CN108187052B - Akt抑制剂在制备治疗血小板数量减少相关疾病药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Akt抑制剂在制备治疗血小板数量减少相关疾病药物中的用途。通过实验探明Akt通过激活依赖环磷酸腺苷的磷酸二酯酶和磷酸二酯酶介导的蛋白激酶A来调控血小板凋亡和活化，凋亡和活化血小板暴露脂酰丝氨酸，使其被巨噬细胞吞噬。抑制或基因敲除Akt或Akt介导的血小板活化和凋亡，或者阻断磷脂酰丝氨酸外翻均可阻止结合抗体的血小板被清除。研究表明Akt抑制剂可以用于抗血小板膜糖蛋白Ibα抗体诱导血小板数量变化相关疾病的治疗过程，抑制外周循环血中血小板数量减少，因此，Akt抑制剂具有开发成新型血小板保护药物和新型治疗血小板减少性疾病药物的潜力，极具科研和经济价值。

Description

Akt抑制剂在制备治疗血小板数量减少相关疾病药物中的 用途

技术领域

本发明属于血小板相关药物领域，具体涉及Akt抑制剂在制备治疗血小板数量减少相关疾病药物中的用途。

背景技术

血小板数量减少是临床上常见的症状，可导致出血甚至致死性内出血的严重后果。血小板数量减少相关疾病包括免疫性血小板减少症、感染所致的血小板减少疾病、继发性血小板减少疾病、药物引起的血小板减少疾病、血小板生成缺欠疾病、非免疫性血小板减少疾病、血小板生成减少导致的疾病、血小板破坏增多导致的疾病或血栓性血小板减少性紫癜等等。这些不同病因导致的血小板减少，其发病机制都是由于凋亡和活化导致的血小板寿命缩短，而被清除。免疫血小板减少症（Immune Thrombocytopenia，ITP）是一种常见的自身免疫性疾病，其特点是血小板计数低，可导致危及生命的出血。在ITP患者中检测到两种针对血小板受体的自身抗体，分别是抗纤维蛋白原受体糖蛋白（Glycoprotein，GP）IIb/IIIa和（或）抗血浆血管性血友病因子（Von Willebrand Factor，VWF）受体GPIb-IX复合物的抗体。目前认为，自身抗体结合的血小板通过脾脏内Fc-FcγR（Crystalline Fragment，Fc）结合吞噬引起血小板清除。因此，ITP的主要治疗策略是免疫抑制、免疫调节和脾切除术。然而，抗GPIb-IX自身抗体的ITP患者出现更严重的血小板计数下降。此外，大多数抗GPIb-IX自身抗体介导的血小板减少症对传统疗法的反应较差，如静脉注射免疫球蛋白G（Intravenous Immunoglobulin G，IVIG）和类固醇治疗，甚至脾切除术提示，抗GPIb-IX自身抗体诱导的血小板破坏可能涉及不同的病因。

GPIbα是GPIb-IX复合体的主要亚基，事实上，经研究发现抗GPIbα单克隆抗体可以在体外激活血小板，并在体内引起血小板被清除[Yan, R. et al. Glycoprotein Ibalphaclustering induces macrophage-mediated platelet clearance in the liver（GPIbα诱导肝脏中巨噬细胞介导的血小板清除）. Thromb Haemost（血栓和凝血疾病杂质）113,107-117 (2015)；Bergmeier, W. et al. Structural and functionalcharacterization of the mouse von Willebrand factor receptor GPIb-IX withnovel monoclonal antibodies（新型单克隆抗体对小鼠血管性血友病因子受体GPIb-IX的结构和功能鉴定）. Blood（血液学杂志）95, 886-893 (2000)；Becker, B.H. et al.Effects of an antiplatelet glycoprotein Ib antibody on hemostatic function inthe guinea pig（抗血小板糖蛋白Ib抗体对豚鼠凝血功能的影响）. Blood（血液学杂志）74, 690-694 (1989)；Cadroy, Y. et al. Relative antithrombotic effects ofmonoclonal antibodies targeting different platelet glycoprotein-adhesivemolecule interactions in nonhuman primates（在非人灵长类动物中针对不同血小板糖蛋白粘附分子相互作用的单克隆抗体的相对抗血栓作用）. Blood（血液学杂志）83, 3218-3224 (1994)]。

我们进一步证明抗GPIbα抗体通过Fc-非依赖机制使血小板在肝脏中被吞噬，有一篇报道显示[Li, J. et al. Desialylation is a mechanism of Fc-independentplatelet clearance and a therapeutic target in immune thrombocytopenia（在免疫性血小板减少症中去涎酸诱导Fc–非依赖的血小板清除）. Nat Commun（自然通讯）6, 7737(2015)]，抗小鼠GPIbα单克隆抗体诱导Fc-非依赖的血小板激活和在肝的清除支持了我们的结论。GPIbα的去涎酸作用使得肝细胞通过Ashwell-Morell受体依赖方式清除血小板。此外，剪切诱导GPIbα机械感觉域解折叠也会引发血小板清除。因此，越来越多的证据表明抗GPIbα抗体，不像抗GPIIb/IIIa的自身抗体，可能通过一种Fc-非依赖的方式引起血小板清除，而且抗GPIbα抗体诱导血小板减少的机制仍不清楚。

GPIbα包含了几个重要配体的结合位点，包括细胞外N端的VWF和凝血酶位点。VWF多聚体与GPIbα的相互作用诱导了脂筏中GPIb-IX复合物的易位和聚集，触发信号级联反应，如Akt活化和钙离子动员，导致血小板活化和血栓形成。我们之前发现GPIbα-VWF的相互作用也可以诱导血小板凋亡，但作用机制仍然未知。我们最近报道了蛋白激酶A（ProteinKinase A，PKA）介导的血小板凋亡在病理生理条件中广泛存在[Zhao, L. et al. Proteinkinase A determines platelet life span and survival by regulating apoptosis（蛋白激酶A通过调控血小板凋亡决定血小板寿命）. J Clin Invest（临床研究杂志）(2017)]。此外，更多的研究证明，各种病理刺激引起的血小板凋亡和活化导致许多常见疾病的血小板减少，如感染、癌症和糖尿病。然而，这些常见疾病中血小板减少的发病机制尚不完全清楚。

发明内容

要解决的技术问题：不同病因导致的血小板减少，其发病机制都是由于凋亡和活化导致的血小板寿命缩短，而被清除。ITP是一种常见的自身免疫性疾病，主要由抗GPIIb/IIIa和GPIb-IX自身抗体引起，抗GPIbα抗体的ITP患者对Fc依赖的治疗策略表现出难治性，而且其致病机制未明。我们要解决的技术问题是进一步研究抗GPIbα抗体诱导血小板减少的具体机制，探明Akt如何调控血小板凋亡，进而公开Akt抑制剂在制备治疗血小板数量变化相关疾病药物中的用途。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了Akt抑制剂在制备治疗血小板数量减少相关疾病药物中的用途，本发明的技术方案为：

Akt抑制剂在制备治疗血小板数量减少相关疾病药物中的用途。

进一步的，所述的Akt抑制剂包括无机物抑制剂和有机物抑制剂。

进一步的，所述的无机物抑制剂包括氢化物、氧化物、酸、碱和盐。

进一步的，所述的有机物抑制剂包括烃类、烃的衍生物、糖类、蛋白质、脂肪、核酸和合成高分子材料。

进一步的，所述的烃类包括烯烃、烷烃、炔烃和芳香烃；所述的烃的衍生物包括卤代烃、醇、酚、醛、酸和酯；所述的糖类包括单糖、二糖、低聚糖和多糖；所述的蛋白质包括氨基酸和多肽；所述的核酸包括脱氧核糖核酸和核糖核酸。

进一步的，所述的Akt抑制剂包括Akt不同分类或亚型抑制剂、ATP竞争性抑制剂、酪氨酸和磷酸肌醇激酶双重抑制剂。

进一步的，所述的Akt抑制剂包括Akt抑制剂III（Akt Inhibitor III）、Akt抑制剂IV（Akt Inhibitor IV）、Akt抑制剂IX（Akt Inhibitor IX）、Akt抑制剂VIII（AktInhibitor VIII）、Akt抑制剂X（Akt Inhibitor X）、Akt抑制剂XI（Akt Inhibitor XI）、Akt抑制剂XII（Akt Inhibitor XII）、Akt抑制剂XIII（Akt Inhibitor XIII）、10-DEBC盐酸盐（10-DEBC hydrochloride）、SH-5、SH-6、Akt1/2激酶抑制剂（Akt1/2 kinase Inhibitor）、曲西立滨（Triciribine）、PDK1/Akt/Flt 双途径抑制剂（PDK1/Akt/Flt Dual PathwayInhibitor）、AT7867、PIK-90、米替福新（Miltefosine）、MK-2206、17-AAG、AGL2263、API-1、BML-257、鱼藤素（Deguelin）、恩甾思瑞（Enzastaurin）、FPA124、GSK690693、和厚朴酚（Honokiol）、彭罗密得（Palomid）529、哌立福辛（Perifosine）、PHT-427、非瑟酮（Fisetin）、纳曲吲哚盐酸盐（Naltrindole Hydrochloride）、PIT1、四氢姜黄素（TetrahydroCurcumin）、TG100-115、2,4-二溴-5-硝基酪氨酸（2,4-Dibromo-5-nitropyridine）、伏马菌素B1（Fumonisin B1）、格列美脲（Glimepiride）、AT13148、GSK2141795、Akti-1/2、ARQ092、TIC10、SC79、GSK2110183（Afuresertib）、TIC10类似物、PHT-427、A-674563、CCT128930、AT7867、PF-04691502、AZD5363、GDC-0068、Akt抑制剂VIII三氟醋酸盐盐水合物（3-Dihydro-1-(1-((4-(6-phenyl-1H-imidazo[4,5-g]quinoxalin-7-yl)phenyl)methyl)-

4-piperidinyl)-2H-benzimidazol-2-one trifluoroacetate salt hydrateAkt Inhibitor VIII trifluoroacetate salt hydrate）、Akti-1/2三氟醋酸盐盐水合物（Akti-1/2 trifluoroacetate salt hydrate）、5-(2-苯并噻唑基)-3-乙烷基-2-[2-(甲基苯氨基)乙烯基]-1-苯基-1H-苯并咪唑碘负离子（5-(2-Benzothiazolyl)-3-ethyl-2-[2-(methylphenylamino)ethenyl]-1-phenyl-1H-benzimidazolium iodide）、GSK1059615氢氧化钠（GSK1059615 sodium salt hydrate）、KP372-1、NSC156529、SC66、sPLA2抑制剂（sPLA2 Inhibitor）、CP-380736、地喹氯铵水合物（Dequalinium chloride hydrate）、伏格列波糖（Voglibose）、API-1、阿西替尼（Enzastaurin）、ESI-09、SBI-0640756、S14161、YS-49一水化物（YS-49 monohydrate）、SB216763、PX-866中的一种或几种。

进一步的，所述的血小板数量减少相关疾病包括免疫性血小板减少症、感染所致的血小板减少疾病、继发性血小板减少疾病、药物引起的血小板减少疾病、血小板生成缺欠疾病或非免疫性血小板减少疾病。

进一步的，所述的免疫性血小板减少症包括特发性血小板减少性紫癜；所述的感染所致的血小板减少疾病包括细菌感染血小板减少疾病或病毒感染血小板减少疾病；所述的继发性血小板减少相关疾病包括糖尿病病人体内的血小板减少疾病、肿瘤病人体内的血小板减少疾病、心脑血管疾病病人体内的血小板减少疾病、药物治疗过程中导致的血小板减少疾病、脾功能亢进疾病、妊娠过程中血小板减少疾病、继发于再生障碍性贫血的血小板减少疾病、继发于脾功能亢进的血小板减少疾病、继发于白血病的血小板减少疾病、继发于系统性红斑狼疮的血小板减少疾病、继发于干燥综合症的血小板减少疾病或继发于电离辐射的血小板减少疾病；所述的血小板生成缺欠疾病包括先天性血小板生成不良、无巨核细胞性血小板减少、范可尼综合征、血小板膜糖蛋白Ib-IX缺乏或功能异常引起的伯纳德-苏利耶综合征、灰色血小板综合征、湿疹血小板减少伴免疫缺陷综合征、再生障碍性贫血与骨髓增生异常综合征所引起的血小板减少疾病、抗磷脂综合征引起的血小板破坏增多疾病、获得性血小板生成不良、放疗或化疗药物所引起的血小板生成欠缺疾病或放射损伤引起的血小板生成欠缺疾病。

进一步的，所述的药物引起的血小板减少疾病中，所述的药物包括抗肿瘤药物、奎宁、奎尼丁、肝素、抗生素和抗惊厥药物。

进一步的，所述的药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、缓释制剂、控释制剂、口服液或贴剂。

进一步的，所述的药物包含药学上有效剂量的Akt抑制剂和药学上可接受的载体。

进一步的，所述的药物通过口服、注射、喷雾吸入或经胃肠道进行给药。

有益效果：本发明的Akt抑制剂在制备治疗血小板数量减少相关疾病药物中的用途具有以下优势：

本发明通过实验探究了Akt在调控抗GPIbα抗体诱导血小板凋亡过程中的作用，研究证明抗GPIbα抗体的ITP患者血小板不仅发生活化而且发生凋亡。抗GPIbα抗体诱导Akt活化和Akt介导了的血小板活化和凋亡。并且研究了Akt通过激活依赖环磷酸腺苷（cAMP）的磷酸二酯酶（Phosphodiesterase，PDE3A）和磷酸二酯酶（PDE3A）介导的蛋白激酶来调控血小板凋亡，抑制或基因敲除Akt或Akt介导的血小板活化和凋亡，或者阻断磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）外翻均可阻止结合抗体的血小板被清除。研究表明Akt抑制剂可以参与抗GPIbα抗体诱导血小板数量变化相关疾病的治疗过程，抑制外周循环血中血小板数量减少，因此，上述抑制剂具有开发成新型血小板保护药物和新型治疗血小板减少性疾病药物的潜力，极具科研和经济价值。

附图说明

图1为抗GPIbα自身抗体的ITP患者的血小板发生活化和凋亡的指标表征图，其中，a为P-选择素的含量变化图，b为线粒体膜电位（Mitochondrial TransmembranePotential，ΔΨm）去极化图，c为PS外翻表征图，d为检测半胱天冬酶Caspase-3酶切的蛋白质印迹（Western blot）结果图，e为依据图d得到的酶切Caspase-3的统计结果图（Caspase-3酶切活化代表发生凋亡）。

图2为抗GPIbα抗体不同时间诱导血小板凋亡和活化的指标表征图，其中，a为P-选择素的含量变化图，b为活化GPIIb/IIIa的含量变化图，c为线粒体膜电位（ΔΨm）去极化图，d为PS外翻表征图。

图3为R300不同时间诱导血小板凋亡和活化的指标表征图，其中，a为P-选择素的含量变化图，b为活化GPIIb/IIIa的含量变化图，c为线粒体膜电位（ΔΨm）去极化图，d为PS外翻表征图。

图4为人洗涤血小板加入10µg/mL IgG、AN51、SZ2或HIP1后在37℃下孵育8h，检测Akt上第473位点丝氨酸（Ser）和第308位点丝氨酸磷酸化变化情况的Western blot表征图。

图5为加入MK2206或Akt Inhibitor III后抗GPIbα自身抗体结合的血小板发生活化和凋亡的指标表征图，其中，a为P-选择素的含量变化图，b为线粒体膜电位（ΔΨm）去极化图，c为PS外翻表征图。

图6为野生型小鼠和Akt1-/-小鼠的血小板发生活化和凋亡的指标表征图，其中，a为P-选择素的含量变化图，b为检测活化GPIIb/IIIa的表达量图，c为线粒体膜电位（ΔΨm）去极化图，d为PS外翻表征图。

图7为PI3K、Akt或PDE3A抑制剂对SZ2处理的血小板中PKA活性的作用效果图。

图8为Akt抑制剂拮抗抗GPIbα抗体诱导血小板清除的计数结果。

图9为Akt1+/-小鼠拮抗抗GPIbα抗体诱导血小板清除的计数结果。

具体实施方式

、实验用小鼠

野生型C57BL/6小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。所有实验动物相关福利均严格按照中华人民共和国《实验动物管理条例》执行。动物实验经苏州大学医学伦理委员会批准。

2、洗涤血小板

健康成人志愿者自肘正中静脉采血。献血者无烟酒等不良生活习惯，献血前2周内未服用任何影响血小板功能的药物。女性献血者处于非月经期。献血者均知情同意并签署协议书。实验方案经苏州大学附属第一医院伦理委员会批准，符合赫尔辛基宣言。

抽取一定量健康人静脉血，用1/7体积的柠檬酸葡萄糖缓冲液（Acid-citratedextrose，ACD）（2.5％柠檬酸三钠，2.0%葡萄糖，1.5%柠檬酸）抗凝剂抗凝。抗凝后的全血在300g下离心10-15min，离心后下层为红细胞，上层为富含血小板的血浆。小心的将上层液体吸出至新的离心管。富含血小板的血浆（Platelet-rich Plasma，PRP）在1500g下离心10min，沉淀为血小板，上层液体为乏血小板血浆。弃上清后，将血小板重悬于与富含血小板血浆等体积的柠檬酸葡萄糖盐水（Citrate Glucose Saline，CGS）缓冲液（0.123MNaCl，0.033M葡萄糖，0.013M柠檬酸三钠，pH6.5）中，在1500g下离心5min以洗去血浆蛋白。重复此洗涤步骤一次。沉淀的血小板最终重悬于一定体积的改良Tyrode缓冲液（2.5mMHEPES，150mM NaCl，2.5mM KCl，12mM NaHCO₃，5.5mM D-葡萄糖，1mM CaCl₂，1mM MgCl₂，pH7.4），浓度为3×

10⁸/mL。重悬后的洗涤血小板在室温下放置1h以使其恢复至生理状态后用于后续实验。

3、流式检测血小板活化和凋亡指标

为了研究抗GPIbα抗体诱发血小板减少症的发病机制，我们用微球蛋白筛选了23例有抗GPIbα抗体的ITP患者。ITP患者及正常人全血经3.8％柠檬酸钠抗凝后，1500g离心分离得到乏血小板血浆（Platelet-poor Plasma，PPP），与正常人血小板在37℃温育8h，分别用JC1（2µg/mL）检测线粒体膜电位去极化，FITC-lactadherin（10µg/mL）标记PS，FITC-human CD62P（20µg/mL）标记P选择素以及FITC-PAC-1（20µg/mL）标记活化GPIIb/IIIa；人洗涤血小板分别对照同型抗体小鼠IgG（10µg/mL）和AN51（10µg/mL）或SZ2（10µg/mL）或HIP1（10µg/mL）在37℃孵育，并在不同时间点，分别用JC1（2µg/mL）检测线粒体膜电位去极化，FITC-乳凝集素(lactadherin)（10µg/mL）标记PS，FITC-human CD62P（20µg/mL）标记P选择素。

4、Wsetern blot分析半胱天冬酶-3蛋白

人洗涤血小板分别与正常志愿者或是ITP病人PPP在37℃共孵育8h后，加入等体积的2×细胞裂解液（含2mM PMSF，2mM NaF，2mM Na₃VO₄，以及蛋白酶抑制剂）冰上裂解30min后，加入蛋白上样缓冲液，99℃，5min后，-80℃保存；Wsetern blot分析，检测半胱天冬酶-3蛋白水平。

5、血小板回输模型

钙黄绿素标记的小鼠血小板分别与对照抗体IgG（2µg/mL）或是R300（2µg/mL）室温下孵育1h，在抑制实验中，提前5min向受体小鼠注射对照溶剂或Wortmannin（0.05µg/mL、0.5µg/mL）；向受体小鼠通过眼眶静脉注射上述R300孵育的血小板1×10⁸个。在回输后指定时间通过眼眶静脉采血，经3.8%柠檬酸钠抗凝后，全血用PE标记小鼠CD41在室温下标记15min，1mL磷酸盐缓冲液（Phosphate-buffered Saline，PBS）稀释后流式检测。所有的血小板（受体小鼠自己的血小板和回输血小板）均能够被PE标记小鼠CD41标记，而回输的血小板还被钙黄绿素标记，因此用第一荧光通道（Fluorescent 1，FL1）和第二荧光通道（Fluorescent 2，FL2）双阳性血小板除以FL2单阳血小板比例绘制回输血小板清除曲线。

6、小鼠基因敲除

使用小鼠Pkbα cDNA探针从129/SvJ BAC基因文库中分离了一个阳性片段，并克隆3个6.5，2.8和10kb的BamHI片段以及含有全部14个外显子的5-kb XbaI片段。将这些克隆片段进行测序和组装。通过PCR组建一段1.9-kb的左臂，并且和5.5kb的lacZ/Neo进行融合来构建Pkbα靶向载体。Neo cassette的3′的末端连接一个6.7-kb的右臂，整个片段被克隆到pBluescript KS。线性化的载体（SalI）被导入到129/OLA ES细胞来进行同源重组，通过PCR对G418抗性克隆进行分析。引物如下：（a）P684265-2,5’-CCCACGACAGAAAGTTGTGCG-3’；（b）LacZ-2,5’-CGTCTGGCCTTCCTGTAGCC-AG-3’。阳性克隆（5）进一步通过Southern印迹杂交进行分析。两个男性嵌合体通过生殖传输。从Pkbα+/–交叉的后代有129/Ola和C57BL/6基因。产生了具有129/Ola/Sv基因的小鼠。基因分型的后代由以下三种引物进行多重PCR扩增：

（a）Pkbα 5′, 5′-AGACTCTGAGCATCATCCCTGGG-3′；

（b）LacZ-2,5’-CGTCTGGCCTTCCTGTAGCC-AG-3’；

（c）Pkbα 3′, 5′-TGAAGCAGGCCTAGAGCCCCATG-3′。

7、统计学分析

试验数据以Prism 5.1统计软件（GraphPad）进行分析。数据经正态性检验符合正态分布，以

±s表示，采用不配对Student’s t检验进行组间比较。分组数据经方差齐性检验后，采用单因素方差分析（One-way Analysis of Variance，ANOVA）进行组间比较；方差不齐者采用Kruskal-Wallis检验。p＜0.05作为显著性差异界值。

8、实验结果

（1）抗GPIbα自身抗体的ITP患者的血小板发生活化和凋亡

为了研究抗GPIbα抗体诱发血小板减少症的发病机制，我们用微球蛋白筛选了23例有抗GPIbα抗体的ITP患者。从图1得出，正常血小板与抗GPIbα自身抗体血浆孵育后，抗GPIbα自身抗体血浆明显诱导血小板P-选择素（图1a）和PS外翻（图1c），使血小板活化。

从图1b得出，抗GPIbα自身抗体血浆启动血小板内线粒体调控的凋亡程序，使血小板发生线粒体膜电位(ΔΨm)去极化。从图1d得出，抗GPIbα自身抗体血浆使血小板内caspase-3活性明显升高。这些数据表明，抗GPIbα自身抗体血浆在体外可诱导血小板活化和凋亡。

（2）抗GPIbα抗体诱导血小板凋亡和活化

为了进一步探明抗GPIbα抗体对血小板的影响，并避免来自血浆的非特异性效应，选择单克隆抗GPIbα抗体，结果发现抗GPIbα抗体AN51、SZ2和R300诱导血小板P-选择素（图2a和图3a）和GPIIb/IIIa活化（图2b和图3b），促使血小板活化，以及AN51和SZ2显著诱导血小板ΔΨm去极化（图2c和图3c）和PS暴露（图2d和图3d）。这些数据进一步证明抗GPIbα抗体可引起血小板活化和凋亡现象。

（3）Akt在抗GPIbα抗体诱导血小板凋亡和活化中起关键作用

我们进一步探讨了抗GPIbα抗体诱导血小板凋亡和活化的机制。Akt是与GPIbα胞内域相互作用的PI3K的下游执行蛋白，转导VWF-GPIbα相互作用信号，导致血小板活化。因此，我们假设Akt可能是抗GPIbα抗体下游信号传导中的重要蛋白。通过直接检测AktSer473和Akt Ser308磷酸化变化，发现AN51和SZ2显著促进Akt活化（图4）。这些数据证明抗GPIbα抗体可引起血小板内Akt活化，Akt参与调控抗GPIbα抗体信号传导。

在体外阻断血小板活化和凋亡实验中，人洗涤血小板或是小鼠PRP分别提前与溶剂对照和Akt Inhibitor III（100mM）、MK2206（100µM）在室温下孵育15min，加入SZ2（10µg/mL）在37℃下孵育8h，分别用JC1（2µg/mL）检测线粒体膜电位去极化，FITC-lactadherin（10µg/mL）标记PS以及FITC-小鼠CD62P（20µg/mL）标记P 选择素，实验发现抑制Akt可明显降低抗GPIbα抗体诱导的血小板凋亡和活化（图5），再次证明GPIbα抗体可引起血小板内Akt活化，Akt参与调控抗GPIbα抗体信号传导，抑制Akt活性可明显抑制抗GPIbα抗体结合血小板发生的活化和凋亡现象。

在小鼠和人类血小板中表达的Akt有3种亚型。然而，只有Akt1和Akt2在GPIbα依赖信号中发挥作用。因此，我们选择Akt1基因敲除的小鼠来研究Akt在抗体诱导血小板信号转导中的作用。取7只WT小鼠和7只Akt1-/-小鼠，全血用噻唑橙（0.5µg/mL）和抗CD41（20µg/mL）抗体标记后，在室温下孵育15min，眼眶采血收集全血，Sysmex XP-100血液分析仪计数血小板数量，并用JC1（2µg/mL）检测线粒体膜电位去极化（图6c），FITC-lactadherin（10µg/mL）标记PS（图6d），FITC-human CD62P（20µg/mL）标记P选择素（图6a）以及PE-JON/A（20µg/mL）标记活化GPIIb/IIIa（图6b）。实验结果发现，在Akt1缺乏的血小板中抗GPIbα抗体诱导的血小板活化和凋亡现象明显减少（图6），因此，这些结果证明Akt在抗GPIbα抗体诱导血小板凋亡和活化中起关键作用。

（4）Akt通过激活依赖cAMP的磷酸二酯酶（PDE3A）和磷酸二酯酶（PDE3A）介导的蛋白激酶来调控血小板凋亡

我们最近证实PKA在调控血小板凋亡中起关键作用，PKA抑制通过BAD脱磷酸化来抑制血小板凋亡。因此，我们在本研究中检测了PKA活性，发现SZ2处理的血小板中，PKA的活性确实降低了，PKA底物VASP的脱磷酸化证明了这一点（图7）。

为了证实活化的Akt如何减少血小板PKA的活性，常温下，3×10⁸/mL的洗涤血小板与PI3K抑制剂，Akt抑制剂和PDE3A抑制剂或DMSO内参共孵育5min后加入SZ2孵育在37℃下孵育8h，通过Western blot，ECL发光分析显示，PI3K、Akt或PDE3A抑制剂均可抑制SZ2处理的血小板中的PKA活性（图7）。这些结果表明，Akt通过调控PDE3A介导的PKA活性来调控血小板凋亡。

（5）抑制Akt活化介导的血小板活化和凋亡可以挽救抗GPIbα抗体结合的血小板在体内被清除

体外试验显示，MK2206和Akt Inhibitor III抑制抗GPIbα抗体诱导的血小板活化和凋亡。因此，MK2206和Akt Inhibitor III应该可以挽救抗体诱导血小板在体内被清除。为了证实这一点，小鼠下腔静脉血3.8％柠檬酸钠抗凝后，1100rpm，11min离心后得PRP，静息20min后，将小鼠PRP分别与0.9%生理盐水和MK2206（0.05ug/g、0.5ug/g）在37℃下孵育回输小鼠体内，小鼠输注R300（5µg/mL），检测血小板含量的变化，实验结果显示，MK2206抑制了抗GPIbα抗体结合血小板的减少（图8）。

取7只WT小鼠和7只Akt+/-小鼠，小鼠输注R300（5µg/mL），在0h、0.5h、2h、4h和6h下眼眶采血收集全血，Sysmex XP-100血液分析仪计数血小板数量。实验发现，在Akt+/-小鼠中，抗GPIbα抗体R300诱导血小板清除作用明显减弱，再次证实了我们的结论（图9）。

Akt活化是抗GPIbα抗体诱导血小板活化和凋亡的关键。因此，可以想象，抑制Akt的活化可以抑制抗GPIbα抗体诱导的血小板清除。实验结果也证明Akt抑制剂的确明显减少了抗GPIbα抗体诱导的血小板清除。

综上可知，这些结果表明抗GPIbα抗体诱导Akt活化介导的血小板活化和凋亡。Akt通过激活依赖cAMP的磷酸二酯酶（PDE3A）和磷酸二酯酶（PDE3A）介导的蛋白激酶A来调控血小板凋亡。抑制Akt活化介导的血小板活化和凋亡可阻止结合抗体的血小板被清除。

以上所述仅为本发明的一种实施方式，不是全部或唯一的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

Claims (6)

1.Akt抑制剂在制备治疗抗血小板GPIbα抗体诱导的免疫性血小板减少症药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的Akt抑制剂在制备治疗抗血小板GPIbα抗体诱导的免疫性血小板减少症药物中的用途，其特征在于，所述的Akt抑制剂包括Akt不同分类或亚型抑制剂、ATP竞争性抑制剂、酪氨酸和磷酸肌醇激酶双重抑制剂。

3.根据权利要求1所述的Akt抑制剂在制备治疗抗血小板GPIbα抗体诱导的免疫性血小板减少症药物中的用途，其特征在于，所述Akt抑制剂为Akt抑制剂III或MK-2206。

4.根据权利要求1所述的Akt抑制剂在制备治疗抗血小板GPIbα抗体诱导的免疫性血小板减少症药物中的用途，其特征在于，所述的药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、缓释制剂、控释制剂、口服液或贴剂。

5.根据权利要求1所述的Akt抑制剂在制备治疗抗血小板GPIbα抗体诱导的免疫性血小板减少症药物中的用途，其特征在于，所述的药物包含药学上有效剂量的Akt抑制剂和药学上可接受的载体。

6.根据权利要求1所述的Akt抑制剂在制备治疗抗血小板GPIbα抗体诱导的免疫性血小板减少症药物中的用途，其特征在于，所述的药物通过口服、注射、喷雾吸入或经胃肠道进行给药。

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