CN108186686A - 一种基于脑-肠轴抗慢性不可预知应激所致抑郁症的药物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及丁酸梭菌的用途，具体涉及丁酸梭菌制剂在治疗抑郁症的药物中的应用，属于生物制药领域。本发明公开了丁酸梭菌制剂在治疗抑郁症的组合物，本发明经动物实验研究证明，丁酸梭菌能够改善抑郁行为，增加抑郁症模型小鼠脑组织5‑HT的含量，能够发挥抗抑郁症的作用。本发明具有疗效好、无毒副作用，值得推广。

Description

一种基于脑-肠轴抗慢性不可预知应激所致抑郁症的药物及 其应用

技术领域

本发明涉及丁酸梭菌的用途，具体涉及丁酸梭菌制剂在治疗抑郁症的药物中的应用，属于生物制药领域。

背景技术

抑郁症是一种以持续性、显著性心境低落为主要特征的精神疾病，临床症状复杂，有情绪低落，兴趣减退，言语减少等症状，其程度可从轻度忧伤到重度绝望，甚至自杀等，给人们的工作、生活造成严重影响，是精神科自杀率最高的疾病。随着社会的发展，生活节奏过快，竞争过于激烈，人类的精神压力过大，导致诱发抑郁症的环境因素日益剧增，均会引发紧张激动或焦虑忧郁，对机体正常生理活动产生广泛的不利影响。据世界卫生组织(WHO)预计，到2020年，抑郁症可能成为仅次于缺血性心脏病的世界第二大疾病，已成为现代社会的常见病、高发病。因而，抑郁症也愈来愈引起社会各界的广泛关注。

抑郁症的发病机制较为复杂，目前仍无法完全解释，临床上提出多种假说，如单胺类神经递质假说、细胞因子假说、下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴功能障碍假说、氨基酸神经递质假说等。而针对发病机制可将抗抑郁药物分为：选择性5-HT再摄取抑制剂(SSRIs)、5-HT和NE再摄取抑制剂(SNRIs)、去甲肾上腺素能及特异性5-HT能抗抑郁药物(NaSSAs)、三环类抗抑郁药(TCAs)、单胺氧化酶抑制药(MAOIs)。临床上抗抑郁药物大多是对单胺类神经递质(5-HT、NE)的含量进行调节，但长期以来抗抑郁药物都有“延迟效应”，即给予抗抑郁药后突触间隙内单胺类神经递质含量很快恢复正常，而抑郁症的临床症状却需要给药一段时间(约2周)后才能消失，现有假说无法解释这一现象，故对于机制的不断深入研究是绝对有必要的。并且服用抗抑郁药物的患者中有30％的患者治疗效果并不明显，即“难治性抑郁症”。针对该种抑郁症临床上尚无绝对有效的治疗手段，而这正是我们需要探索发现的新领域。

而近年来，对于抑郁症机制的研究涉及多个领域，而微生物方面却鲜少涉及，但是临床上提示肠道菌群与与抑郁症有密切联系。研究表明，抑郁症患者HPA轴往往过度激活，而动物实验表明肠道菌群紊乱会引起HPA轴活性增强，脑源性神经营养因子(BDNF)水平降低，而补充双歧杆菌能纠正HPA轴，并能增加BDNF表达。抑郁症患者也会出现慢性炎症浸润，促炎症/抗炎症细胞因子比率上升，抗抑郁药物能够减轻炎症，改善病情。而益生菌具有良好的抗炎症作用，还能调节HPA轴紊乱。同时，许多肠道菌群失调引起的常见肠-脑疾病如：肠易激综合征(IBS)、炎性肠道疾病(IBD)和肝性脑病(HE)等，这些疾病不仅具有明显的肠道症状，如排便异常、消化不良、腹痛和肠道炎症等，同时还伴有焦虑、抑郁和认知功能减退等神经精神症状。这显示沟通肠道和脑部组织功能活动的重要枢纽脑-肠轴发挥着重要机制，其与肠道菌群构成肠道菌群-肠-脑轴，影响中枢神经系统的活动。

丁酸梭菌(Clostridium butyricum)是存在于人体肠道中的益生菌，具有维持或恢复肠道优势菌群，调节人体肠道微生态平衡的功能。中国专利CN105012349A公开了一种防治血管性痴呆的益生菌制剂及其制备方法，涉及丁酸梭菌防治血管性痴呆的药物新用途，血管性痴呆主要是由于缺血性病变引起的痴呆，与精神疾病抑郁症发病机制有截然不同区别，抑郁症主要以5-HT含量下降为主要形式；而且丁酸梭菌采用丁酸梭菌菌体，菌体是在细胞壁和细胞膜包裹，细菌的真正活性成分往往不能释放出来，影响功能的发挥。目前未见丁酸梭菌在抑郁症治疗上的报道资料。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷和不足，应用丁酸梭菌活性因子在抑郁症的疾病改善上，进而开发出治疗抑郁症的组合物。本发明的目的是提供一种安全的、有效的治疗抑郁症的药物。

一种抗抑郁症的酪酸梭菌制剂，其特征在于酪酸梭菌制剂的制备方法如下：

(1)种子液制备：挑取单菌落丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1016，保藏编号为CGMCC No.9831，接种于已灭菌的MRS液体培养基中，37℃，厌氧培养24h，即得到丁酸梭菌WZMC1016种子液；

(2)发酵：将步骤(1)得到的种子液按1％重量比的接种量接入已灭菌后的含有以重量百分比计的蛋白胨1-5％、酵母提取物0.5-5％、葡萄糖1-10％、低聚果糖0.5-2％、硫酸铵0.1％、磷酸二氢钾0.05-0.3％、磷酸氢二钾0.05-0.3％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.02％和氯化钙0.002％，其余为去离子水的液体培养基中，经35℃-37℃静置厌氧发酵24h-48h；

(3)收集菌体：将步骤(2)培养得到的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1016发酵液，3000rpm离心5～10min，去掉上清液，得到细菌泥，去离子水2～3次洗涤，制成细菌混悬液，再次用3000rpm离心5～10min，去掉上清液体得沉淀物；

(4)细菌破壁：将步骤(3)得到的沉淀物按1∶5～1∶10加去离子水，在150MPa压力下细胞破碎，得到细胞破壁产物；

(5)洗脱去脂：将在步骤(4)中获得的沉淀物使用乙醇进行反复溶解洗脱，10,000rpm离心15～20min，回收沉淀物，洗脱次数为2～3次，再用去离子水3～5次洗涤，3000rpm离心5～10min，得沉淀物；

(6)冻干成品：将步骤(5)中获得的沉淀物于真空负压状态下冷冻干燥，即可获得纯度达到95％以上的干燥粉末，即得到丁酸梭菌制剂。

本发明的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1016，于2014年10月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，保藏编号为CGMCC No.9831。

由于本发明首次公开了以丁酸梭为药物活性成份在制备治疗抑郁症药物的应用，因此，与辅料组合制成药剂，只要是该药剂用于治疗抑郁症，均属于本发明的保护范围。

本发明的优点及效果：

本发明首次揭示丁酸梭菌在治疗抑郁症的应用，并提供丁酸梭菌制剂的制备方法。

具体实施方式

实施例1

所述的丁酸梭菌制剂的制备方法如下：

(1)种子液制备：挑取单菌落丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1016，保藏编号为CGMCC No.9831，接种于已灭菌的MRS液体培养基中，37℃，厌氧培养24h，即得到丁酸梭菌WZMC1016种子液；

(2)发酵：将步骤(1)得到的种子液按1％重量比的接种量接入已灭菌后的含有以重量百分比计的蛋白胨4％、酵母提取物2.5％、葡萄糖10％、低聚果糖1％、硫酸铵0.1％、磷酸二氢钾0.2％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.02％和氯化钙0.002％，其余为去离子水的液体培养基中，经37℃静置厌氧发酵24h；

(3)收集菌体：将步骤(1)培养得到的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1016发酵液，3000rpm离心10min，去掉上清液，得到细菌泥，去离子水3次洗涤，制成细菌混悬液，再次用3000rpm离心10min，去掉上清液体得沉淀物；

(4)细菌破壁：将步骤(2)得到的沉淀物按1∶10加去离子水，在150MPa压力下细胞破碎，得到细胞破壁产物；

(5)洗脱去脂：将在步骤(3)中获得的沉淀物使用乙醇进行反复溶解洗脱，10,000rpm离心20min，回收沉淀物，洗脱次数为3次，再用去离子水5次洗涤，3000rpm离心10min，得沉淀物；

(6)冻干成品：将步骤(4)中获得的沉淀物于真空负压状态下冷冻干燥，即可获得纯度达到95％以上的干燥粉末，即得到丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1016活性成分。

本发明的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1016，于2014年10月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，保藏编号为CGMCC No.9831。

实施例3

一、实验方法

1.实验动物：C57BL/B6小鼠，体重25～30g，雄性。

2.建立慢性不可预知性轻度应激动物模型：采用慢性不可预知性轻度应激方式，为避免小鼠对单一或有规律的刺激产生耐受性，本实验采用多种轻度刺激交替进行，随机接受28天10种不同的应激，包括热刺激(45℃，5min)、冷水刺激(4℃，5min)、夹尾(据尾尖1cm，1min)、束缚(2h)、足底电击(50mV，30s/次，5min)、昼夜颠倒、45°倾斜(24h)、潮湿垫料(24h)、禁水禁食、悬吊(15min)。每周称量小鼠体重，观察体重增长情况；采用糖水偏好实验、强迫游泳实验、悬尾实验筛选抑郁症小鼠。

3.脑组织的提取

将各组小鼠用水合氯醛(100mg/kg体重，腹腔注射)麻醉，剔去胸骨暴露心脏。经左心室向升主动脉插一次性采血管，连接注射器，先以预冷生理盐水灌洗，同时剪开右心耳，灌注直至肝脏发白为止。继之灌入预冷的4％多聚甲醛(0.1M PBS配制，pH＝7.4)，待肢体僵硬，用大手术剪剪下头部。剥开头皮，以眼科镊沿颅中缝剪开，剥去颅盖，以眼科镊辅助取全脑，置于4％的多聚甲醛(4℃)中后固定72h，每24h更换一次固定液，之后取出，用刀片切去小脑、脑干部分，顺冠状位从大脑的正中位置切，置于70％酒精中继续固定2d，之后可放置较长时间，留待脱水包埋。

4.行为学检测

(1)糖水偏好实验

对小鼠进行预适应：第一个24h给予小鼠两瓶1％蔗糖水，第二个24h给予小鼠一瓶1％蔗糖水和一瓶纯水。禁食禁水24h后，开始糖水偏好实验，同时给予足量饲料。提前称重、标记的两个同样的饮水瓶，分别装有1％蔗糖水和纯水，使其自由选择摄取，24h后取下瓶子再次称重，并计算糖水偏好分数：糖水偏好分数＝糖水摄取量/(糖水摄取量+纯水摄取量)×100％

(2)旷场实验

在方形箱(40cm×40cm×30cm)底部用黑色记号笔等大小划分为25个方格。将小鼠放入平台中心自由活动1min后，记录3min内小鼠穿越格子数目(小鼠四肢至少三只落入格子内)和直立次数(小鼠双前肢离地)，实验时间共4min。每只小鼠实验完后，箱子进行通风、清除粪便等操作，以免气味等因素影响下一只小鼠的实验结果。

(3)强迫游泳实验

在玻璃圆筒中放入1000ml的水，将小鼠放入烧杯。实验时间为6min，前1min让小鼠在水中适应，记录后5min小鼠漂浮不动的时间。每只小鼠实验后烧杯内换水、清洁，防止气味等因素影响下一只小鼠。不动状态表现为小鼠静止地漂浮在水面或只允许其头部有些许转动。

(4)悬尾实验

用橡皮筋捆绑住小鼠尾巴末端约1cm处，将橡皮筋固定在悬绳上，使小鼠离地20cm。每只小鼠实验时间为6min，前1min将小鼠悬挂适应，记录后5min小鼠不动的时间。

5.小鼠脑组织神经递质检测

小鼠脑组织被收集，样品经速冻保存在-20℃的冰箱中，使用时取出，匀浆处理后用ELISA试剂盒检测脑内5-HT，具体步骤见说明书。

6.统计数据分析

本实验至少重复做3次，避免误差。实验结果以平均数±标准差来表示，采用SPSSversion 17数据处理和分析数据，P＜0.05被认为有统计学差异。

二、实验结果

1.抑郁症动物模型的评价

与正常对照组相比，CUMS抑郁症模型组小鼠在糖水偏好实验、旷场实验、强迫游泳实验和悬尾实验等行为学测试结果显示，糖水的摄取量、自发探索行为和自由活动时间均有明显下降(P＜0.05)，表现出对自我的奖赏行为下降和绝望状态。

2.抑郁症行为

实验初始，各组小鼠糖水偏好分数基本一致；CUMS处理两周后，各组糖水偏好分数均下降；实验第4周，CUMS抑郁症模型组小鼠糖水偏爱分数仍旧下降(P＜0.01)；实施例1酪酸梭菌制剂治疗后小鼠糖水偏好分数均有提高(P＜0.01)，说明酪酸梭菌制剂对抑郁症小鼠有治疗作用。单独丁酸梭菌活菌体对抑郁症小鼠抑郁症状有改善作用，但弱于实施例1酪酸梭菌制剂。

3.运动能力

抑郁症会影响小鼠的自发运动能力，小鼠的水平活动能力和垂直活动能力一定程度上反应了其抑郁症的严重程度。结果显示，与正常对照组相比，CUMS抑郁症模型组小鼠水平活动能力和垂直活动能力明显下降(P＜0.01)。与CUMS抑郁症模型组比较，实施例1酪酸梭菌制剂处理后，小鼠水平活动能力和垂直活动能力均有提高(P＜0.01)。与对照组相比，CUMS模型组小鼠强迫游泳和悬尾不动时间明显延长(P＜0.01)。与CUMS抑郁症模型组比较，实施例1酪酸梭菌制剂处理小鼠强迫游泳和悬尾不动时间明显缩短(P＜0.01)。说明实施例1酪酸梭菌制剂对小鼠的运动能力得到了极大的提高。单独丁酸梭菌活菌体对抑郁症小鼠抑郁症状有改善作用，但弱于实施例1酪酸梭菌制剂。

4.小鼠脑组织5-HT含量

结果显示，CUMS抑郁模型组小鼠脑组织5-HT含量较对照组明显下降(P＜0.01)；实施例1酪酸梭菌制剂组小鼠脑内5-HT含量与模型组相比，5-HT含量明显升高(P＜0.01)；在一定程度上增加CUMS抑郁症小鼠脑组织5-HT的含量，从而对CUMS抑郁症小鼠起到神经保护的作用。

5.BDNF蛋白表达

CUMS抑郁症模型组BDNF蛋白表达明显低于对照组(P＜0.01)，实施例1酪酸梭菌制剂组处理后小鼠脑组织的BDNF蛋白表达量明显高于CUMS抑郁症模型组(P＜0.01)。

结论：

与现有技术相比，本发明开创防治抑郁症的新模式，研制出了一种疗效好、无毒副作用的防治抑郁症的药物，经动物实验研究证明，酪酸梭菌制剂能能够发挥抗抑郁症的作用。

综上所述，仅为本发明之较佳实施例而已，并非用来限定本发明实施之范围，即凡依本发明申请专利范围所做之均等变化与修饰，皆为本发明专利范围所涵盖。

Claims (1)

1.一种抗抑郁症的酪酸梭菌制剂，其特征在于酪酸梭菌制剂的制备方法如下：

(1)种子液制备：挑取单菌落丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1016，保藏编号为CGMCC No.9831，接种于已灭菌的MRS液体培养基中，37℃，厌氧培养24h，即得到丁酸梭菌WZMC1016种子液；

(2)发酵：将步骤(1)得到的种子液按1％重量比的接种量接入已灭菌后的含有以重量百分比计的蛋白胨1-5％、酵母提取物0.5-5％、葡萄糖1-10％、低聚果糖0.5-2％、硫酸铵0.1％、磷酸二氢钾0.05-0.3％、磷酸氢二钾0.05-0.3％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.02％和氯化钙0.002％，其余为去离子水的液体培养基中，经35℃-37℃静置厌氧发酵24h～48h；

(3)收集菌体：将步骤(2)培养得到的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1016发酵液，3000rpm离心5～10min，去掉上清液，得到细菌泥，去离子水2～3次洗涤，制成细菌混悬液，再次用3000rpm离心5～10min，去掉上清液体得沉淀物；

(4)细菌破壁：将步骤(3)得到的沉淀物按1∶5～1∶10加去离子水，在150MPa压力下细胞破碎，得到细胞破壁产物；

(5)洗脱去脂：将在步骤(4)中获得的沉淀物使用乙醇进行反复溶解洗脱，10,000rpm离心15～20min，回收沉淀物，洗脱次数为2～3次，再用去离子水3～5次洗涤，3000rpm离心5～10min，得沉淀物；

(6)冻干成品：将步骤(5)中获得的沉淀物于真空负压状态下冷冻干燥，即可获得纯度达到95％以上的干燥粉末，即得到丁酸梭菌制剂。