CN108203728A - 一种鱼鳞胶原蛋白肽的制备方法 - Google Patents

一种鱼鳞胶原蛋白肽的制备方法 Download PDF

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CN108203728A CN201810054073.7A CN201810054073A CN108203728A CN 108203728 A CN108203728 A CN 108203728A CN 201810054073 A CN201810054073 A CN 201810054073A CN 108203728 A CN108203728 A CN 108203728A
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刘思聪
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Abstract

本发明提供一种鱼鳞胶原蛋白肽的制备方法，是将原材料鱼鳞进行清洗干燥，再进行预处理得到脱钙、脱色及脱杂蛋白的鱼鳞，取预处理后脱钙、脱色及脱杂蛋白的鱼鳞浸泡于温度不低于室温的碱液中至少3小时，并在浸泡过程中伴以搅拌；浸泡时间到达后，调节溶液pH值至5‑13，再加入蛋白酶，调节溶液温度不低于30℃，并在搅拌条件下继续浸泡至少3小时，然后对溶液依次进行灭酶处理、纯化及冷冻干燥，即得到鱼鳞胶原蛋白肽。该方法利用碱法接酶法两步法制备得到胶原蛋白肽分子量集中分布且低于6.5kD，残渣率低于20％，制备全过程耗时能低至23h左右。

Description

一种鱼鳞胶原蛋白肽的制备方法
技术领域
本发明属于天然产物提取领域，具体涉及一种鱼鳞胶原蛋白肽的制备方法。
背景技术
胶原蛋白肽是胶原蛋白的水解产物，一般采用酸法、碱法和酶法等方法水解得到，水解后的蛋白结构完全被破坏，不受共价键束缚，形成分散的肽段。通常由2-10个氨基酸通过肽键形成的直链肽称为寡肽或小肽，由肽键结合起来的多于10个氨基酸的聚合体则称为多肽，分子量一般低于10kD。研究表明，蛋白质在胃肠道消化酶的作用下，最终分解成游离氨基酸和2-6肽，这些肽在小肠绒毛膜刷状缘受到氨肽酶N、氨肽酶A的作用，最后大多以游离氨基酸和小肽的形式被完整地吸收，再转运进入血液循环(陈勇,曹永辛,王锋.小肽吸收机制及营养作用[J])。且小肽的吸收机制与氨基酸完全不同，与氨基酸吸收相比：(1)肽中氨基酸残基吸收速度大于等量游离氨基酸吸收速度；(2)肽吸收可避免氨基酸之间的吸收竞争；(3)肽吸收耗能低；(4)寡肽与游离氨基酸的吸收是相互独立的完全不同的机制。因此寡肽较易吸收，比游离氨基酸具有更多的优越性(冯秀燕,计成.寡肽在蛋白质营养中的作用[J].动物营养学报,2001,(03):8-13；Matthews DM.Rates of peptide uptake bysmall intestine.Ciba Foundation symposium,1971:71-92)。并且多肽的氨基酸数量及组成序列决定了其自身的功能活性，报道(赵利,苏伟,胡火根,戴银根,杨玉玲.胶原蛋白生物活性肽的研究进展[J].食品科学,2005,(09):560-564.)中指出胶原蛋白肽具有抑制血管紧张素转化酶(ACE)活性，抑制血小板凝集活性，抗氧化性，抗肿瘤活性等多种生物活性，可以广泛应用于食品、保健品及化妆品等领域。
鱼鳞是鱼真皮层的变形物，是与外界接触的边缘组织，起到保护鱼体的作用，其重量一般为鱼体重量的1％～5％。鱼鳞大体上可以分为楯鳞、硬鳞及骨鳞三类，其中骨鳞较为常见。骨鳞常见于硬骨鱼中，横断面分为上下两层，上层为骨质层，主要成分为羟基磷灰石，并零散地分散着一些胶原纤维；下层为纤维层，主要成分为胶原纤维，其中大多数为Ⅰ型胶原并含有极少量的Ⅴ型胶原。鱼鳞中胶原蛋白的含量约占鱼鳞总重量的40％～60％，鱼鳞胶原蛋白肽具有溶解性高、热稳定性好、易吸收等特点，为胶原蛋白的开发利用提供了丰富的原材料。
目前用于制备鱼鳞胶原蛋白肽的方法一般有三种：酸法、碱法和酶法，最常用的方法为酶解法。
其中，酸或碱对胶原蛋白有很好的溶出作用，适当的升高温度可快速分解胶原蛋白为胶原蛋白肽。虽然Corfield,MC等(Corfield MC,Robson A.Amino acid compositionof wool[J].Biochemical Journal,1955,(59)1:62-68)提到酸水解法会引起色氨酸的部分被破坏，但樊绘曾等(樊绘曽,范积芬.以酸碱水解法生产水解蛋白的条件探讨[J].药学学报,1962,9(01):58-59.)也指出酸法水解产品保存了旋光活性，水解速度快，被破坏的色氨酸可用人工合成品(消旋体)进行补充。郑巧东等(郑巧东,贠军贤,林东强,姚善泾.胶原蛋白酸解为胶原多肽的动力学研究[J].中国皮革,2005,34(11):21-23+27.)就以从鸭掌中制备得到的胶原蛋白为原料，采用酸法进行水解，虽然缩短了制备反应时间，但得到的多肽分子质量分布不均匀且分布范围广，最小分子量达到了1.7kD而最大分子质量甚至超过了40kD。而碱法水解速度快，能够保存人体需要的色氨酸。张晓霞等(张晓霞,刘盛取,李国英.碱法水解黑鱼鱼鳞及制备多肽螯合钙工艺的研究[J].食品科技,2010,35(12):130-134.)采用碱法直接水解未预处理鱼鳞，采用正交实验优选鱼鳞的最佳水解条件为：液比1:10，氢氧化钠浓度1.0M，温度50℃，水解时间6h，但电泳分析结果显示，水解鱼鳞多肽的分子量分布范围较广，大部分在14.2kD以下，主要集中在6.5kD，且残渣率接近50％。因此，利用单一酸或碱水解制备胶原蛋白肽存在得到的多肽分子质量分布不均匀且分布范围广，且残渣率高的问题，不利于对胶原蛋白肽的进一步利用，往往需要通过超滤等方法去除大分子肽等非目标产物，成本高，耗时长。
较酸法和碱法而言，酶法条件温和，过程易控，由于鱼鳞致密的结构，酶解前需要进行预处理，提取鱼鳞胶原或鱼鳞明胶后再酶解为小肽，但传统酶法水解鱼鳞制备所得鱼鳞胶原蛋白肽分子量分布范围广，都需要超滤等方法去除大分子肽等非目标产物，成本高，耗时长。例如，涂宗财等(涂宗财,陈剑兵,刘伟,刘成梅.酶解鱼鳞胶制备小分子多肽的研究[J].食品科学,2005,26(08):210-213.)利用混合蛋白酶阶段酶解提取小分子肽，再经脱色、脱臭、超滤膜分离后，利用反渗透提纯精制，虽然最终得到含有部分二肽、三肽的产品，但后续超滤及反渗透技术处理成本高，耗时长；廉志清等(廉志清,王金,任涛,彭小文,万端极.酶法耦合膜技术制备鱼鳞胶原蛋白低聚肽的研究[J].化学与生物工程,2009,26(08):64-66.)用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶复合酶解鱼鳞，利用三级膜纯化、分离酶解液，经冷冻干燥后获得胶原蛋白低聚肽；中国专利公布号CN.102154424A中发明人利用高温硫酸提取胶原蛋白肽，再经离心机协同膜分离纯化，酶解得到小分子鱼鳞胶原蛋白肽；中国专利公布号CN.103540635A中发明人酶解后再经硅藻土过滤、超滤获得分子量低于5kD的鱼鳞胶原蛋白肽。
以上现有技术在水解鱼鳞胶原蛋白时都需要搭配使用膜分离技术才能获得分子量小且集中分布的胶原蛋白肽，膜分离技术通常包括微滤、超滤、纳滤、反渗透、渗析以及液膜分离等方法，其中超滤常用于大分子有机物如蛋白质、细菌的分离，超滤以膜两侧的压力差为驱动力，以超滤膜为过滤介质，在一定的压力下，当水流过膜表面时，只允许水及比膜孔径小的小分子物质通过，可以截留分子量范围在1000～300000kD的物质，从而对不同分子量的蛋白质进行分离。但超滤膜使用寿命有限，易堵塞，需定时清洗及更换，且经过试验，使用超滤法分离蛋白质对液体要求较高，且耗时长，不利于推广大规模使用。因此造成了制备鱼鳞胶原蛋白肽成本高、耗时长的问题，制约了鱼鳞胶原蛋白肽的利用与发展。
发明内容
本发明的目的是针对现有方法的不足之处，提供一种鱼鳞胶原蛋白肽的制备方法，该方法利用碱法接酶法两步法制备得到分子量小且分布集中的鱼鳞胶原蛋白肽产品，进一步提高了鱼鳞中胶原蛋白肽的提取率及水解度，并降低成本，胶原蛋白肽分子量集中分布且低于6.5kD，残渣率低于20％，制备全过程耗时能低至19h左右。
为实现上述目的，本发明是采用由以下技术措施构成的技术方案来实现的。
一种鱼鳞胶原蛋白肽的制备方法，是将原材料鱼鳞进行清洗干燥，再进行预处理得到脱钙、脱色及脱杂蛋白的鱼鳞，其特征在于取预处理后脱钙、脱色及脱杂蛋白的鱼鳞浸泡于温度不低于室温的碱液中至少3小时，并在浸泡过程中伴以搅拌；浸泡时间到达后，调节溶液pH值至5-13，再加入蛋白酶，调节溶液温度不低于30℃，并在搅拌条件下继续浸泡至少3小时，然后对溶液依次进行灭酶处理、纯化及冷冻干燥，即得到鱼鳞胶原蛋白肽。所得鱼鳞胶原蛋白肽为分子量集中分布且分子量低于6.5kD的鱼鳞胶原蛋白肽。
其中，所述原材料鱼鳞为硬骨鱼鱼鳞。例如黑鱼鱼鳞，通常而言，选用胶原蛋白含量丰富的硬骨鱼鱼鳞皆可。
其中，所述蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶和动物蛋白酶中的一种或者任意两种混合。
通常而言，所述灭酶处理为将溶液在100℃沸水浴中加热至少10分钟终止酶解反应。
通常而言，所述纯化为将含鱼鳞胶原蛋白肽的溶液进行离心去除鱼鳞残渣并脱盐。
进一步具体地，是取预处理后脱钙、脱色及脱杂蛋白的鱼鳞浸泡于温度保持在40-80℃、浓度为2-10％的NaOH溶液中至少6小时，并在浸泡过程中伴以搅拌；浸泡时间到达后，调节溶液pH值至6-12，再加入蛋白酶，调节溶液温度为40-70℃，保持该温度并在搅拌条件下继续浸泡至少4小时，然后对溶液依次进行灭酶处理、纯化及冷冻干燥，即得到鱼鳞胶原蛋白肽。所得鱼鳞胶原蛋白肽为分子量集中分布且分子量低于6.5kD的鱼鳞胶原蛋白肽。
通常，所述进行预处理得到脱钙、脱色及脱杂蛋白的鱼鳞，是通过现有技术对鱼鳞进行脱钙、脱色及脱杂蛋白的预处理，为了更好的说明本发明，本发明提供下述预处理步骤：
a.按重量份数计，取清洗干燥后的鱼鳞100份，浸泡在800-2000份浓度为1-5％的HCl溶液中1-3h，浸泡过程中拌以搅拌；浸泡时间到达后，分离出鱼鳞，再分别依次用浓度为0.1-1％的NaOH溶液和水进行淘洗，然后分离出淘洗后的鱼鳞；
b.按重量份数计，将步骤a处理后的鱼鳞浸泡在300-1000份浓度为1-5％的H2O2溶液中，调节溶液pH值至8-12，浸泡处理2-5h，浸泡过程中伴以搅拌；浸泡时间到达后，分离出鱼鳞，再用水进行淘洗，然后分离出淘洗后的鱼鳞；
c.按重量份数计，将步骤b处理后的鱼鳞浸泡在400-800份浓度为5-10％的NaCl溶液中12-24h，浸泡过程中拌以搅拌；浸泡时间到达后，分离出鱼鳞，再分别依次用水和去离子水进行淘洗，然后分离出淘洗后的鱼鳞，自然阴干。
进一步地，所述取预处理后脱钙、脱色及脱杂蛋白的鱼鳞浸泡于温度不低于室温的碱液中至少3小时，是按重量份数计，将步骤c处理后的鱼鳞浸泡在至少200份温度不低于室温、浓度为1-20％的NaOH溶液中至少3小时。
进一步地，是按重量份数计，将步骤c处理后的鱼鳞浸泡在400-800份温度保持在40-80℃、浓度为2-10％的NaOH溶液中至少6小时。
进一步地，所述加入蛋白酶，是按重量份数计，加入1-10份蛋白酶。优选1-5份蛋白酶
通常地，上述制备方法中所述浸泡为将溶液完全浸没鱼鳞。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明制备方法采用碱法接酶法两步法水解鱼鳞得到胶原蛋白肽，进一步提高了鱼鳞中胶原蛋白肽的提取率及水解度，胶原蛋白肽分子量集中分布且分子量能够达到低于6.5kD，残渣率低于20％。
2、本发明制备方法简便，总体耗时短，包含预处理的全制备过程耗时低至19h左右，不包含预处理的制备过程耗时低至6h，且预处理能与现有制备方法通用，最后所得胶原蛋白肽不需要利用膜分离技术即可实现分子量集中分布且分子量能够低于6.5kD，省去了膜分离技术所需的仪器使用及耗材成本。
3、本发明制备方法通过碱法接酶法两步法水解鱼鳞得到胶原蛋白肽，其中碱法直接破坏了鱼鳞中胶原蛋白结构，得到分子量分布范围较广的胶原蛋白肽，再通过酶法将分子量较大的胶原蛋白肽进行分解，从而最后得到分子量集中分布且分子量能够低于6.5kD的胶原蛋白肽。
4、本发明的原材料来源广泛，充分利用鱼鳞废弃物，提升淡水鱼产品的附加值。
附图说明
图1为本发明实施例1与蛋白质标准品的Tricine-SDS-PAGE电泳分离对比图，其中，左侧0号条带显示实施例1所得鱼鳞胶原蛋白肽的分子量分布结果，右侧蛋白质标准品带显示蛋白质标准品的分子量分布结果。
具体实施方式
下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步说明。值得指出的是，给出的实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员根据本发明的内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍应属于本发明保护范围。
实施例1
本实施例为采用黑鱼鱼鳞进行胶原蛋白肽的制备，包括以下步骤：
(1)前处理：
选择黑鱼鱼鳞作为原材料，用自来水淘洗黑鱼鱼鳞，自然晾干，备用；
(2)预处理：
a.按重量份数计，取清洗干燥后的黑鱼鱼鳞100份，浸泡在1000份浓度为1.8％的HCl溶液中3h，浸泡过程中拌以搅拌；浸泡时间到达后，分离出鱼鳞，再分别依次用400份浓度为0.2％的NaOH溶液和自来水进行淘洗，然后分离出淘洗后的黑鱼鱼鳞；
b.按重量份数计，将步骤a处理后的黑鱼鱼鳞浸泡在400份浓度为2％的H2O2溶液中，用NaOH调节溶液pH值至10.5，浸泡处理2.5h，浸泡过程中伴以搅拌；浸泡时间到达后，分离出黑鱼鱼鳞，再用自来水进行淘洗，然后分离出淘洗后的黑鱼鱼鳞；
c.按重量份数计，将步骤b处理后的黑鱼鱼鳞浸泡在400份浓度为7.5％的NaCl溶液中12h，浸泡过程中拌以搅拌；浸泡时间到达后，分离出黑鱼鱼鳞，再分别依次用自来水和蒸馏水进行淘洗，然后分离出淘洗后的黑鱼鱼鳞，自然阴干。
(3)水解：
按重量份数计，将步骤c处理后的黑鱼鱼鳞浸泡在500份温度保持在50℃、浓度为4％的NaOH溶液中6小时，并在浸泡过程中伴以搅拌；浸泡时间到达后，调节溶液pH值至10，再加入1份碱性蛋白酶，调节溶液温度为50℃，保持该温度在搅拌条件下继续浸泡6小时，然后将溶液在100℃水浴中灭酶10min，再依次纯化及冷冻干燥，即得到黑鱼鱼鳞胶原蛋白肽。所得黑鱼鱼鳞胶原蛋白肽为分子量集中分布且分子量低于6.5kD的胶原蛋白肽，分子量检测结果如图1所示，残渣率为15％。
实施例2
本实施例为采用黑鱼鱼鳞进行胶原蛋白肽的制备，包括以下步骤：
(1)前处理：
选择黑鱼鱼鳞作为原材料，用自来水淘洗黑鱼鱼鳞，自然晾干，备用；
(2)预处理：
a.按重量份数计，取清洗干燥后的黑鱼鱼鳞100份，浸泡在1000份浓度为1.8％的HCl溶液中3h，浸泡过程中拌以搅拌；浸泡时间到达后，分离出鱼鳞，再分别依次用400份浓度为0.2％的NaOH溶液和自来水进行淘洗，然后分离出淘洗后的黑鱼鱼鳞；
b.按重量份数计，将步骤a处理后的黑鱼鱼鳞浸泡在400份浓度为2％的H2O2溶液中，用NaOH调节溶液pH值至10.5，浸泡处理2.5h，浸泡过程中伴以搅拌；浸泡时间到达后，分离出黑鱼鱼鳞，再用自来水进行淘洗，然后分离出淘洗后的黑鱼鱼鳞；
c.按重量份数计，将步骤b处理后的黑鱼鱼鳞浸泡在400份浓度为7.5％的NaCl溶液中12h，浸泡过程中拌以搅拌；浸泡时间到达后，分离出黑鱼鱼鳞，再分别依次用自来水和蒸馏水进行淘洗，然后分离出淘洗后的黑鱼鱼鳞，自然阴干。
(3)水解：
按重量份数计，将步骤c处理后的黑鱼鱼鳞浸泡在700份温度保持在50℃、浓度为4％的NaOH溶液中6小时，并在浸泡过程中伴以搅拌；浸泡时间到达后，调节溶液pH值至10，再加入1.5份碱性蛋白酶，调节溶液温度为50℃，保持该温度在搅拌条件下继续浸泡6小时，然后将溶液在100℃水浴中灭酶10min，再依次纯化及冷冻干燥，即得到黑鱼鱼鳞胶原蛋白肽。所得黑鱼鱼鳞胶原蛋白肽为分子量集中分布且分子量低于6.5kD的胶原蛋白肽，残渣率为13.9％。
实施例3
本实施例为采用黑鱼鱼鳞进行胶原蛋白肽的制备，包括以下步骤：
(1)前处理：
选择黑鱼鱼鳞作为原材料，用自来水淘洗黑鱼鱼鳞，自然晾干，备用；
(2)预处理：
a.按重量份数计，取清洗干燥后的黑鱼鱼鳞100份，浸泡在1500份浓度为1％的HCl溶液中3h，浸泡过程中拌以搅拌；浸泡时间到达后，分离出鱼鳞，再分别依次用400份浓度为0.2％的NaOH溶液和自来水进行淘洗，然后分离出淘洗后的黑鱼鱼鳞；
b.按重量份数计，将步骤a处理后的黑鱼鱼鳞浸泡在400份浓度为2％的H2O2溶液中，用NaOH调节溶液pH值至10.5，浸泡处理2.5h，浸泡过程中伴以搅拌；浸泡时间到达后，分离出黑鱼鱼鳞，再用自来水进行淘洗，然后分离出淘洗后的黑鱼鱼鳞；
c.按重量份数计，将步骤b处理后的黑鱼鱼鳞浸泡在400份浓度为7.5％的NaCl溶液中12h，浸泡过程中拌以搅拌；浸泡时间到达后，分离出黑鱼鱼鳞，再分别依次用自来水和蒸馏水进行淘洗，然后分离出淘洗后的黑鱼鱼鳞，自然阴干。
(3)水解：
按重量份数计，将步骤c处理后的黑鱼鱼鳞浸泡在400份温度保持在80℃、浓度为4％的NaOH溶液中32小时，并在浸泡过程中伴以搅拌；浸泡时间到达后，调节溶液pH值至7，再加入1份木瓜蛋白酶，调节溶液温度为60℃，保持该温度在搅拌条件下继续浸泡6小时，然后将溶液在100℃水浴中灭酶10min，再依次纯化及冷冻干燥，即得到黑鱼鱼鳞胶原蛋白肽。所得黑鱼鱼鳞胶原蛋白肽为分子量集中分布且分子量低于6.5kD的胶原蛋白肽，残渣率为17％。
实施例4
本实施例为采用黑鱼鱼鳞进行胶原蛋白肽的制备，包括以下步骤：
(1)前处理：
选择黑鱼鱼鳞作为原材料，用自来水淘洗黑鱼鱼鳞，自然晾干，备用；
(2)预处理：
a.按重量份数计，取清洗干燥后的黑鱼鱼鳞100份，浸泡在800份浓度为5％的HCl溶液中1h，浸泡过程中拌以搅拌；浸泡时间到达后，分离出鱼鳞，再分别依次用400份浓度为1％的NaOH溶液和自来水进行淘洗，然后分离出淘洗后的黑鱼鱼鳞；
b.按重量份数计，将步骤a处理后的黑鱼鱼鳞浸泡在400份浓度为2％的H2O2溶液中，用NaOH调节溶液pH值至10.5，浸泡处理2.5h，浸泡过程中伴以搅拌；浸泡时间到达后，分离出黑鱼鱼鳞，再用自来水进行淘洗，然后分离出淘洗后的黑鱼鱼鳞；
c.按重量份数计，将步骤b处理后的黑鱼鱼鳞浸泡在400份浓度为7.5％的NaCl溶液中12h，浸泡过程中拌以搅拌；浸泡时间到达后，分离出黑鱼鱼鳞，再分别依次用自来水和蒸馏水进行淘洗，然后分离出淘洗后的黑鱼鱼鳞，自然阴干。
(3)水解：
按重量份数计，将步骤c处理后的黑鱼鱼鳞浸泡在400份温度保持在80℃、浓度为4％的NaOH溶液中32小时，并在浸泡过程中伴以搅拌；浸泡时间到达后，调节溶液pH值至7，再加入4份碱性蛋白酶，调节溶液温度为60℃，保持该温度在搅拌条件下继续浸泡6小时，然后将溶液在100℃水浴中灭酶10min，再依次纯化及冷冻干燥，即得到黑鱼鱼鳞胶原蛋白肽。所得黑鱼鱼鳞胶原蛋白肽为分子量集中分布且分子量低于6.5kD的胶原蛋白肽，残渣率为14.5％。
实施例5
本实施例为采用鲤鱼鱼鳞进行胶原蛋白肽的制备，包括以下步骤：
(1)前处理：
选择鲤鱼鱼鳞作为原材料，用自来水淘洗鲤鱼鱼鳞，自然晾干，备用；
(2)预处理：
a.按重量份数计，取清洗干燥后的鲤鱼鱼鳞100份，浸泡在800份浓度为5％的HCl溶液中1h，浸泡过程中拌以搅拌；浸泡时间到达后，分离出鱼鳞，再分别依次用600份浓度为0.1％的NaOH溶液和自来水进行淘洗，然后分离出淘洗后的鲤鱼鱼鳞；
b.按重量份数计，将步骤a处理后的鲤鱼鱼鳞浸泡在300份浓度为5％的H2O2溶液中，用NaOH调节溶液pH值至8，浸泡处理2h，浸泡过程中伴以搅拌；浸泡时间到达后，分离出鲤鱼鱼鳞，再用自来水进行淘洗，然后分离出淘洗后的鲤鱼鱼鳞；
c.按重量份数计，将步骤b处理后的鲤鱼鱼鳞浸泡在400份浓度为10％的NaCl溶液中24h，浸泡过程中拌以搅拌；浸泡时间到达后，分离出鲤鱼鱼鳞，再分别依次用自来水和蒸馏水进行淘洗，然后分离出淘洗后的鲤鱼鱼鳞，自然阴干。
(3)水解：
按重量份数计，将步骤c处理后的鲤鱼鱼鳞浸泡在800份温度保持在80℃、浓度为1％的NaOH溶液中24小时，并在浸泡过程中伴以搅拌；浸泡时间到达后，调节溶液pH值至13，再加入10份碱性蛋白酶，调节溶液温度为70℃，保持该温度在搅拌条件下继续浸泡3小时，然后将溶液在100℃水浴中灭酶10min，再依次纯化及冷冻干燥，即得到鲤鱼鱼鳞胶原蛋白肽。所得鲤鱼鱼鳞胶原蛋白肽为分子量集中分布且分子量低于6.5kD的胶原蛋白肽。
实施例6
本实施例为采用草鱼鱼鳞进行胶原蛋白肽的制备，包括以下步骤：
(1)前处理：
选择草鱼鱼鳞作为原材料，用自来水淘洗草鱼鱼鳞，自然晾干，备用；
(2)预处理：
a.按重量份数计，取清洗干燥后的草鱼鱼鳞100份，浸泡在2000份浓度为1％的HCl溶液中3h，浸泡过程中拌以搅拌；浸泡时间到达后，分离出鱼鳞，再分别依次用200份浓度为1％的NaOH溶液和自来水进行淘洗，然后分离出淘洗后的草鱼鱼鳞；
b.按重量份数计，将步骤a处理后的草鱼鱼鳞浸泡在1000份浓度为1％的H2O2溶液中，用NaOH调节溶液pH值至12，浸泡处理5h，浸泡过程中伴以搅拌；浸泡时间到达后，分离出草鱼鱼鳞，再用自来水进行淘洗，然后分离出淘洗后的草鱼鱼鳞；
c.按重量份数计，将步骤b处理后的草鱼鱼鳞浸泡在800份浓度为5％的NaCl溶液中24h，浸泡过程中拌以搅拌；浸泡时间到达后，分离出草鱼鱼鳞，再分别依次用自来水和蒸馏水进行淘洗，然后分离出淘洗后的草鱼鱼鳞，自然阴干。
(3)水解：
按重量份数计，将步骤c处理后的草鱼鱼鳞浸泡在200份温度保持在40℃、浓度为18％的NaOH溶液中3小时，并在浸泡过程中伴以搅拌；浸泡时间到达后，调节溶液pH值至5，再加入1份胰蛋白酶，调节溶液温度为30℃，保持该温度在搅拌条件下继续浸泡5小时，然后将溶液在100℃水浴中灭酶10min，再依次纯化及冷冻干燥，即得到草鱼鱼鳞胶原蛋白肽。所得草鱼鱼鳞胶原蛋白肽为分子量集中分布且分子量低于6.5kD的胶原蛋白肽。

Claims (10)

1.一种鱼鳞胶原蛋白肽的制备方法，是将原材料鱼鳞进行清洗干燥，再进行预处理得到脱钙、脱色及脱杂蛋白的鱼鳞，其特征在于取预处理后脱钙、脱色及脱杂蛋白的鱼鳞浸泡于温度不低于室温的碱液中至少3小时，并在浸泡过程中伴以搅拌；浸泡时间到达后，调节溶液pH值至5-13，再加入蛋白酶，调节溶液温度不低于30℃，并在搅拌条件下继续浸泡至少3小时，然后对溶液依次进行灭酶处理、纯化及冷冻干燥，即得到鱼鳞胶原蛋白肽。
2.根据权利要求1所述鱼鳞胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于所述原材料鱼鳞为硬骨鱼鱼鳞。
3.根据权利要求1或2所述鱼鳞胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于所述蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶和动物蛋白酶中的一种或者任意两种混合。
4.根据权利要求1或2所述鱼鳞胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于所述灭酶处理为将溶液在100℃沸水浴中加热至少10分钟终止酶解反应。
5.根据权利要求1或2所述鱼鳞胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于所述纯化为将含鱼鳞胶原蛋白肽的溶液进行离心去除鱼鳞残渣并脱盐。
6.根据权利要求1或2所述鱼鳞胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于取预处理后脱钙、脱色及脱杂蛋白的鱼鳞浸泡于温度保持在40-80℃、浓度为2-10％的NaOH溶液中至少6小时，并在浸泡过程中伴以搅拌；浸泡时间到达后，调节溶液pH值至6-12，再加入蛋白酶，调节溶液温度为40-70℃，保持该温度并在搅拌条件下继续浸泡至少4小时，然后对溶液依次进行灭酶处理、纯化及冷冻干燥，即得到鱼鳞胶原蛋白肽。
7.根据权利要求1或2所述鱼鳞胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于所述进行预处理得到脱钙、脱色及脱杂蛋白的鱼鳞，包括以下步骤：
a.按重量份数计，取清洗干燥后的鱼鳞100份，浸泡在800-2000份浓度为1-5％的HCl溶液中1-3h，浸泡过程中拌以搅拌；浸泡时间到达后，分离出鱼鳞，再分别依次用浓度为0.1-1％的NaOH溶液和水进行淘洗，然后分离出淘洗后的鱼鳞；
b.按重量份数计，将步骤a处理后的鱼鳞浸泡在300-1000份浓度为1-5％的H2O2溶液中，调节溶液pH值至8-12，浸泡处理2-5h，浸泡过程中伴以搅拌；浸泡时间到达后，分离出鱼鳞，再用水进行淘洗，然后分离出淘洗后的鱼鳞；
c.按重量份数计，将步骤b处理后的鱼鳞浸泡在400-800份浓度为5-10％的NaCl溶液中12-24h，浸泡过程中拌以搅拌；浸泡时间到达后，分离出鱼鳞，再分别依次用水和去离子水进行淘洗，然后分离出淘洗后的鱼鳞，自然阴干。
8.根据权利要求7所述鱼鳞胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于所述取预处理后脱钙、脱色及脱杂蛋白的鱼鳞浸泡于温度不低于室温的碱液中至少3小时，是按重量份数计，将步骤c处理后的鱼鳞浸泡在至少200份温度不低于室温、浓度为1-20％的NaOH溶液中至少3小时。
9.根据权利要求8所述鱼鳞胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于按重量份数计，将步骤c处理后的鱼鳞浸泡在400-800份温度保持在40-80℃、浓度为2-10％的NaOH溶液中至少6小时。
10.根据权利要求8或9所述鱼鳞胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于所述加入蛋白酶，是按重量份数计，加入1-10份蛋白酶。
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