CN108203711B - 一种利用氧化硅纳米孔道内的吸附水增强固定化酶催化合成己酸乙酯的方法 - Google Patents

一种利用氧化硅纳米孔道内的吸附水增强固定化酶催化合成己酸乙酯的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于含氧有机化合物的制备技术领域，具体公开了一种利用氧化硅纳米孔道内的吸附水增强固定化酶催化合成己酸乙酯的方法，包括以下步骤：(1)准备氧化硅材料：氧化硅材料具有二维排列的纳米孔道结构，纳米孔道内含有吸附水，纳米孔道呈高度有序排列的特点；(2)制备固定化酶；(3)催化合成己酸乙酯：以无水环己烷为溶剂，固定化酶为催化剂，加入已酸和乙醇进行酯化反应，反应温度控制在32‑38℃；所述固定化酶的用量为48‑55g/L，己酸浓度为0.28‑0.35mol/L，己酸与乙醇的摩尔比为1:1.8‑2。与游离酶催化的己酸乙酯合成反应相比，同样都是在不另外加水条件下，使用本方法催化己酸乙酯的合成的活性催化明显提高，己酸乙酯产量可以得到显著的提升。

Description

一种利用氧化硅纳米孔道内的吸附水增强固定化酶催化合成 己酸乙酯的方法
技术领域
本发明属于含氧有机化合物的制备技术领域，主要涉及一种利用氧化硅纳米孔道内的吸附水增强固定化酶催化合成己酸乙酯的方法。
背景技术
己酸乙酯是一种非常重要的精细化学品，能用作有机溶剂、用于有机合成、配制人造香精等，用途广泛。生物酶法合成己酸乙酯具有反应条件温和、活性高、副反应少、环境友好等优点。酶催化反应条件温和、选择性好、产品性质好，但游离酶在有机溶剂内存在分散不均，易聚集成团等问题，从而导致酶的催化效率不高，且难以回收。利用游离酶催化己酸和乙醇进行酯化反应，游离酶易积聚成团导致催化效率不高。游离酶必须在反应体系中存在一定量的水的情况下才能表现出比较好的催化活性，在不加水的反应体系中，游离酶催化己酸和乙醇的酯化反应的催化活性很低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用氧化硅纳米孔道内的吸附水增强固定化酶催化合成己酸乙酯的方法，与游离酶催化的己酸乙酯合成反应相比，都在不加水的反应体系中，使用该固定化酶催化合成已酸乙酯的效果明显提高，己酸乙酯产量得到显著的增加。
为了达到上述目的，本发明的基础方案为：一种利用氧化硅纳米孔道内的吸附水增强固定化酶催化合成己酸乙酯的方法，包括以下步骤：
（1）准备氧化硅材料：所述氧化硅材料具有二维排列的纳米孔道结构，纳米孔道内含有吸附水；纳米孔道的孔径为6.5-8nm，比表面积为900-1000cm2g-1，孔容为1.2-1.5cm3g-1；
（2）制备固定化脂肪酶：采用步骤（1）的氧化硅材料作为载体制备固定化脂肪酶；
（3）催化合成己酸乙酯：以无水环己烷为溶剂，固定化脂肪酶为催化剂，加入已酸和乙醇进行酯化反应，反应温度控制在32-38℃，搅拌速度控制在为95-105r/min；所述固定化脂肪酶的用量为48-55g/L，己酸浓度为0.28-0.35mol/L，己酸与乙醇的摩尔比为1:1.6-2。
本技术方案中的氧化硅材料具有二维排列的纳米孔道，纳米孔道内含有丰富的吸附水，发明人通过实验发现，这些吸附水具有增强用于催化己酸、乙醇进行酯化反应的固定化脂肪酶的催化活性的作用。利用该氧化硅材料作为载体制备得到的固定化脂肪酶，在不另外加水的反应体系中，该固定化脂肪酶催化己酸和乙醇发生酯化反应能够达到68%的己酸转化率。而在同样条件下，游离酶催化己酸和乙醇发生酯化反应仅能达到8%的己酸转化率，远远低于在相同条件下固定化脂肪酶的己酸转化率。
己酸和乙醇发生进行酯化反应时，合理控制反应的条件，使固定化脂肪酶能够发挥最大的效用；控制固定化脂肪酶的用量，使固定化脂肪酶能够充分且较为迅速的催化己酸和乙醇进行酯化反应；控制己酸和乙醇的用量，由于己酸的价格远高于乙醇，使乙醇过量，确保己酸能够完全反应，在反应体系中不存在剩余。利用本基础方案催化己酸和乙醇发生酯化反应，己酸的转化率高，已酸乙酯的产量多，效果十分显著。
进一步，所述固定化脂肪酶采用以下步骤制备得到：a、将氧化硅材料放入装有酶液的容器中，搅拌吸附1.2-1.8h；b、过滤步骤a得到的物料，分别得到含酶滤液和滤出物；c、用含酶滤液对滤出物冲洗 3-4次，再用190-240mL缓冲液冲洗滤出物，然后再次过滤得到固定化脂肪酶；d、将过滤后得到的固定化脂肪酶用滤纸吸干，放入4℃冰箱内保存。氧化硅材料不会对酶的结构产生影响从而改变酶的性能所以以之为载体能够最大限度的保留酶本身的结构和催化性能。采用上述方法制备固定化脂肪酶，酶能够很好地固载在氧化硅材料上的同时，氧化硅材料的粒子形貌和高度有序的二维排列纳米孔道结构也能够得到很好的保持，不会受到破坏，可以保证氧化硅材料纳米孔道内的吸附水能够很好的与酶接触，增强其催化活性。
进一步，所述氧化硅材料的用量为0.4-0.65g，酶液的用量为90-120ml。经过多次试验发现，采用上述的用量，酶能够较好地负载在氧化硅材料上。
进一步，所述氧化硅材料采用以下步骤制备得到：（1）向HCl溶液中加入P123，搅拌得澄清溶液；（2）将得到的澄清溶液在32-38℃下静止平衡1h；（3）将TEOS加入至步骤（2）得到的溶液中进行搅拌，回流水解得到水解混合物；（4）将步骤（3）得到的水解混合物在98-102℃下处理32-38h；（5）过滤步骤（4）的物料，得到白色固体，用去离子水冲洗滤出的白色固体；（6）将冲洗后的白色固体在室温下干燥，然后灼烧得到白色粉末。采用上述方法制备得到氧化硅材料，得到的氧化硅材料具有二维排列的纳米孔道结构，纳米孔道呈高度有序排列的特点，纳米孔道内含有丰富的吸附水，利用该氧化硅材料作为载体制备固定化酶，纳米孔道内丰富的吸附水有效增强了固定化脂肪酶的催化活性。
进一步，所述P123的用量为20-26 g；所述HCl溶液体积为660-800ml，浓度为0.38-0.42 mol/L；所述TEOS用量为50-60ml。经过多次试验得到，采用上述配比制备氧化硅材料，得到的氧化硅材料性能更加优越。
进一步，制备氧化硅材料的步骤（3）中，回流的温度为33-38℃，回流的时间为20-28 h。将参数控制在上述范围，有利于获得水解混合物。
进一步，制备氧化硅材料的步骤（6）中，灼烧的温度为540-560℃，时间为3.8-4.2h。经过步骤（5）得到的氧化硅材料上还粘附有表面活性剂，为得到较为纯净的氧化硅材料需将表面活性剂除去，而煅烧温度过高会导致材料的烧结，经过多次试验得到，将参数设置为以上范围，能在不破坏氧化硅材料的基础上能够较好的除去表面活性剂。
进一步，所述酶液采用以下步骤制备得到：取脂肪酶干酶粉加入到缓冲液内中，搅拌0.8-1.2h，静止1.5-2h，取上清液；所述脂肪酶干酶粉的用量为4.8-5.2g,缓冲液的用量为1L。选用脂肪酶配制酶液，脂肪酶有助于催化合成己酸乙酯，同时氧化硅材料纳米孔道内的吸附水具有增强脂肪酶催化活性的作用，有助于提高己酸乙酯的合成量。
进一步，所述缓冲液为pH值4.01-4.08的磷酸-柠檬酸缓冲液。制备固定化脂肪酶时，选用该pH值的磷酸-柠檬酸缓冲液，能够有效除去氧化硅载体表面吸附不牢固的脂肪酶；制备酶液时，选用该pH值的磷酸-柠檬酸缓冲液，制备得到酶液性能较好。
附图说明
图1是本发明使用的氧化硅材料的扫描电镜图（a,b）以及透射电镜图（c,d）；
图2是本发明使用的氧化硅材料进行的吸附水脱附实验的质谱检测图；
图3是本发明使用的氧化硅材料负载的固定化酶催化剂的扫描电镜图（a,b）以及透射电镜图（c,d）；
图4是游离酶、本发明使用的氧化硅材料、固定化酶的紫外-可见漫反射图；
图5是游离酶和固定化酶在相同条件下催化的己酸和乙醇的酯化反应的催化活性对比图。
具体实施方式
下面对原料选用进行了说明，并以实施例1为例详细说明一种利用氧化硅纳米孔道内的吸附水增强固定化酶催化合成己酸乙酯的方法，其它实施例在表1中体现，未示出的部分与实施例1相同。
制备固定化酶用到的脂肪酶干酶粉来自于深圳绿微康生物工程有限公司，按照国标（GB/T 23535-2009）里的橄榄油乳化法测定的酶活为100000U/g；对比例中使用的游离酶同为来自于深圳绿微康生物工程有限公司的脂肪酶干酶粉，酶活为100000U/g。固定化酶中包含氧化硅材料和脂肪酶干酶粉，50g的固定化酶中约含有5g脂肪酶干酶粉。
本发明用到的P123是一种三嵌段共聚物，全称为:聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物，是一种非离子表面活性剂，来自Aldrich公司。
本发明用到的己酸、乙醇、无水环己烷、TEOS皆为分析纯试剂，来自Aldrich公司。
本发明用到的缓冲液为磷酸-柠檬酸缓冲液，采用分析纯的柠檬酸、NaH2PO4•2H2O和Na2HPO4•12H2O试剂配制，这些试剂来自成都科龙化工。
实施例1
一种利用氧化硅纳米孔道内的吸附水增强固定化酶催化合成己酸乙酯的方法，包括以下步骤：
（1）准备氧化硅材料：如图1所示，氧化硅材料具有二维排列的纳米孔道，纳米孔道内含有吸附水，纳米孔道呈高度有序排列的特点；纳米孔道的孔径为7.5nm，比表面积为950cm2g-1，孔容为1.3cm3 g-1。氧化硅材料采用以下步骤制备得到：a、向浓度为0.4 mol/L、体积为700ml的HCl溶液中加入23g的P123，搅拌得澄清溶液。b、将得到的澄清溶液在35℃下平衡1h。c、将为55ml TEOS加入至步骤b得到的溶液中进行搅拌，回流水解，回流的温度为35℃，回流的时间为24h，得到水解混合物。d、将步骤c得到的水解混合物在100℃下处理36h。e、过滤步骤d物料，得到白色固体，用去离子水冲洗滤出的白色固体。f、将冲洗后的白色固体在室温下干燥，然后在马弗炉中灼烧得到白色粉末，灼烧的温度为550℃，时间为4h。
（2）制备固定化酶：包括以下步骤：A、将氧化硅材料放入装有酶液的容器中，搅拌吸附1.5h，其中氧化硅材料的用量为0.5g，酶液的用量为100ml。酶液采用以下步骤制备得到：取脂肪酶干酶粉加入到pH值为4.06的缓冲液内，搅拌1h，静止1.5h，取上清液，上清液即为酶液；其中脂肪酶干酶粉的用量为5g，缓冲液的用量为1L。B、过滤步骤A得到的物料，分别得到含酶滤液和滤出物。C、用含酶滤液对滤出物冲洗4次，再用200mLpH值为4.06的缓冲液冲洗滤出物，然后再次过滤得到固定化酶。D、将过滤后得到的固定化酶用滤纸吸干，放入4℃的冰箱内保存。
（3）催化合成己酸乙酯：以无水环己烷为溶剂，固定化酶为催化剂，加入已酸和乙醇进行酯化反应，反应温度控制在35℃，搅拌速度控制在为100r/min；其中固定化酶的用量为50g/ L，己酸浓度为0.3mol/L，己酸与乙醇的摩尔比为1:1.8。
表1
实验组 参数 实施例1 实施例2 实施例3
HCl溶液的 浓度、体积 0.4 mol/L 、700ml 0.38 mol/L 、660ml 0.42 mol/L 、760ml
P123（g） 23 20 25
TEOS （ml） 55 51 59
灼烧的温度 、时间 550℃、4h 540℃、4.2h 560℃、3.8h
脂肪酶干酶粉（g） 5 4.9 5.2
酶液（ml） 100 90 120
氧化硅材料（g） 0.5 0.4 0.6
缓冲液pH值 4.06 4.07 4.03
反应温度（℃） 35 38 33
固定化酶用量 （g/ L） 50 48 55
己酸浓度（mol/L） 0.3 0.28 0.35
己酸与乙醇 的摩尔比 1 ： 1.8 1 ： 1.6 1 ：2
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于：没有步骤（1）、（2）的操作，步骤（3）己酸和乙醇发生酯化反应：以无水环己烷为溶剂，游离酶为催化剂，加入已酸和乙醇进行酯化反应，反应温度控制在35℃，搅拌速度控制在为100r/min；其中游离酶的用量为5g/ L，己酸浓度为0.3mol/L，己酸与乙醇的摩尔比为1:1.8。
分析说明：
将实施例1与对比例1进行对比，可以看出，实施例1中的己酸转化率将近达到70%，而对比例1中的己酸转化率远远低于20%，如图5所示。这说明，在同为不加水的反应体系中，使用本技术方案合成己酸乙酯的效果远远优于使用游离酶催化合成己酸乙酯。
对实施例1中的氧化硅材料进行电镜扫描，得到图1，从图1中可以看到此材料的粒子形貌均一，全部呈现长条状，长度达到20微米的尺度。图1所示的分辨率更高的扫描电镜图中可以辨认出图1中的呈长条状的粒子由二维有序排列的纳米孔道所组成。从图1所示的透射电镜图中可以看到这种材料的长条状粒子的端面，由高度有序的二维排列孔道组成。图1所示为这种材料的长条状粒子的侧视图，可以非常清楚的分辨出高度二维有序排列的纳米孔道。所得的氧化硅材料的孔径为7.5nm，比表面积为950cm2g-1，孔容为1.3cm3g-1。
图2是对实施例1中的氧化硅材料进行的吸附水脱附实验的质谱检测图。图中可见，对应H2O的质量数为18的信号在脱附温度为30℃时即开始明显增加，随着脱附温度的逐渐增加而急剧上升，在脱附温度为在80℃时达到最大值，然后逐渐下降，在140℃左右已经降低到和基线相当的水平。继续增加脱附温度至在330℃左右也没有观察到其他的H2O的信号。吸附水脱附实验说明在此氧化硅材料的纳米孔道内存在丰富的吸附水，这些吸附水在脱附温度为30℃即可脱附，说明其是物理吸附水，具有和游离态的水相似的性质。
图3对实施例1中的氧化硅材料负载的固定化酶的扫描电镜图（a,b）以及透射电镜图（c,d）。对比图1所示的氧化硅材料的扫描电镜图和透射电镜图，可以发现经过固定化酶的制备过程，氧化硅材料的粒子形貌和高度有序的二维排列纳米孔道结构都得到了很好的保持。
图4是游离酶（脂肪酶干酶粉）、氧化硅材料、固定化酶的紫外-可见漫反射图。可以看到氧化硅材料的谱图在整个波长范围内都没有表现出吸收峰。游离酶的谱图则在波长为276nm处有一个明显的吸收峰；在波长接近200nm处呈现出一个很强的吸收边。固定化酶的谱图表现出与游离酶的谱图非常一致的特征，同样在276nm处具有一个明显的吸收峰，以及接近200nm处的很强的吸收边。这说明经过实施例1中步骤（1）、步骤（2）的制备，游离酶被成功地固载在氧化硅材料上得到了固定化酶。

Claims (9)

1.一种利用氧化硅纳米孔道内的吸附水增强固定化酶催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)准备氧化硅材料：所述氧化硅材料具有二维排列的纳米孔道结构，纳米孔道内含有吸附水；纳米孔道的孔径为6.5-8nm，比表面积为900-1000cm2g-1，孔容为1.2-1.5cm3g-1；
(2)制备固定化脂肪酶：采用步骤(1)的氧化硅材料作为载体制备固定化脂肪酶；
(3)催化合成己酸乙酯：以无水环己烷为溶剂，固定化脂肪酶为催化剂，加入已酸和乙醇进行酯化反应，反应温度控制在32-38℃，搅拌速度控制在为95-105r/min；所述固定化脂肪酶的用量为48-55g/L，己酸浓度为0.28-0.35mol/L，己酸与乙醇的摩尔比为1:1.6-2。
2.根据权利要求1所述的一种利用氧化硅纳米孔道内的吸附水增强固定化酶催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于：所述固定化脂肪酶采用以下步骤制备得到：
a、将氧化硅材料放入装有酶液的容器中，搅拌吸附1.2-1.8h；
b、过滤步骤a得到的物料，分别得到含酶滤液和滤出物；
c、用含酶滤液对滤出物冲洗3-4次，再用190-240mL缓冲液冲洗滤出物，然后再次过滤得到固定化脂肪酶；
d、将过滤后得到的固定化脂肪酶用滤纸吸干，放入4℃冰箱内保存。
3.根据权利要求2所述的一种利用氧化硅纳米孔道内的吸附水增强固定化酶催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于：所述氧化硅材料的用量为0.4-0.65g，酶液的用量为90-120ml。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种利用氧化硅纳米孔道内的吸附水增强固定化酶催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于：所述氧化硅材料采用以下步骤制备得到：
(1)向HCl溶液中加入P123，搅拌得澄清溶液；
(2)将得到的澄清溶液在32-38℃下静止平衡1h；
(3)将TEOS加入至步骤(2)得到的溶液中进行搅拌，回流水解得到水解混合物；
(4)将步骤(3)得到的水解混合物在98-102℃下处理32-38h；
(5)过滤步骤(4)的物料，得到白色固体，用去离子水冲洗滤出的白色固体；
(6)将冲洗后的白色固体在室温下干燥，然后灼烧得到白色粉末。
5.根据权利要求4所述的一种利用氧化硅纳米孔道内的吸附水增强固定化酶催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于：所述P123的用量为20-26g；所述HCl溶液体积为660-800ml，浓度为0.38-0.42mol/L；所述TEOS用量为50-60ml。
6.根据权利要求4所述的一种利用氧化硅纳米孔道内的吸附水增强固定化酶催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于：制备氧化硅材料的步骤(3)中，回流的温度为33-38℃，回流的时间为20-28h。
7.根据权利要求4所述的一种利用氧化硅纳米孔道内的吸附水增强固定化酶催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于：制备氧化硅材料的步骤(6)中，灼烧的温度为540-560℃，时间为3.8-4.2h。
8.根据权利要求2所述的一种利用氧化硅纳米孔道内的吸附水增强固定化酶催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于：所述酶液采用以下步骤制备得到：取脂肪酶干酶粉加入到缓冲液内中，搅拌0.8-1.2h，静止1.5-2h，取上清液；所述脂肪酶干酶粉的用量为4.8-5.2g,缓冲液的用量为1L。
9.根据权利要求8所述的一种利用氧化硅纳米孔道内的吸附水增强固定化酶催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于：所述缓冲液为pH值4.02-4.08的磷酸-柠檬酸缓冲液。
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