品种的进度极其缓慢。
自然条件下，石竹的无菌花粉难以获得，致使石竹属的倍性材料创制困难。石竹在离体培养条件下，有开花的报道，但不见花粉或难以获得具有萌发活力的有效花粉。
因此，本领域迫切需要建立一种可获得有效的无菌花粉的石竹离体开花诱导体系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可获得有效的无菌花粉的石竹离体开花诱导体系。
本发明第一方面提供了一种诱导石竹科植物开花的方法，包括步骤：
(a)将所述石竹科植物的无菌芽苗培养获得营养生长期的芽苗；
(b)继续培养步骤(a)获得的所述营养生长期的芽苗，获得生殖生长转换期的芽苗；和
(c)对所述步骤(b)获得的所述生殖生长转换期的芽苗进行培养，生根获得开花的植株。
在另一优选例中，所述步骤(a)中，将所述芽苗置于MS培养基中培养2周。
在另一优选例中，所述步骤(a)中，将所述芽苗(较佳地，MS培养基中培养2周的芽苗)置于含0.01-3mg/L(较佳地，0.05-2.5mg/L，更佳地，0.08-1mg/L)多效唑和/或0.01-10mg/L(较佳地，0.05-5mg/L，更佳地，0.08-2mg/L)NH4NO3的MS培养基上，培养2-4周，获得所述营养生长期的芽苗。
在另一优选例中，所述步骤(b)中，将所述营养生长期的芽苗置于1/4MS培养基中培养2周。
在另一优选例中，所述步骤(b)中，将所述营养生长期的芽苗(较佳地，1/4MS培养基中培养2周的芽苗)置于含0.01-5mg/L(较佳地，0.05-3mg/L，更佳地，0.08-1mg/L)ZnSO4和/或0.05-10mg/L(较佳地，0.1-5mg/L，更佳地，0.2-3mg/L)H3BO3的1/2MS培养基中培养2-4周，获得所述生殖生长转换期的芽苗。
在另一优选例中，所述步骤(c)中，将所述生殖生长转换期的芽苗置于含0.01-5mg/L(较佳地，0.05-3mg/L，更佳地，0.08-1mg/L)ZnSO4和/或0.05-10mg/L(较佳地，0.1-5mg/L，更佳地，0.2-3mg/L)H3BO3和/或0.01-3mg/L(较佳地，0.05-2.5mg/L，更佳地，0.08-1mg/L)IBA的MS培养基中培养2周，获得生根的芽苗。
在另一优选例中，所述步骤(c)中，将所述生根的芽苗继续培养3-4周，获得所述开花的植株。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
(d)步骤(c)获得的开花的植株开花3－5天后，取花药，加入无菌水，获得花药和花粉混合液；
(e)将步骤(d)获得的所述花药和花粉混合液去上清，从而获得无菌花粉粒。
在另一优选例中，在步骤(d)中，所述无菌水的加入量为0.1-30ml，较佳地，0.5-15ml，更佳地，0.8-10ml，以总体积计。
在另一优选例中，所述石竹科植物选自下组：元红、中国石竹、五彩石竹、或其组合。
本发明第二方面提供了一种诱导石竹科植物开花的培养基组合，包括：
第一培养基；所述第一培养基包括含0.01-3mg/L(较佳地，0.05-2.5mg/L，更佳地，0.08-1mg/L)多效唑和/或0.01-10mg/L(较佳地，0.05-5mg/L，更佳地，0.08-2mg/L)NH4NO3的MS培养基；和/或
第二培养基；所述第二培养基包括含0.01-5mg/L(较佳地，0.05-3mg/L，更佳地，0.08-1mg/L)ZnSO4和/或0.05-10mg/L(较佳地，0.1-5mg/L，更佳地，0.2-3mg/L)H3BO3的1/2MS培养基；和/或
第三培养基；所述第三培养基包括含0.01-5mg/L(较佳地，0.05-3mg/L，更佳地，0.08-1mg/L)ZnSO4和/或0.05-10mg/L(较佳地，0.1-5mg/L，更佳地，0.2-3mg/L)H3BO3和/或0.01-3mg/L(较佳地，0.05-2.5mg/L，更佳地，0.08-1mg/L)IBA的MS培养基。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了石竹新品种元红的离体开花的图片。
图2显示了完整有效的石竹无菌花粉的图片。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次以石竹科植物的无菌芽苗为起始外植体，进行离体开花诱导，获得了有效的无菌花粉，建立了石竹科植物的离体开花诱导体系，为石竹的单倍体和双单倍体(DH系)育种材料的培育奠定了可靠的基础。在此基础上，本发明人完成了本发明。
MS培养基
本文所用的MS培养基是本领域目前使用最普遍的培养基，Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要,因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基(Murashigeand Skoog A revised medium for rapid growth and bio assays with tobaccotissue cultures.Physiol Plant,1962.15(3):473.)。除非另有说明，采用本领域已知的配方配制MS培养基或MS固体培养基即可。(罗林会等，费菜的离体快速繁殖.特种经济动植物，2003，6(10)：24)
1/2MS基本培养基是指将MS培养基中大量元素质量减半。大量元素是指硝酸钾KNO3、硝酸铵NH4NO3、磷酸二氢钾KH2PO4、硫酸镁MgSO4.7H2O和氯化钙CaCl2.2H2O等五种化合物。
1/4MS培养基是指大量元素的使用量为MS培养基的1/4。
多效唑
多效唑是一种矮壮素，用于生理性缩短细胞的长度，以达到矮壮的效果。
在本发明中，添加多效唑的目的与效果是使离体生长的植株矮化、粗壮。
本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得多效唑，如市场购买或用常规方法制取。
NH4NO3
NH4NO3是一种植物铵态氮源。在本发明中，添加NH4NO3的目的与效果是使离体培养的植株生长茂盛。
本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得NH4NO3，如市场购买或用常规方法制取。
ZnSO4
ZnSO4是一种矿质元素。
在本发明中，添加ZnSO4的目的与效果是锌离子浓度对植物生长效果不一。
本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得ZnSO4，如市场购买或用常规方法制取。
H3BO3
如本文所用，“H3BO3”、“硼酸”可互换使用，是一种化学药品，为植物开花所需要的。在本发明中，添加H3BO3的目的与效果是使得植物加速实现由营养生长到生殖生长的转换。
本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得H3BO3，如市场购买或用常规方法制取。
IBA
如本文所用，术语“IBA”、“吲哚丁酸”可互换使用。
IBA是一种生根促进激素，并且是一种广谱的吲哚类植物生长调节剂，是良好的生根剂，可促进草本和木本观赏植物插枝的生根。还可用于瓜果的座果，提高座果率。
在本发明中，添加IBA的目的与效果是为了促进生根，加快植物的生殖转换。
本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得IBA，如市场购买或用常规方法制取。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次能够程序化、公式化、批量化的获得有效(有活力)的花粉；
(2)用本发明的方法所获得的花粉的时间跨度比自然界短；
(3)本发明的方法所获得的花粉不受季节、气候条件及地域环境等因素的限制。
(4)本发明的方法不需将开花材料(如元红芽苗)消毒，可获得具有萌发活力的有效花粉。
(5)本发明首次以获得无菌花粉为目的，开展了石竹的离体开花诱导研究，取得良好效果，建立了石竹离体开花诱导体系，获得了有效的无菌花粉，为石竹的单倍体和双单倍体(DH系)育种材料的培育奠定了可靠的基础。
(6)本发明可获得单倍体，使得测序速度和精准度大大提高；可加速遗传育种进程；单倍体将可以像基因工程菌感受态一样商业化，其价值非常高。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
除非另有说明，否则本发明实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。
实施例1
(1)培养基准备
配制含0.1-0.3mg/L多效唑和0.1–1mg/L NH4NO3的MS培养基；配制含0.1-0.5mg/LZnSO4和0.5–1mg/L H3BO3的1/2MS培养基；同时配制含0.1-0.5mg/L ZnSO4、0.5–1mg/L H3BO3和0.1–0.3mg/L IBA(吲哚丁酸)的MS培养基。
(2)培养营养生长期芽苗
将石竹新品种元红(获自中国科学院上海生命科学院)的无菌芽苗接种在MS培养基中培养2周，之后将获得的元红芽苗接种在MS+0.1-0.3mg/L多效唑+0.1–1mg/L NH4NO3培养基中培养2－4周。
(3)培养生殖生长转换期芽苗
将步骤(2)获得的元红芽苗接种在1/4MS培养基中培养2周，之后获得的元红芽苗接种在1/2MS+0.1-0.5mg/L ZnSO4+0.5–1mg/L H3BO3培养基中培养2–4周。
(4)开花诱导
将步骤(3)获得的元红芽苗接种在MS+0.1-0.5mg/L ZnSO4+0.5–1mg/L H3BO3+0.1–0.3mg/L IBA(吲哚丁酸)培养基中培养2周时，芽苗生根；培养3-4周时，瓶苗开花(图1)。
(5)取花药
待步骤(4)获得的元红瓶苗开花3–5天，用镊子摘取花药，置入带小钢珠或硅砂珠(直径2mm)的10ml EP管中，加入无菌水1–5ml，200rpm 10–30min，去杂质，留上清液，获得花药花粉混合液。
(6)获得无菌花粉粒
将步骤(5)获得的花药花粉混合液转移至1ml EP管中，4000–5000rpm10min，去上清，留沉淀，沉淀部分多为无菌花粉粒(图2)。
用本发明的方法可获得开花的元红以及具有萌发活力的无菌花粉，并且具有萌发活力的无菌花粉的比例为80-95％，开花率为90％。
采用常规的方法，元红的具有萌发活力的无菌花粉的比例很低，接近于0。
因此，本发明的方法所培育的元红具有非常高的开花率以及具有萌发活力的无菌花粉率。
实施例2
本实施例的步骤与实施例1基本相同，不同之处采用中国石竹。
用本发明的方法可获得开花的中国石竹以及具有萌发活力的无菌花粉，并且具有萌发活力的无菌花粉的比例为80-95％，开花率为90％。
采用常规的方法，中国石竹的具有萌发活力的花粉的比例很低，接近于0。
因此，本发明的方法所培育的中国石竹具有非常高的开花率以及具有萌发活力的无菌花粉率。
实施例3
本实施例的步骤与实施例1基本相同，不同之处采用五彩石竹。
用本发明的方法可获得开花的五彩石竹以及具有萌发活力的花粉，并且具有萌发活力的花粉的比例为80-95％，开花率为90％。
采用常规的方法，五彩石竹的具有萌发活力的花粉的比例很低，接近于0。因此，本发明的方法所培育的五彩石竹具有非常高的开花率以及具有萌发活力的无菌花粉率。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种诱导石竹科植物开花的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将所述石竹科植物的无菌芽苗培养获得营养生长期的芽苗；
(b)继续培养步骤(a)获得的所述营养生长期的芽苗，获得生殖生长转换期的芽苗；和
(c)对所述步骤(b)获得的所述生殖生长转换期的芽苗进行培养，生根获得开花的植株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，将所述芽苗置于含0.01-3mg/L多效唑和/或0.01-10mg/L NH4NO3的MS培养基上，培养2-4周，获得所述营养生长期的芽苗。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，将所述营养生长期的芽苗置于1/4MS培养基中培养2周。
4.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，将所述营养生长期的芽苗置于含0.01-5mg/L ZnSO4和/或0.05-10mg/L H3BO3的1/2MS培养基中培养2-4周，获得所述生殖生长转换期的芽苗。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)中，将所述生殖生长转换期的芽苗置于含0.01-5mg/L ZnSO4和/或0.05-10mg/L H3BO3和/或0.01-3mg/L IBA的MS培养基中培养2周，获得生根的芽苗。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)中，将所述生根的芽苗继续培养3-4周，获得所述开花的植株。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：
(d)步骤(c)获得的开花的植株开花3－5天后，取花药，加入无菌水，获得花药和花粉混合液；和
(e)将步骤(d)获得的所述花药和花粉混合液去上清，从而获得无菌花粉粒。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中，所述无菌水的加入量为0.1-30ml，较佳地，0.5-15ml，更佳地，0.8-10ml，以总体积计。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述石竹科植物选自下组：元红、中国石竹、五彩石竹、或其组合。
10.一种诱导石竹科植物开花的培养基组合，其特征在于，包括：
第一培养基；所述第一培养基包括含0.01-3mg/L多效唑和/或0.01-10mg/L NH4NO3的MS培养基；和/或
第二培养基；所述第二培养基包括含0.01-5mg/L ZnSO4和/或0.05-10mg/L H3BO3的1/2MS培养基；和/或
第三培养基；所述第三培养基包括含0.01-5mg/L ZnSO4和/或0.05-10mg/L H3BO3和/或0.01-3mg/L IBA的MS培养基。
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