CN105878232B - 穗花杉双黄酮在制备治疗血小板减小症药物的应用 - Google Patents
穗花杉双黄酮在制备治疗血小板减小症药物的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种治疗血小板减少症的药物的用途，具体涉及穗花杉双黄酮在制备治疗血小板减少症的药物的应用。可通过添加药学上可接受的常规辅料，将穗花杉双黄酮制备成口服制剂或注射制剂。药效学试验表明穗花杉双黄酮能有效抑制因化疗药物导致的血小板减少和血小板减少性紫癜的治疗，疗效显著，毒副作用小。
Description
技术领域
本发明属于药物技术领域，涉及一种治疗血小板减少症的药物，具体地说，涉及穗花杉双黄酮在制备治疗血小板减小症的药物的应用。
背景技术
血小板是从骨髓成熟的巨核细胞胞质裂解脱落下来的具有生物活性的小块胞质。血小板具有特定的形态结构和生化组成，在正常血液中有较恒定的数量，健康人血小板数量为100×109/L～300×109/L。血小板在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理过程中有重要作用。
正常外周血小板计数＜100×109/L称为血小板减少症。因血小板减少而导致的出血大约占临床出血性疾病的30％。一般情况下，血小板计数＜20×109/L时，可出现自发性内脏出血，颅内出血等致命性出血。血小板减少可以由多种原因引起，按病因分类主要有化疗所致血小板减少症(chemotherapy-induced thrombocytopenia，CIT)、免疫性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)、脾功能亢进症等。由于血小板一旦减少至病理状态，恢复较慢，临床上又没有特效药，因此如何解决血小板减少症是临床迫切需要解决的难题。
输注血小板是治疗血小板减少症的传统方法，但输注血液制品不仅有感染血源性传播疾病的危险，而且反复输注可诱发患者发生同种异体免疫反应，从而降低输注效果，引发其他严重不良反应。血小板保存时间短、高昂的输血费用和紧缺的血源更使得该种 治疗方法受到了较大的限制。
治疗血小板减少症，除了传统的血液制品输注外，目前应用于临床的还有重组人白介素-11(rhIL-11)、重组人白介素-11衍生物(rhIL-11Ala10)和重组人血小板生成素(rhTPO)。rhIL-11虽然对血小板减少有不错的效果，但较高的不良反应发生率限制了其应用，比如肌肉关节痛、结膜充血、下肢水肿、皮疹、心悸、心律失常、水肿、发热、注射局部疼痛、头痛头晕、乏力等。
重组人血小板生成素虽能有效地促进非造血系统肿瘤化疗后血小板生成，但对造血系统肿瘤化疗后的血小板生成作用并不理想。临床研究中发现，rhTPO常见的副作用有发热、乏力、肌痛、头痛、关节痛、呼吸困难、腹泻、肺栓塞，少数癌症患者在治疗中出现了血栓栓塞，以及不可逆骨髓网状纤维增生等多种并发症或后遗症。
中医认为血小板减少属于“发斑”、“血证”范畴，其病因在于热毒炽盛，气不摄血，致使血妄行或可能为肝实脾虚，肝木凌土，脾不统血而引发该病。不同病因导致的血小板减少症的中医治疗方案有着明显区别。对于血小板减少性紫癜(ITP)，常用药物有江南卷柏片、血小板胶囊、维血宁颗粒等。针对化疗后引起的血小板减少症，常用中药有人参、黄芪、白术、当归、地黄、阿胶、鸡血藤、补骨脂、枸杞子、女贞子、仙鹤草、花生衣等，也有些复方制剂如复方皂矾丸、升板方等。
江南卷柏(Selaginella Moellendorfii Hieron.)属于卷柏科(Selaginellaceae)卷柏属(Selaginella)植物，别名石柏、岩柏草、黄疸卷柏，主要分布于我国长江流域以及长江以南各地，北至秦岭山区。江南卷柏具有清热解毒、止血生肌、抗癌等功能，临床上用于治疗原发性血小板减少性紫癜、肺炎、癌症、眼结膜炎、急性扁桃体炎和乳腺炎等症。江南卷柏单味药制剂江南卷柏片临床适用于血热妄行所致的皮下紫瘫，症见皮肤出现散在青紫斑点或斑块，舌红、苔黄、脉数等，原发性血小板减少性紫癜见上述血热症候者。但江南卷柏治疗原发性血小板减少性紫癜的活性成分尚不明确。为了揭示江南卷柏治疗原发性血小板减少性紫癜的药效物质基础，本课题组对江南卷柏进行了较为系统的化学成分研究，分离鉴定了穗花杉双黄酮(Amentoflavone)、榧双黄酮(Kayaflavone)、罗汉松双黄酮A(Podocarpusflavone A)、扁柏双黄酮(Hinokiflavone)等单体化合物。采用人巨核细胞株Dami增殖分化的体外药效筛选模型考察分离得到的单体化合物对血小板生成的影响，结果发现本植物分离得到的穗花杉双黄酮(0.5，2.5，12.5μM)具有促进巨核细胞增殖分化、释放血小板入血的的作用，初步提示穗花杉双黄酮为传统中药江南卷柏促进血小板生成的药效活性成分。为了进一步验证穗花杉双黄酮的促进血小板生成的药效活性，采用注射卡铂致BALB/c小鼠血小板减少模型，及原发免疫性血小板减少性紫癜小鼠模型等两种药效试验模型，结果显示穗花杉双黄酮口服给药对卡铂导致BALB/c小鼠血小板减少及原发免疫性血小板减少性紫癜小鼠的血小板减少均具有明显的改善作用，具有升血小板、改善血小板功能、及增加血小板聚集率等药效活性。安全性试验表明，以6.0g/kg剂量给SD大鼠单次灌胃给药，穗花杉双黄酮最大耐受剂量为6.0g/kg，未发现与药物有关的毒理学异常，本品安全性较好。
目前，已有少量穗花杉双黄酮用于抗癌、抗紫外线导致的皮肤损伤、治疗认知障碍、降血糖、舒张血管等的报道。申请号为201510303792.4的专利申请中介绍，药物组合物包括穗花杉双黄酮、当药苦苷、丁香苦苷、獐牙菜苷，可以治疗肝癌、肺癌、胃癌。
申请号为200910066695.2的专利申请中介绍，穗花杉双黄酮具有抗心肌缺血，可用于治疗由心肌缺血等引起的心血管疾病。
申请号为200910066524.X的专利申请中介绍，穗花杉双黄酮具有α-葡萄糖苷酶抑制作用、降血糖作用和调血脂作用，可用于预防和治疗高血糖及高血脂症。
申请号为2009100640581的专利申请中介绍，通过CCl4致肝损伤小鼠模型体内实验证实，穗花杉双黄酮能降低肝损伤小鼠的血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平，达到保肝降酶的作用。
但是，上述现有技术并未报道将穗花杉双黄酮用于血小板减少症的治疗，更未公开穗花杉双黄酮在治疗血小板减小症的应用。
以上所示穗花杉双黄酮的植物来源可以是卷柏科卷柏属江南卷柏(S.Moellendorfii)、卷柏(S.Tamariscina)，垫状卷柏(S.pulvinata)等，也可以是卷柏科其他植物中分离，其来源也可以是化学合成，也可以是在某个黄酮类化合物的基础上进行结构修饰或生物转化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种穗花杉双黄酮在制备治疗血小板减小症的药物组合物的用途。
具体的，本发明涉及一种治疗血小板减少症的药物组合物的用途，其中所述血小板减少症包括由化疗药物所致的血小板减少、原发性和继发性血小板减少性紫癜、再生障碍性贫血及骨髓增生异常综合症。
进一步，本发明所述的血小板减少症为化疗药物所致血小板减少症。
本发明提供了一种药物组合物，其包含穗花杉双黄酮和一种或多种药学上可接受的药用赋形剂。
本发明还提供了一种药物组合物，其含有有效治疗剂量的穗花杉双黄酮与其它药物制成的制剂。其中，所述其它药物包括但不限于罗汉松双黄酮A(Podocarpusflavone A)、榧双黄酮(Kayaflavone)、扁柏双黄酮(Hinokiflavone)等。
本发明提供了一种药物组合物，其为由含有1％-99％的穗花杉双黄酮或其它可组方的药物和99％-1％的药用赋形剂制成的口服制剂或注射制剂。优选含有5％-50％的穗花杉双黄酮或其它可组方的药物和95％-50％的药用赋形剂制成的口服制剂或注射制剂。
本发明通过添加药学尚可接受的常规辅料，将穗花杉双黄酮制备成口服制剂或注射 制剂，应用于临床治疗血小板减少症。
进一步优选的，所述口服制剂为片剂、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、丸剂、口服液体制剂当中的任何一种；所述的注射制剂为注射液或粉针剂。其中，口服制剂为普通片剂、胶囊剂、分散片、口腔崩解片或缓释片；所述的注射制剂为注射液。
本发明的技术效果：本发明首次发现了穗花杉双黄酮能够用于血小板减少症的治疗。药效学试验证实穗花杉双黄酮能有效抑制因化疗药物导致的血小板减少和血小板减少性紫癜的治疗，疗效显著，毒副作用小。
附图说明
图1：江南卷柏双黄酮类化合物对人巨核细胞株Dami细胞活性的影响
与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
图2：MTT法检测江南卷柏双黄酮类化合物对Dami细胞的增殖作用
与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
图3：江南卷柏双黄酮类化合物对Dami巨核细胞集落生成的影响。
图4：江南卷柏双黄酮类化合物对Dami巨核细胞多倍体的影响
与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
图5：江南卷柏双黄酮类化合物对Dami巨核细胞表面CD41表达率的影响
与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
具体实施方式
以下是关于江南卷柏双黄酮类化合物的体外促进血小板生成的细胞活性筛选研究，以及穗花杉双黄酮单体化合物的注射卡铂致BALB/c小鼠血小板减少模型，及原发免疫性血小板减少性紫癜小鼠模型的药效学试验研究。
实施例1江南卷柏黄酮类化合物的体外细胞活性筛选
1.1试验材料与仪器
1.1.1试验材料
Dami细胞，广州吉妮欧生物科技有限公司；RPMI-1640培养基，南京凯基生物科技发展有限公司；胎牛血清，美国ScienCell公司；双抗(青霉素、链霉素)南京凯基生物科技有限公司；台盼蓝，加拿大BioBasic有限责任公司；噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)，南京凯基生物科技发展有限公司；β-巯基乙醇，美国Amresco公司；姬姆萨(Giemsa)色素，国药集团化学试剂有限公司；琼脂粉，美国PeproTech公司；人血小板生成素(humanthrombopoietin，TPO)，美国PeproTech公司；CD41-FITC，美国BioLegend公司；碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料、RNA酶，美国Sigma公司；穗花杉双黄酮、榧双黄酮、罗汉松双黄酮A、扁柏双黄酮等均从江南卷柏(S.Mollendorfii)中分离得到，NMR，MS等波谱方法鉴定结构，纯度均＞95％。
1.1.2试验仪器：
酶标仪，瑞士Tecan公司；倒置荧光显微镜，日本Nikon公司；FACS Calibar流式细胞仪，美国BD公司。
1.2试验方法
1.2.1细胞培养及分组
RPMI-1640培养基中添加体积分数10％胎牛血清和1％双抗配成完全培养基，于37℃、5％CO2、95％相对湿度条件下培养人巨核细胞株Dami，取对数生长期的细胞用于实验。取穗花杉双黄酮、榧双黄酮、罗汉松双黄酮A、扁柏双黄酮等单体化合物分别溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，使储备液浓度为10mmol/L，存放于-80℃冰箱中， 使用时用完全培养基稀释至所需浓度。细胞分组：按受试药在细胞培养液终浓度为0.5、2.5、12.5μmol/L分别与Dami细胞共同培养，将完全培养基培养的细胞设为对照组。
1.2.2台盼蓝染色实验检测细胞活性
将按照1.2.1节方法常规培养48h的各组细胞悬液与质量分数0.4％的台盼蓝染液按体积比9∶1混合后，滴入计数板。静置1min，使悬浮细胞下沉，在显微镜下计数。未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。按照下式计算活细胞比例。
活细胞比例(％)＝(细胞总数-死细胞数)/细胞总数×100％
1.2.3 MTT细胞增殖实验
细胞达到对数生长期后按5×104个/mL的密度接种于96孔板中，每孔体积200μL，每组设6个复孔。放入培养箱中常规培养48h后离心，弃去上清液，每孔加入20μL质量分数0.5％MTT溶液，继续培养4h后弃去上清液，每孔加入150μL DMSO，在微量振荡仪上振荡5min，于酶标仪上570nm波长处测定吸光度。
1.2.4细胞集落培养实验
取无菌离心管5支，按体积分数依次加入60％RPMI-1640培养基、10％β-巯基乙醇(10mmol/L)、10％FBS、10％各组细胞悬液(调整细胞密度为104个/mL)、50ng/mL TPO，混匀后在37℃条件下预热。取预热的琼脂迅速按10％体积分数加入到各组细胞悬液中，混匀后接种于3.5cm培养皿上。数十分钟后待其凝固，放入培养箱中常规培养。5天后取出，在显微镜下观察细胞集落生长情况，每个培养皿底以“米”字等分为8份，每份中选取两个视野，记录每组集落数目之和，大于或等于10个细胞记为一个集落。
1.2.5细胞Giemsa染色实验
细胞常规培养2天后取各组细胞涂于载玻片上。待自然晾干后，于甲醇中固定5min，然后在Giemsa染色液中浸染20min，流水冲洗后晾干，中性树胶封固并在显微镜下观察，选取每张载玻片的4个顶角及载玻片中间共5个视野拍照。
1.2.6流式细胞仪定量检测细胞DNA多倍体
收集常规培养天的各组细胞于洁净的EP管中，调整细胞密度为1×106个/mL。细胞固定15min后用体积分数70％乙醇通透细胞1h，洗涤细胞两次，取100mL细胞悬液于流式细胞上样管中，加入RNA酶，37℃条件下孵育20min，再加入PI染料(对照组不加)，避光作用20min后每管加入磷酸盐缓冲液(PBS)至500mL，用流式细胞仪检测细胞DNA浓度分析其多倍体生成情况。
1.2.7流式细胞术测定细胞表面CD41含量
流式细胞术细胞样本收集同1.2.6节，细胞洗涤两次后取100mL细胞悬液于流式细胞上样管中，分别加入流式抗体CD41-FITC，每组设两个平行样并设IgG同型对照组。细胞与抗体避光孵育15min后，每管加入400mL PBS，在流式细胞仪上检测其表达情况。
1.2.8数据分析
每项实验至少重复3次，数值采用SPSS 16.0软件包进行统计分析，结果以表示。多组均数的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，两组间的比较采用t检验分析。
1.3试验结果
1.3.1江南卷柏双黄酮类化合物对人巨核细胞株Dami活性的影响
各组细胞在培养箱中培养2d后，计算其活细胞比例，结果见附图1。2.5、12.5μM的穗花杉双黄酮和12.5μM的罗汉松双黄酮A与细胞共同培养后，活细胞比例显著高于对照组，其他双黄酮类化合物对细胞活性没有显著影响。
1.3.2江南卷柏双黄酮类化合物对人巨核细胞株增殖能力的影响
采用MTT法检测江南卷柏双黄酮类化合物对Dami细胞增殖能力的影响，如附图2所示，0.5、2.5、12.5μM的穗花杉双黄酮和12.5μM的罗汉松双黄酮A与细胞共同培养后，可显著增强dami细胞的增殖能力，其他双黄酮类化合物对细胞增殖能力没有显著影响。
1.3.3江南卷柏双黄酮类化合物对Dami巨核细胞集落生成的影响
Dami巨核细胞集落培养结果见附图3，与对照组相比，0.5、2.5、12.5μM的穗花杉双黄酮共同培养的细胞集落生成数目明显高于对照组，具有显著性差异(P＜0.01)，其他双黄酮类化合物各剂量组的细胞集落生成数目与对照组相比没有统计学差异。
1.3.4江南卷柏双黄酮类化合物对Dami细胞DNA多倍体生成的影响
如附图4所示，流式细胞仪检测细胞DNA多倍体数目结果显示，与对照组相比，12.5μM穗花杉双黄酮与细胞共同培养后＞8N细胞比例明显增加。其他双黄酮类化合物各剂量组对巨核细胞多倍体的影响与对照组相比没有统计学差异。
1.3.5江南卷柏双黄酮类化合物对Dami巨核细胞表面CD41表达量的影响
流式细胞术检测细胞表面CD41阳性表达率结果见附图5，与对照组相比，穗花杉双黄酮(0.5、2.5、12.5μM)三个剂量组与细胞共同孵育后表面CD41表达率明显增加(P＜0.01)。说明穗花杉双黄酮可增加细胞成熟度，其他双黄酮类化合物各剂量组与对照组相比没有统计学差异。
综上所述，巨核细胞增殖分化是血小板产生的前提，巨核细胞经过成熟、前血小板的产生、细胞内外环境作用等一系列过程后最终将血小板释放到血液中。促进巨核细胞增殖分化可以维持体内血小板活化凋亡后数目的稳定。
本研究首次发现穗花杉双黄酮能明显增强Dami细胞活性，细胞增殖能力也明显增强，细胞Giemsa染色实验与细胞DNA多倍体检测结果分别定性、定量地说明了细胞在穗花杉双黄酮作用下分化能力显著增强，与此同时细胞的成熟度也相应增加。因此，穗花杉双黄酮能够在体外有效促进人巨核细胞的增殖分化。
实施例2穗花杉双黄酮对注射卡铂致BALB/c小鼠血小板减少模型的影响
2.1试验材料与仪器
2.1.1试验药品及配制方法：
卡铂注射液，规格100mg∶10ml，齐鲁制药有限公司，批号：9080082ES，临用前用生理盐水配成6.25mg/ml。
注射用重组人白介素-11(IL-11)，规格100mg∶10ml，齐鲁制药有限公司，批号：201412061SM，临用前用生理盐水配成0.05mg/ml。
试药穗花杉双黄酮，实验室自制，临用前用生理盐水配置成0.5、1.5、5mg/ml，用于灌胃给药。
2.1.2试验仪器：
血球计数板，上海求精生化试剂有限公司；OLYMPUS-CH普通光学显微镜，日本OLYMPUS公司。
2.1.3试验动物：
清洁级BALB/C小鼠，雄性，体重24-28g，扬州大学比较医学中心，合格证号：SCXK(苏)2012-0004。
2.2试验方法
2.2.1动物分组及给药方法
60只BALB/C小鼠，随机分为6组，每组10只，分别为：正常对照组、模型组、阳性药IL-11组、穗花杉双黄酮组低、中、高剂量组(10、30、100mg/kg)。化疗前7天(d-7)，正常对照组、模型组和阳性药IL-11组分别灌胃给予生理盐水0.2ml/10g/d，穗花杉双黄酮低、中、高组按0.2ml/10g体积分别灌胃给予10、30、100mg/kg/d穗花杉双黄酮混悬溶液，各组每天给药，连续7天(d-7～d-1)；化疗前最后1天灌胃后(d-1)，开始化疗，模型组、阳性药IL-11组和穗花杉双黄酮低、中、高剂量组分别一次性腹腔注射125mg/kg卡铂，正常对照组腹腔注射等体积生理盐水；次日(d1)，正常对照组和模型组继续分别灌胃给予生理盐水0.2ml/10g/d，阳性药IL-11组按0.2ml/10g皮下注射IL-11 0.25mg/kg/d，穗花杉双黄酮低、中、高组按0.2ml/10g体积分别灌胃给予10、30、100mg/kg/d穗花杉双黄酮溶液，各组每天给药，连续14天(d1～d14)。
2.2.2指标检测方法
2.2.2.1试验动物一般状况
观察小鼠精神状况、活动及死亡情况。
2.2.2.2试验动物体重变化
于d-8、d-4、d-1、d3、d7、d10、d14称量体重，记录体重变化。
2.2.2.3外周血小板计数
各组动物分别于d-8、d-4、d-1、d3、d7、d10、d14，尾部取血，参照徐叔云编写的1994版《药理实验方法学》第1106～1107页方法，用血细胞计数板，手工计算外周血小板数量。
2.2.2.4统计学方法
统计描述用“平均值±标准差”表示，多组间均值比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。
2.3试验结果
2.3.1试验动物一般状况
造模前，各组小鼠毛色发亮，活动自如，行为、精神状态正常；造模后的小鼠毛色枯槁，出现身体发软、扎堆、精神萎靡、眯眼、反应迟钝、软便等，阳性药IL-11组和穗花杉双黄酮低、中、高剂量组的小鼠，行为及精神状态较模型组有所改善。
2.3.2试验动物体重的变化
各组试验动物化疗前后体重变化见表1。化疗前，正常对照组、模型组、阳性药IL-11组、不同剂量的穗花杉双黄酮组，小鼠体重均正常增长，各组与空白对照组比较，均无显著性差异。化疗后，模型组小鼠体重明显减轻，与正常对照组有显著性差异；阳性药IL-11组小鼠在化疗初期体重明显减轻，化疗后第10、14天，体重趋于稳定，与模型组 相比有显著性提高；给予不同剂量的穗花杉双黄酮组小鼠在化疗初期体重明显减轻，化疗中、后期，体重趋于稳定，并有所回升，其中高剂量组最为明显，与模型组相比体重显著性提高。
表1 试验动物体重的变化
注：与模型组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
2.3.3外周血小板计数
由表2可见，试验前各组动物的血小板计数无明显差异。化疗前，穗花杉双黄酮组预给药一周后，中剂量和高剂量组小鼠的血小板计数明显高于正常对照组。化疗后，模型组小鼠的血小板计数显著下降。阳性药IL-11组和穗花杉双黄酮低、中、高剂量组小鼠的血小板计数均出现不同程度的回升，其中穗花杉双黄酮高剂量组效果最为明显。
表2 各组试验动物外周血小板计数的变化(×109/L，
注：与模型组相比，*p＜0.05，**p＜0.01。
2.4结论
由以上结果可知，分别连续21天灌胃给予10、30、100mg/kg穗花杉双黄酮溶液，可以显著抑制化疗药物卡铂导致的BALB/C小鼠外周血中血小板降低，其中30、100mg/kg剂量组疗效优于0.25mg/kg剂量的IL-11组。说明穗花杉双黄酮可以用于化疗导致血小板减少症的治疗。
实施例3穗花杉双黄酮对特发性血小板减少性紫癜的影响
3.1试验材料与仪器
3.1.1试验药品及配制方法：
醋酸泼尼松片，规格：5mg/片，天津药业集团新郑股份有限公司，批号：150126，临用前研成粉末，用生理盐水配成1mg/ml的混悬液。试药穗花杉双黄酮，实验室自制，临用前用生理盐水配置成0.5、1.5、5mg/ml，用于灌胃给药。
3.1.2试验仪器：
血球计数板，上海求精生化试剂有限公司；OLYMPUS-CH普通光学显微镜，日本OLYMPUS公司。
3.1.3试验动物：
清洁级BALB/C小鼠，雄性，体重18-22g，扬州大学比较医学中心，合格证号：SCXK(苏)2012-0004；健康普通级豚鼠，体重250-350g，青龙山动物繁殖场，许可证号：SYXK(苏)2010-0006。
3.2试验方法
3.2.1豚鼠抗BALB/C小鼠血小板抗血清的制备
抗原的制备：取BALB/C小鼠断头取全血，肝素抗凝，800rpm离心10min后，取上层富含血小板血浆(PRP)3000rpm离心10min以沉淀血小板。用0.15moL/L pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤血小板，每次均以3000rpm离心10min，弃去上层液体，连续3次。然后以0.15moL/LpH7.4PBS悬浮血小板，计数后备用。
免疫方法：取上述制备好的BALB/C小鼠血小板分别与等量完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂混合成油包水型乳剂。取完全弗氏佐剂抗原于0周皮下注射于豚鼠足掌、腹部、背部、腋窝等处，至少四点，每点0.2mL。取不完全弗氏佐剂抗原于1、2、4周皮下注射于豚鼠足掌、腹部、背部、腋部等处，每次至少四点，每点0.2mL。每次注射完后在注射点用碘酒消毒以防感染。第五周乙醚麻醉豚鼠，股动脉取不抗凝全血，室温放置1h，然后置4℃过夜，此时血清已与血块分离，吸出血清，1500rpm离心20min，取上清液即为豚鼠抗BALB/C小鼠血小板抗血清(GP-APS)，贮存于-20℃冰箱中待用。
抗血清(APS)效价的检测：参照ELISA法加以改进，用国产冻干酶联A蛋白纯品代替碱性磷酸酶-蛋白A酶标抗体，原理相同。
抗血清(APS)的处理：将APS从-20℃中取出，于56℃水浴30min，用等量BALB/C小鼠红细胞(5％)吸附至少两次，用生理盐水稀释成1∶4的APS待用。
3.2.2动物分组及给药方法
60只BALB/C小鼠，随机分为6组，每组10只，分别为：正常对照组、模型组、阳性药醋酸泼尼松组、穗花杉双黄酮组低、中、高剂量组(10、30、100mg/kg)。造模第5天(d5)开始按0.2mL/10g/d灌胃给药，至造模后第14天(d14)。正常对照组、模型组灌胃生理盐水，阳性药醋酸泼尼松组按20mg/kg剂量灌胃醋酸泼尼松混悬液，穗花杉双黄酮组低、中、高剂量组分别按10、30、100mg/kg剂量给药。
3.2.3原发免疫性血小板减少性紫癜模型的建立
于d1、d3、d5、d7、d9、d11、d13，正常对照组腹腔注射0.1mL/20g生理盐水，其余5组小鼠分别腹腔注射0.1mL/20g的1∶4豚鼠抗血小板血清(APS)。
3.2.4指标检测方法
3.2.4.1小鼠一般状况
观察小鼠精神状况、活动及死亡情况。
3.2.4.2脾脏系数
于d14给药后处死，剥取脾脏，用生理盐水冲洗，吸去水分，精密称量，计算脏器系数，脾脏系数＝脾脏质量/小鼠体重×100％。
3.2.4.3外周血小板计数
各组动物分别于造模前(d0)、给药前(d4)、试验结束时(d14)，尾部取血，参照徐叔云编写的1994版《药理实验方法学》第1106～1107页方法，用血细胞计数板，手工计算外周血小板数量。
3.2.4.4统计学方法
统计描述用“平均值±标准差”表示，多组间均值比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。
3.3试验结果
3.3.1小鼠一般状况
正常对照组小鼠反应灵活，毛色光亮，大便呈条状。模型组在造模后第3天出现软便，大部分均表现出反应迟钝、虚弱、眯眼、竖毛、扎堆、体重减轻等症状，小部分消化道出血、便血。各给药组与模型组小鼠比较，一般状况有所好转。
3.3.2脾脏系数
试验结束时，将各组试验小鼠处死、解剖后可见，各脏器未见明显异常。由表4可见，与正常对照组相比，模型组小鼠的脾脏指数明显下升高。与模型组相比，阳性药醋酸泼尼松组小鼠脾脏指数显著降低，接近正常水平；穗花杉双黄酮低、中、高剂量组小鼠的脾脏指数有所降低，高剂量组具有显著性差异。
表4 各组试验动物脾脏指数比较
3.3.3外周血小板计数
各组动物在造模前(d0)、给药前(d4)、试验结束时(d14)的外周血小板计数结果见表5。由结果可见，造模前各组动物的血小板计数无明显差异。造模后，与正常对照组相比，模型组、阳性药醋酸泼尼松组和穗花杉双黄酮低、中、高剂量组小鼠的外周血小板计数显著下降。给药10天后，与模型组相比，阳性药醋酸泼尼松组、穗花杉双黄酮低、中、高剂量组小鼠的外周血小板计数显著升高，其中穗花杉双黄酮高剂量组效果最为明显。
表5 各组试验动物外周血小板计数的变化
注：与正常对照组相比，###p＜0.001；与模型组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
3.4结论
由以上结果可知，分别连续10天灌胃给予10、30、100mg/kg穗花杉双黄酮溶液，可以显著抑制豚鼠抗BALB/C小鼠血小板抗血清导致的BALB/C小鼠免疫性血小板减少，其中30、100mg/kg剂量组疗效优于20mg/kg剂量的醋酸泼尼松组。说明穗花杉双黄酮可以用于免疫性血小板减少性紫癜的治疗。
实施例4穗花杉双黄酮片剂的制备
分别取穗花杉双黄酮、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、滑石粉、硬脂酸镁适量，分别过80目筛网，备用。取过80目筛穗花杉双黄酮50g、微晶纤维素120g、羧甲基纤维素钠30g充分混合均匀，加入适量水做粘合剂，过24目筛网制粒，放入60℃烘箱干燥2小时，过24目筛网整粒，加入适量硬脂酸镁和滑石粉，混合均匀，压片，制成1000片，即得。规格：50mg，每次2片，每日2次。
实施例5穗花杉双黄酮注射剂的制备
取穗花杉双黄酮10g，加入适量0.9％氯化钠溶液溶解后，加入适量增溶剂及稳定剂，配制至10L，过滤，分装成每瓶10mL，热压灭菌，即得。规格：10mg∶10ml，每次1支，每日1次，临用前用100ml生理盐水稀释，静脉滴注。
Claims (9)
1.穗花杉双黄酮在制备治疗血小板减少症药物组合物的用途，所述血小板减少症包括由化疗药物所致的血小板减少症、原发性和继发性血小板减少性紫癜。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物含有有效治疗剂量的穗花杉双黄酮和一种或多种药学上可接受的药用赋形剂。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物含有有效治疗剂量的穗花杉双黄酮与其它药物制成的制剂。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物为含有1％-99％的穗花杉双黄酮和99％-1％的药用赋形剂制成的口服制剂或注射制剂。
5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述的药物组合物为含有5％-50％的穗花杉双黄酮和95％-50％的药用赋形剂制成的口服制剂或注射制剂。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的口服制剂选自于片剂、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、丸剂、口服液体制剂当中的任何一种。
7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的注射制剂为注射液或粉针剂。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的片剂为普通片剂、分散片、口腔崩解片或缓释片。
9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的注射制剂为注射液。
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