CN108181472B

CN108181472B - 昆虫细胞表达psp为校准品的检测psp试剂盒

Info

Publication number: CN108181472B
Application number: CN201711358462.0A
Authority: CN
Inventors: 张蕾; 李宝民; 刘斌; 王珺楠; 史永丰; 王贺; 王玉华; 隋宝真; 赵青; 刘思言; 张金玲; 黄景林; 关恒; 林林; 朱道林; 仇淑园; 孙玉峰; 张超
Original assignee: Changchun Hengxiao Biotechnology Co ltd; Jilin University
Current assignee: Changchun Hengxiao Biotechnology Co ltd; Jilin University
Priority date: 2018-03-05
Filing date: 2018-03-05
Publication date: 2020-07-21
Anticipated expiration: 2038-03-05
Also published as: CN108181472A

Abstract

一种昆虫细胞表达PSP为校准品的检测PSP试剂盒，属于生物技术领域。本发明公开了用昆虫细胞表达胰石蛋白，纯化出PSP作为校准品，建立侧向免疫层析法试纸条，时间分辨荧光法测定试纸条荧光强度，检测血液或液体中PSP浓度过程，此方法步骤如下：提取胃癌细胞(AGS)中RNA，合成cDNA，重组Flag‑PSP AcNPV质粒转入此昆虫细胞，纯化PSP蛋白，作为校准品，标记羧基修饰微粒上，组装成侧向免疫层析法试纸条，建立PSP浓度自动显示系统。本发明优点是灵敏度高、特异性强、操作简便、用于快速诊断细菌感染和脓毒血症发生。

Description

昆虫细胞表达PSP为校准品的检测PSP试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域。

背景技术

危重病人常发生细菌感染，脓毒血症、脓毒性休克、及多种器官衰竭，导致病人死亡，需要快速、准确判定细菌感染及脓毒血症发生、发展，进行及时有效的治疗。临床上常用测定血清中降钙素原（Procalcitonin,PCT）和C反应蛋白（C-reactive protein,CRP）指标来判定细菌感染及脓毒血症发生及严重程度。

血清中CRP水平可反应机体炎症的严重程度，CRP作为一种应急反应蛋白，病毒感染，细菌感染，及机体炎症反应均可引起CRP的升高，单靠这一指标很难区分感染性疾病和其它炎性疾病，特异性较弱。

而PCT作为常用炎症指标，对诊断细菌感染发生特异性较强，测定血清中PCT浓度对感染前期及脓毒血症诊断，鉴别感染类型和感染程度，在临床上有很高的指导意义。但有研究发现，部分手术后无感染病人，创伤病人PCT水平增高；而一些细菌感染早期，PCT 水平不增高，表明PCT不能作为判定细菌感染，脓毒血症发生的唯一指标，需寻找新细菌感染指标。

近年来研究发现，血液中胰石蛋白（(Pancreatic stone protein,PSP)水平增高能早期判定细菌感染、脓毒症发生、评估脓毒症患者的严重程度，是预测患者病死率的可靠指标，其价值优于PCT、CRP、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、可溶性CD25等细菌感染指标，PSP将成为早期诊断细菌感染和脓毒症新标志物。

PSP是在慢性钙化性胰腺炎病人胰腺结石和胰液中提取出一种蛋白，又称胰岛再生源蛋白(Regenerating islet-derived protein,Reg)，由再生基因(Regeneratinggene)编码16KDa蛋白,该蛋白属于C-类凝集素(C-type lectin)家族。PSP主要由胰腺的腺泡细胞产生和分泌，在胃、肠道等处细胞也分泌少量PSP。开始研究认为，PSP有抑制胰腺结石形成的作用，但现在研究发现，PSP能抑制炎症反应、促进细胞增殖、抗细胞凋亡、调节细胞黏附、促细菌聚集等作用，PSP还能作为一种抗菌蛋白, 控制肠道菌群的扩散和防止病原菌感染肠道。PSP被认为是一种急性期反应蛋白，受到IL-6、 TNF-α等炎症因子及感染期间释放的细胞因子的调节。PSP也属于炎性因子，可诱导中性粒细胞中L-选择素的脱落和下调β2整合素表达，激活中性粒细胞，因此， PSP是一种炎症和感染发生的标记物。研究表明，急性、慢性胰腺炎发生时，上调PSP表达；而全身性应激反应，在缺乏任何胰腺炎症情况下，也促进胰腺PSP表达和分泌增多，说明PSP也是全身性应激反应标记物。

研究发现，无胰腺损伤患者，住院过程中发生脓毒症患者血清中PSP水平（146ng/ml）高于局部细菌感染患者(111ng/ml)，而局部细菌感染患者PSP水平高于无感染患者(22ng/ml)；PSP水平增高与中性粒细胞上CD11b、CD62L的表达密切相关，表明PSP结合并激活中性粒细胞，血液中PSP水平增高代表早期细菌感染发生。

有研究对108例患者，在进入ICU时，第3天，第7天和之后每周测量PSP和 PCT在血液水平，直至患者转出ICU，或死亡，在所有这些患者中，33例发生严重脓毒症，75例发生败血性休克，死亡2例。所有败血症和败血症休克患者的PSP水平均高于健康人，有些患者PSP升高至2000ng/mL，并且PSP水平与败血症的严重程度相关。进入ICU时，PSP和PCT血清水平，在脓毒性休克组显著高于败血症组（P = 0.002，和P = 0.01）；死亡患者组PSP水平明显高于幸存者组（P = 0.007），而PCT则没有明显区别，这些结果表明检测PSP水平对早期诊断细菌感染及败血症发生，判断败血症的严重程度是优于检测PCT指标。

有研究者对心脏手术后患者PSP、CRP、WBC指标连续3天动态监测，术后3个指标均升高；术后第1、2、3天PSP水平增高，能用于判断术后细菌感染发生，而CRP和WBC指标增高对术后细菌感染判断无价值。由此可见，测定血液中PSP浓度能早期鉴别细菌感染，早期判断脓毒症发生，

研究进一步发现，在局部感染、败血症，脓毒血症，器官衰竭，及休克病人血清中PSP水平依次增高，是判定疾病严重程度准确指标。正常人血清中PSP浓度低于20ng/ml; 当血清中PSP浓度高于45ng/ml时，提示有细菌感染存在；PSP水平超过270ng/ml时，表明有脓毒血症、或脓毒性休克发生，可能是器官衰竭，死亡风险明显增高。需要开发测定血液中PSP浓度试剂盒，用于临床上准确判定细菌感染，脓毒血症，及多种器官功能衰竭发生。

重症病人，ICU病人，大创伤及休克病人，大手术后病人都需要简单，快速确定细菌感染，脓毒血症，休克，及器官衰竭发生，并监测病性进展。本发明采用侧向免疫层析法（Lateralflowimmunoassay, LFIA）测定血液中PSP浓度，能在20分钟内出结果，只需简单设备，能满足快速诊断细菌感染，脓毒血症发生要求，在临床上有广泛应用，将有很大市场需求。

本发明采用铕螯合物(Europium Chelate)荧光微球，铕螯合物发出荧光具有更长（微秒）的寿命，可实现对荧光衰减的超时检测，能从寿命短促的背景荧光中分离出“真正的”荧光信号，大大提高特异性和敏感性。铕螯合物其激发波长为365nm；发射波长为610nm，具有较长斯托克斯位移（Stokes Shift），避免了常用荧光区域重叠，降低低背景信号，本发明用时间分辨荧光法（Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)测定荧光强度，能更敏感和特异性地测定出样品中PSP浓度。

发明内容

本发明的目的是建立时间分辨荧光免疫层析法检测PSP试剂盒，定量检测出血液中PSP浓度，用于快速诊断细菌感染和脓毒血症发生的昆虫细胞表达PSP为校准品的检测PSP试剂盒。

本发明步骤是：

1、①提取胃癌细胞(AGS)细胞 RNA，合成cDNA基因库，

②用PCR扩增出PSP DNA（核酸序列66-501），

③构建pFastBac-Flag-PSP载体，

④此载体 DNA 转导到HD10Bac 细菌中，产生重组Flag-PSP AcNPV 质粒，再把此

⑤重组质粒DNA 转导进到SF9细胞，产生重组Flag-PSP AcNPV；

⑥重组Flag-PSP AcNPV感染SF9细胞并表达出带有8个氨基酸残基（DYKDDDDK）短肽（Flag）和PSP（22-166氨基酸残基）Flag-PSP融合蛋白，用Anti-Flag M2 affinityagarose纯化出具有自然蛋白抗原性Flag-PSP，作为PSP校准品；

2、建立检测PSP侧向免疫层析法（Lateral flow immunoassay,LFIA）试剂条，包括卡壳和试纸条；卡壳为试纸条外部壳结构，由底座和卡盖构成，卡盖上设置有加样窗口和观察窗口；3、侧向免疫层析试纸条由底板及附着于底板上依次相互交错排列的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸构成；结合垫上喷涂羊抗PSP抗体-铕螯合物荧光微粒；硝酸纤维素膜上喷涂PSP抗体形成检测线，兔抗羊IgG 抗体形成质控线，其中，检测线固定PSP抗体与结合垫上PSP抗体识别不同的PSP抗原表位；

4、把样品垫侵泡在样品垫处理液中，室温条件下，2-4小时，36-38C°C，烘干6-12小时，加入干燥剂封存备用；把结合垫侵泡在结合垫处理液中，室温条件下，2-4小时，36-38°C，烘干6-12小时，加入干燥剂封存备用；

5、用抗体净化和浓缩离心柱（InnovaBiosciences），净化和浓缩羊抗PSP抗体；选用铕螯合物（Europium Chelate）荧光标记羧基修饰微球,直径为100-300nmn，用2-20mmol碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)处理铕螯合物羧基修饰微球后，把0.5-2.0mg/ml羊抗PSP抗体偶联到铕螯合物微球上，PSP抗体与铕螯合物微球重量比为1：50-5：50，用喷膜仪以5ul-15ul/cm 速度将微球喷涂于结合垫上，在35-37°C，烘干1-4小时，加入干燥剂封存备用；

6、用抗体净化和浓缩离心柱（InnovaBiosciences），把PSP单克隆抗体和兔抗羊IgG抗体净化后，用包被液把两抗体浓度调到0.5-2.0mg/ml；用定量喷膜仪以0.8-1.5ul/cm速度，将两抗体以4-6mm间隔喷涂硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线，其中，检测线距离结合垫边缘为6-12mm，35-37°C，烘干1-4小时，加入干燥剂封存备用；

7、底板上中间铺放硝酸纤维素膜，硝酸纤维素质控线一侧铺放吸水纸，吸水纸位于硝酸纤维素上方，吸水纸与硝酸纤维素相重叠长度为1.8mm-2.2mm；硝酸纤维素检测线一端铺放结合垫，结合垫位于硝酸纤维素上方，结合垫与硝酸纤维素相重叠长度为1.8mm-2.2mm；结合垫另一端铺设样品垫，样品垫位于结合垫上方，样品垫与结合垫相重叠长度为3mm-4mm；最后切割成宽度为5mm试纸条，将试纸条装入塑料外壳里，组装成检测PSP侧向免疫层析试纸条；

8、铕螯合物微粒上荧光染料为铕螯合物，激发波长310-380nm,检测波长610-670nm，其中，发射荧光在延时后再测量荧光强度,建立时间分辨荧光法（Time-resolvedfluoroimmunoassay，TRFIA）测定试纸条上荧光强度；

9、Flag-PSP作为校准品，用TRFIA检测仪测定不同浓度PSP校准品试纸条检测线上呈现荧光强度，建立PSP浓度标准曲线，获得PSP浓度标准卡，输入TRFIA检测仪，建立自动显示待测样品中PSP浓度的运行系统；

9、抗体稀释液：0.5-2% BSA, 2-10% Sucrose，0.02-0.1% Tween-20，0.4-1.0%Trehalose，0.02-0.1% NaN3,100-300mmol NaCl, 20-50mmol磷酸盐缓冲液(pH7.0-7.5)

包被液：0.2-1.0% Trehalose，1-5% Sucrose，0.02-0.1% Tween-20，，0.05-0.1%NaN3,100-300mmolNaCl, 20-50mmol磷酸盐缓冲液(pH7.0-7.5)

样品垫处理液：0.2-1.0%BSA，0.05-0.2% Tween-20，0.05-0.2% NaN3,100-300mmolNaCl, 20-50mmol磷酸盐缓冲液(pH7.0-7.5)

结合垫处理液：0.05-0.2% Tween-20，0.05-0.2% NaN3,100-300mmolNaCl, 20-50mmol磷酸盐缓冲液(pH7.0-7.5)

样品稀释液：1-5% BSA,0.02-0.1% Tween-20，0.02-0.1% NaN3,100-200mmolNaCl, 20-50mmolTris(pH7.0-7.5)。

本发明用SF9细胞表达Flag-PSP，纯化此蛋白，作为PSP校准品；制备出检测PSP侧向免疫层析试纸条，用时间分辨荧光法测定样品中PSP浓度，建立时间分辨荧光免疫层析法试剂盒，此试剂盒优点是灵敏度高、特异性强、操作简便、用于快速诊断细菌感染和脓毒血症发生。

附图说明

图1是侧向免疫层析法试纸条剖面图；

图2是侧向免疫层析法试纸条正面图；

图3是外壳包装试纸条后正面图；

图4是PCR产物；

图5是BamHI/Xhol切割pFastBac-Flag-PSP质粒DNA；

图6是Flag-PSP AcNPV重组质粒PCR产物；

图7是银染法测定Flag-PSP纯度；

图8是Western blot检测PSP抗体；

图9是BSA浓度标准曲线；

图10是PSP浓度标准曲线。

具体实施方式

本发明步骤是：

1、①提取胃癌细胞(AGS)细胞 RNA，合成cDNA基因库，

②用PCR扩增出PSP DNA（核酸序列66-501），

③构建pFastBac-Flag-PSP载体，

⑤重组质粒DNA 转导进到SF9细胞，产生重组Flag-PSP AcNPV；

一．制备PSP校准品

提取AGS胃癌细胞（ATCC, CRL-1739）RNA,用于合成cDNA，用PCR扩增出PSP DNA（核酸序列66-501）。SF9细胞表达载体pFastBac-Flag, 含Polyhedrin 启动子，在昆虫细胞中表达外源性蛋白；此载体插入8个氨基酸残基（DYKDDDDK）短肽（Flag）DNA 序列, 用于表达Flag 融合蛋白；此载体带有部分AcNPV DNA 序列，用于在HD10Bac细菌中产生基因重组AcNPV质粒。用限制性内切酶NdeI/XhoI切割PSP DNA和pFastBac-Flag载体，将PSP DNA连接到pFastBac-Flag NdeI/XhoI部位，构建成pFast-Flag-PSP载体；此载体DNA 转导入HD10Bac细菌中，产生重组Flag-PSPAcNPV质粒；重组Flag-PSP AcNPV质粒DNA 再转导入SF9细胞，产生重组Flag-PSP AcNPV；用此AcNPV感染SF9细胞，表达出Flag-PSP蛋白。本发明表达PSP有144氨基酸（22-166氨基酸残基），N-端带有Flag标记短肽，有8个氨基酸残基（DYKDDDDK），用Anti-Flag M2 affinity agarose纯化出Flag-PSP。纯化Flag-PSP进行SDS-PAGE电泳，再做银染法，测定Flag-PSP纯度达到98%以上；抗PSP抗体进行 WesternBlot，确定Flag-PSP；用Bradford法测定纯化Flag-PSP蛋白浓度，作为校准品，-80°C储存备用。

二．制备检测PSP侧向免疫层析法试纸条

采取技术方案为—种侧向免疫免疫层析法试纸条，看图1，包括，底板（1）以及顺次粘覆于底板上的吸水纸（7）、硝酸纤维素膜（4）、结合垫（3）和样品垫（2）；硝酸纤维素膜粘覆底板中间部位，其上有相间隔的由PSP单克隆抗体涂层形成检测线（Testline）和由兔抗羊IgG抗体涂层形成质控线(Control line)，检测线在结合垫方向，质控线吸水纸方向；结合垫上喷涂有羊抗PSP抗体-铕螯合物微球涂层；吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫以及样品垫之间，依次与相邻部位部分重叠。

吸水纸（7）位于硝酸纤维素膜（4）靠近质控线（6）一端，且吸水纸一端与硝酸纤维素膜（4）有部分重叠，其重叠部分长度为1.8-2.2mm；吸水纸重叠在硝酸纤维素膜上方（图1）。

结合垫（3）位于硝酸纤维素膜（4）靠近检测线（5）一端；且结合垫一端与硝酸纤维素膜部分重叠，其重叠部分长度为1.8-2.2mm；结合垫重叠在硝酸纤维素膜上方（图1）。

样品垫（2）位于结合垫（3）的外侧，并与结合垫部分重叠，其重叠部分长度为3-4mm; 样品垫重叠在结合垫上方。

硝酸纤维素膜上检测线（5）与质控线（6）平行设置，看图2，检测线与质控线之间的距离为4-6mm, 检测线与结合垫边缘之间的距离为6-12mm。

把样品垫侵泡在样品垫处理液中，室温条件下，2-4 小时，36-38C°C，烘干6-12小时，加入干燥剂封存备用。把结合垫侵泡在结合垫处理液中，室温条件下，2-4小时，36-38°C，烘干6-12小时，加入干燥剂封存备用。

本发明把羊抗PSP多克隆抗体化学偶联到直径100-300nm铕螯合物(EuropiumChelate)荧光标记羧基修饰微粒上，过程如下：(1)将PSP抗体加到抗体净化和浓缩离心柱中（Innova Biosciences）, 按说明书步骤，净化和浓缩PSP抗体，用磷酸盐缓冲液调节PSP抗体浓度到0.5-2.0mg/ml； (2)用20-60mmol MES缓冲液(pH6.0-7.0)洗涤铕螯合物荧光标记羧基修饰微粒，加入2-20mmol碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)，24-28°C,反应20-40分钟，用上述MES缓冲液洗涤微球3次，用20-50mmol磷酸盐缓冲液(pH7.0-7.5) 洗涤微球3次, 用磷酸盐缓冲液复溶微球后，加入净化后PSP抗体，使PSP抗体与微球的质量比为1:50-5:50，24-28°C，反应2-3小时，加含有1-5% BSA，20-50mmol磷酸盐缓冲液(pH7.0-7.5)，24-28°C，反应20-40分钟，用上述磷酸盐缓冲液洗涤微球，用抗体稀释液复溶微球至0.1-0.5mg/m1，用喷膜仪以5ul-15ul/cm 速度，将微球喷涂在结合垫上，在35-37°C，烘干1-4小时，加入干燥剂封存备用。

用抗体净化和浓缩离心柱（Innova Biosciences）净化和浓缩PSP单克隆抗体和兔抗羊IgG抗体，调两抗体浓度至0.5-2.0mg/ml；用喷膜仪以0.8-1.5ul/cm速度，将两抗体以4-6mm间隔喷涂硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线，其中，检测线距离结合垫边缘为6-12mm，35-37°C，烘干1-4小时，加入干燥剂封存备用。

组装试纸条，底板中间先铺放硝酸纤维素膜，然后在硝酸纤维素膜质控线相临近一侧铺放吸水纸，使吸水纸与硝酸纤维素膜部分重叠（1.8-2.2mm），吸水纸在硝酸纤维素膜上方；然后在硝酸纤维素膜检测线相临近一端铺放结合垫，使硝酸纤维素膜与结合垫一端部分重叠（1.8-2.2mm），结合垫在硝酸纤维素膜上方; 随后，结合垫另一端铺设样品垫，使结合垫与样品垫一端部分重叠（3-4mm），样品垫在结合垫上方；最后切割成宽度为5mm试纸条。

将上述宽度5mm试纸条装入外壳内，用于固定试纸条组成结构。外壳包括底座和卡盖。看图3，卡盖上设置有加样窗口（8）和观察窗口（9），露出试纸条局部区域；加样窗口开口在样品垫上部，露出部分样品垫区域；观察窗口开口在硝酸纤维素膜上部，露出全部检测线和质控线，方便检测线和质控线荧光信号测定。

在图1中，1为底板、2为样品垫、3为结合垫、4为硝酸纤维素膜、5为检测线、6质控线、7为吸水纸、8为样品窗口、9为观察窗口、10为卡盖。

三．建立时间分辨荧光法定量检测PSP自动程序

本发明用铕螯合物为荧光物，铕螯合物峰值激发波范围310-380nm，峰值发射波长范围610-670nm, Stocks位移较大，可有效排除普通非特异性荧光对检测荧光的干扰。铕螯合物的萤光寿命较长,可达到数百微秒（uS）,而普通荧光团的荧光衰变时间只有1〜100μS，样品中的一些蛋白质荧光衰变时间更短，仅为1〜10μS，因此选用时间分辨荧光免疫法（Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）测定铕螯合物荧光强度，即适当延迟测量时间，待背景荧光完全衰减后，再测定铕螯合物荧光信号，可消除蛋白质背景荧光的干扰。

本发明用时间分辨荧光分析仪, 选激发波长365nm，测定波长625nm，用TRFIA测定本发明试纸条检测线及质控线上荧光强度。

用样品稀释液稀释纯化Flag-PSP浓度为0, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400ng/ml，作为PSP校准品,加50ul PSP校准品到试纸卡的样品窗口部位，进行膜层析反应，5-15分钟后，时间分辨荧光分析仪，TRFIA法测定试纸条上检测线荧光强度。以PSP校准品浓度为纵坐标，校准品荧光强度单位为横坐标，建立PSP校准品浓度标准曲线，通过此标准曲线得到PSP浓度标准卡，将此卡数值输入时间分辨荧光分析仪，建立荧光强度与PSP浓度自动转换程序，并固定设置TRFIA测定法，时间分辨荧光分析仪自动显示出待测样品中的PSP浓度。

制备低浓度PSP校准品(0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6ng/ml)，加50ul PSP校准品到测定PSP时间分辨免疫层析试纸卡加样窗口部位，进行膜层析反应，5-15分钟后，用时间分辨荧光分析仪,TRFIA法测定试纸卡上检测线荧光强度，0.1ng/ml PSP 荧光强度单位接近0ng/ml本底值，确定本发明测定PSP时间分辨免疫层析试剂盒灵敏度为0.2ng/ml。用时间分辨荧光分析仪自动显示系统测定人血清样品中的PSP浓度。

结合具体实验，对本发明原理和结果作进一步说明，以下列出本发明多步实验过程：

一.制备Flag-PSP蛋白

（一）提取AGS胃癌细胞RNA

用RNeasy Mini kit (QIAGEN)，过程如下：

1.用F-12K培养液，加10% 胎牛血清（FBS），1% Penicilin/Streptomycin，在5%CO₂,37°C条件下，培养AGS胃癌细胞（（ATCC, CRL-1739）

2.收集2X10⁶ 细胞，加到15ml离心管中，加10ml PBS，用吸管吹吸混匀，离心，5000g，5分钟，去除上清液

3.用1ml PBS混合细胞，转到细胞到 1.5ml Eppendorf 微量管，离心，5000g，3分钟，去除PBS

4.加300ul Buffer RLT, 用微量移液器吹吸，混匀

5.带有20-gauge(直径0.9mm) 针头注射器，抽吸5次

6.加300ul 70%乙醇到细胞溶解液中，微量移液器吹吸，混匀

7.RNeasy 微型柱放在 2ml收集管中，加上述700ul混合溶解液到RNeasy 微型柱中

8.离心，8000g，30秒, 去除收集管中液体

9.加700ul Buffer RW1到RNeasy微型柱中

11.离心，8000g，30秒,去除收集管中液体

12. 放RNeasy 微型柱在新 2ml收集管中，加500ul Buffer RPE 到RNeasy 微型柱中

13. 离心，8000g 30 秒, 去除收集管中液体

14. 再加500ul Buffer RPE到RNeasy微型柱中

15.离心，8000g，2分钟, 去除收集管

16.放RNeasy微型柱在新2ml收集管中，最大速度离心(13000rpm)，1 分钟

17.放RNeasy微型柱在1.5ml Eppendorf微量管中,加30ulH₂O到RNeasy微型柱中

18.放置3分钟，离心，8000g,1分钟

19.1.5ml Eppendorf 微量管中液体为RNA提取液，

20. 用Nanodrop Spectrophotometer测定RNA浓度

（二）合成cDNA和PCR扩增PSP DNA

1.合成cDNA用随机引物法（cDNA synthesis kit, Life Technologies, Inc.）

AGS细胞RNA 2ul（500ng）

10mM dNTP 1ul

随机引物(50ng/ul) 2ul

H₂O 5ul

放在0.5ml微量离心管中, 混匀。放置在65℃条件下，5 分钟，放在冰块中5分钟

2.离心后，加下列物质到上述0.5ml微量离心管中

5XSSIV buffer 4ul

100mM DTT 1ul

RNase out 1ul

RT 1ul

H₂O 4ul

3.混匀，离心后，放置在5 ℃条件下，反应10 分钟

4.放置在8 ℃条件下，灭活10 分钟

5.加1ul E.coil RNaseH，37 ℃条件下，反应20 分钟，获得cDNA

6.合成PSP引物，引物-1，5’- atatacatatgccaggagtcccagacagagctg-3’；

引物-2，5’-atatactcgagctagtttttgaacttgcaaacaaag-3’

7.进行PCR

5x Reaction buffer 10ul

5x High GC enhancer 10ul

10mM dNTP 1ul

25pm/ul引物-11ul

25pm/ul引物-21ul

cDNA2ul

Q5 HF-DNA Polymerase 0.5ul

H₂O 到50ul

8.PCR条件如下：

A． 95 ℃ 2分钟

B． 95℃ 1分钟

C． 56 ℃ 1分钟

D． 72℃ 1分钟

重复B-D 步骤30次

E． 95 ℃ 1分钟30秒

F． 56 ℃ 1分钟30秒

G． 72℃ 5分钟

冷却到25℃，完成PCR

9.吸取5ul PCR 产物，加2ul 5X DNA loading buffer

10. 放在1% Agarose/TBE 凝胶电泳孔中，进行电泳

11. 用 EB 进行DNA 染色，紫外线下观察450bpDNA条带(图4孔1 和孔2)

12. 其余PCR 产物，加100ul H₂O，再加150ul 苯酚/氯仿/异戊醇（25/24/1），混合

13. 离心，13000rpm,5分钟

14. 收取上清液，加15ul 5M NaCl, 800ul 乙醇，混合，-20 ℃，过夜

15. 4 ℃条件下,离心，13000rpm,20分钟

16. 去除上清液，加800ul 70%乙醇，4 ℃条件下,离心，13000rpm,10分钟

17.去除上清液，干燥微量离心管底部DNA，加50ul H₂0 溶解DNA。

（三）构建FastBac-Flag-PSP质粒

1.用NdeI/XhoI限制性内切酶（New England Biolabs）切割DNA

PCR DNA产物 40ul

Cutsmart buffer 6ul

NdeI 3ul

XhoI 3ul

H20 到60ul

pFastBac-Flag 载体DNA 3ul（3ug）

Cutsmart buffer 6ul

NdeI 3ul

XhoI 3ul

H₂0 到60ul

混均，37 ℃反应2 小时，

2.放在1% Agarose/TBE 胶电泳孔中，进行电泳

3.EB 进行DNA 染色，紫外线下观察450b （PCR 产物）和4.6kb（载体） DNA条带，分别切割下DNA条带,分别放到1.5ml微量离心管中

4.用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN), 提取Agarose 条带中DNA

步骤如下：

a.加700ul BufferQG到含DNA Agarose条带微量离心管中，放在50℃，10分钟，每2分钟震荡一次，溶解Agarose条带

b.放QIAquick离心柱在 2ml收集管中，加上述溶解液700ul到QIAquick离心柱中，放置2分钟

c.离心，3000g 1分钟, 去除收集管中液体

d.再离心一次，3000g 1分钟

e.加700ul Buffer PE 到QIAquick离心柱

f.离心，12000g 1分钟, 去除收集管中液体

g.再离心一次，12000g 1分钟，

h.放QIAquick离心柱在新微量离心管中，室温下，放置5分钟

i.加35ul H2O 到QIAquick离心柱中，室温下，放置3分钟

j.离心，15000g 1分钟

k.1.5ml 微量离心管收集液中含有DNA，

l.用Nanodrop Spectrophotometer 测定DNA 浓度

5.用T4DNA ligase (New England Biolabs.)，连接PCR DNA片段到pFastBac-Flag载体中，

在1.5ml 微量离心管中加入以下物质

PCR DNA（NdeI/XhoI） 30ng

载体 DNA（NdeI/XhoI） 30ng

10X T4 DNA Ligase Buffer 1.0ul

T4 DNA Ligase 0.5ul

H₂O 到10ul

混均，25 ℃，反应4小时，

6.放微量离心管在冰块上，加100ul感受态细菌（XL10 Gold细菌株），轻轻混合，冰块上放置30分钟

7.放微量离心管在42℃水浴条件下50秒，再放到冰块上3分钟

8.加700ul LB 培养液，37 ℃摇动1小时

9.离心， 10000g, 5分钟，去除上清液，收集微量离心管底部细菌

10. 涂种在100ug/ml Ampicillin LB-琼脂板上，37 ℃，培养过夜

11. 挑选单个菌落，接种到3ml100ug/ml Ampicillin LB培养液中，37 ℃，摇动，过夜

12. 提取细菌质粒DNA，用PureLink Quick Plasmid Miniprep Kits (LifeTechnologies Inc.)

a.加1.5ml 细菌液到微量离心管中，离心，13000rpm3分钟, 去除上清液,

b.加250ul悬浮 BufferR3到微量离心管中, 均匀悬浮细菌

c.加250ul溶解BufferL7到微量离心管中, 上下倒置微量离心管，放置微量离心管，室温下，5 分钟

d.加350ul 沉淀BufferN4到微量离心管中, 上下倒置微量离心管，放置微量离心管在冰块中，10 分钟

e.离心，13000rpm，10分钟

f.放离心柱在 2ml收集管中，加上述离心上清液到离心柱中，放置1 分钟，离心，12000g，1分钟，去除收集管中液体

g.加洗涤500ul Buffer W10 到离心柱中，放置1 分钟，离心，12000g，1分钟，去除收集管中液体

h.加洗涤700ul Buffer W9 到离心柱中，放置1 分钟，离心，12000g，1分钟，去除收集管中液体

i.离心，12000g，1分钟

j.放离心柱在新微量离心管中，室温下，放置3分钟

k.加75ul TE buffer 到离心柱中，室温下，放置3分钟

l.离心，12000g 2分钟

m.1.5ml 微量离心管收集液中含有DNA

n.用Nanodrop Spectrophotometer 测定DNA 浓度

13. 限制性内切酶（New England Biolabs）切割pFastBac-Flag-PSP DNA

DNA 1.0ug

Cutsmart buffer 2.0ul

BamHI 1.0ul

XhoI 1.0ul

H₂O到20ul

混均，37℃,反应2 小时，

14. 放在1% Agarose/TBE 胶电泳孔中，进行电泳

15.EB 进行DNA 染色，紫外线下观察形成DNA条带

16.选出470bp,4.8kbDNA条带质粒（图5孔1-3）为FastBac-Flag-PSP 阳性质粒

17.用PSP DNA测序引物，引物-1，5’- atatacatatgccaggagtcccagacagagctg-3’；

引物-2，5’-atatactcgagctagtttttgaacttgcaaacaaag-3’进行DNA序列测定

18.选择出正确PSP DNA序列的pFastBac-Flag-PSP质粒DNA。

（四）制备重组Flag-PSP AcNPV质粒

1.取40ng,pFastBac-Flag-PSP DNA 放入微量离心管中，再放在冰块上，加100ul感受态细菌（HD10Bac细菌株），轻轻混合，冰块上,放置30分钟

2.放微量离心管在42℃，水浴条件下，50秒，再放到冰块上3分钟

3.加700ul LB 培养液，37 ℃摇动4小时，培养细菌

4.取20ul，40ul细菌液，涂种在50ug/ml Kanamycin,7ug/ml Gentamicin,10ug/mlTetracycline, 100ug/ml X-gal, 40ug/ml IPTG LB-琼脂板上，37 ℃，培养过夜

5.挑选单个白色菌落，接种到3ml 50ug/ml Kanamycin,7ug/ml Gentamicin,10ug/ml TetracyclineLB培养液中，37 ℃，摇动，培养过夜

6.提取细菌质粒DNA

b.加300ul BufferI（15mM Tris, pH8.0,10mM EDTA,100ug/ml RNaseA）到微量离心管中, 均匀悬浮细菌

c.加300ul BufferII(0.2N NaOH,1%SDS)到微量离心管中, 上下倒置微量离心管8次，放置室温下，5 分钟

d.加300ul Buffer III(KCH₃COO,pH5.5) 到微量离心管中, 上下倒置微量离心管8次，放置微量离心管在冰块中，10 分钟

e.离心，13000rpm，10分钟

f.转移700ul离心上清液到微量离心管中，加700ul Isopropanol到微量离心管中，混均，放置-20°C条件下，过夜

g.离心，14000g，20分钟，去除上清液，

h.加1.0ml 70% Ethanol到微量离心管中，洗涤，14000g，10分钟，去除上清液

i.干燥微量离心管底部DNA

j.加40ul TE buffer 到微量离心管中，溶解DNA

7.用PSP引物-1,引物-2进行PCR

5x Reaction buffer 10ul

5x High GC enhancer 10ul

10mM dNTP 1ul

25pm/ul引物-11ul

25pm/ul引物-21ul

重组Flag-PSP AcNPV 质粒DNA 1ul

Q5 HF-DNA Polymerase 0.5ul

H₂O 到50ul

8.PCR条件如下：

A． 95 ℃ 2分钟

B． 95 ℃ 1分钟

C． 56 ℃ 1分钟

D． 72 ℃ 1分钟

重复B-D 步骤30次

E． 95 ℃ 1分钟30秒

F． 56 ℃ 1分钟30秒

G． 72 ℃ 5分钟

冷却到25 ℃，完成PCR

9. 吸取10ul PCR 产物，加3ul 5X DNA loading buffer

10.放在1% Agarose/TBE 凝胶电泳孔中，进行电泳

11.用 EB 进行DNA 染色，紫外线下观察450bpDNA条带(图6孔1-4) 质粒为阳性Flag-PSP AcNPV 重组质粒。

（五）制备Flag-PSP AcNPV

1.溶液A： 6ul 重组Flag-PSP AcNPV DNA + 100ul TNM-FH 液（No FBS，Noantibiotics）

2.溶液B： 6ul Cellfectin (Invitrogen) + 100ul TNM-FH 液 (No FBS，Noantibiotics）

3.混合溶液A和溶液B，用微量移液器轻轻吹吸3次，室温下，放置 30分钟后，加800ul TNM-FH 液, 混匀,成为重组质粒DNA细胞转染液

4.吸出6孔培养皿中SF9 细胞TNM-FH 培养液，加2ml TNM-FH 液，洗涤SF9细胞一次

5.加质粒DNA细胞转染液到SF9 细胞培养皿中，放在摇床上缓慢摇动，室温下，5小时

6.从SF9 细胞培养皿吸出质粒DNA细胞转染液，加2.0ml含有10%FBS TNM-FH 培养液, 28 ℃，培养3天

7.吸取细胞培养液到离心管中，3000rpm, 离心10分钟，收集上清液，做为Flag-PSP AcNPV液

8.加2X10⁶SF9细胞到100mm细胞培养皿中,加5ml含10%FBS的TNM-FH 培养液, 28℃，放置4小时

9.吸出旧TNM-FH 培养液, 加5ml含10%FBS的TNM-FH 培养液，加100ul Flag-PSPAcNPV液到SF9细胞培养皿中

10.室温下，轻轻摇动SF9细胞培养皿，1小时

11. 加5ml含10%FBS的TNM-FH 培养液到SF9细胞培养皿中，28 ℃，培养3天

12. 吸取细胞培养液到离心管中，3000rpm, 离心10分钟，收集上清液，为扩增Flag-PSP AcNPV液。

（七）制备Flag-PSP蛋白

1.加8X10⁶ SF9细胞到150mm细胞培养皿中,加20ml含10%FBS TNM-FH 培养液, 28℃，放置4小时

2.吸出旧TNM-FH 培养液, 加10ml含10%FBS的TNM-FH 培养液，加300ul Flag-PSPAcNPV到SF9细胞培养皿中

3.室温下，轻轻摇动SF9细胞培养皿，1小时

4.加20ml含10%FBS TNM-FH 培养液到SF9细胞培养皿中，28 ℃，培养3天

5.收集SF9细胞到50ml离心管中，离心，3000rpm, 5分钟

6.去除上清液，加20ml PBS到离心管中，离心，3000rpm, 5分钟，

7.加1ml PBS到离心管中,转移SF9细胞到1.5ml微量离心管中

8.离心，3000rpm, 5分钟，去除上清液

9.加1.0ml 细胞溶解溶液 (10mM Hepes pH7.5, 100mM NaCl,0.5% NP-40, 1mMEDTA, 1mM DTT,1mM PMSF, 10ug/ml leupetine, 10ug/ml Aprotinin) 到微量离心管中,用微量移液器上下吹吸，混均，放置在冰块中15分钟

10. 在4 ℃条件下，离心，13000rpm, 20分钟，转移上清液到新1.5ml 微量离心管中

11. 取50ul Anti-Flag M2 affinity agarose （Sigma-Aldrich）放到1.5ml 微量离心管中

12. 加1.2ml 洗涤液(40mM Tris pH8.0, 300mM NaCl, 5% Glycerol,0.01% NP-40, 1mM EDTA, 1mM DTT,1mM PMSF, 10ug/ml Leupetine, 10ug/ml Aprotinin) 到Anti-Flag M2 affinity agarose微量离心管中，

13. 在4 ℃条件下，离心，3000g, 1分钟，吸出上清，重复洗涤2次

14. 加SF9细胞溶解液到Anti-Flag M2 affinity agarose微量离心管中

15. 在4 ℃条件下，摇动微量离心管，1.5小时

16. 在4℃条件下，离心，3000rpm, 1分钟，吸除上清液

17. 加1.2ml 洗涤液到Anti-Flag M2 affinity agarose微量离心管中，在4 ℃条件下，摇动微量离心管，15分钟

18. 在4 ℃条件下，离心，3000rpm, 1分钟，吸除洗涤液, 相同条件，重复洗涤3次

19. 加50ul 洗脱液（0.1M Glycine-HCl, pH2.5）到Anti-Flag M2 affinityagarose微量离心管中, 用微量移液器轻轻吹吸,放置在冰块中2分钟

20. 在4 ℃条件下，离心，6000rpm, 30秒，吸取上清液，到新微量离心管中，含2ul中和液(2M Tris, pH8.0, 3M NaCl), 混均，相同条件，重复洗脱4次,

21. 结合4次洗脱液，转入到透析袋 (Spectra/Pro) 中，放在透析液(20mM Tris,pH7.5, 150mM NaCl, 5% Glycerol, 1mM DTT,1mM EDTA) 中，在4 ℃条件下，缓慢搅动，过夜

22.收集透析袋中蛋白液体移到微量离心管中，在4 ℃条件下，离心，13000rpm,10分钟，

23.分装蛋白液到不同微量离心管中，4 ℃短期保存，-20 ℃至-80℃长期保存。

（八）测定纯化Flag-PSP

A．银染法测定Flag-PSP纯度

1.冻存10ul蛋白液放到37 ℃水浴中，快速溶化，放到冰块中，

2.加4ul 4X 蛋白加样液（50 mMTris，pH 6.8，2% SDS,20% Glycerol,1% β-mercaptoethanol, 12.5mM EDTA, 0.02% Bromophenol blue）, 100 ℃3分钟

3.加10ul处理后蛋白液样本到10% SDS-PAGE 凝胶的孔中，进行电泳

4.完成电泳后，获取SDS-PAGE 凝胶，进行银染色，步骤如下：

a.加100ml 50% Methanol 到SDS-PAGE凝胶的容器中，室温下，缓慢摇动，15分钟，

去除Methanol液体

b.加100ml 5% Methanol 到SDS-PAGE凝胶容器中，室温下，缓慢摇动，10分钟，去除Methanol液体,用水洗涤SDS-PAGE凝胶1次

c.加10ul 1.0MDTT 到SDS-PAGE胶容器中,有150ml水，室温下，缓慢摇动，10分钟，去除DTT液体,用水洗涤SDS-PAGE凝胶1次

d.加100ml 0.1% AgNO₃ 到SDS-PAGE凝胶容器中，室温下，缓慢摇动，15分钟，去除AgNO₃液体,用水洗涤SDS-PAGE凝胶2次

e.加100ml 3% Na₂CO₃& 0.05% Formaldehyde 到SDS-PAGE凝胶容器中，室温下反应，看到清晰蛋白条带为止

f.加Critic Acid到SDS-PAGE凝胶容器中,终止反应

g.用水清洗SDS-PAGE胶后，干躁SDS-PAGE凝胶,判断Flag-PSP纯度

h. Flag-PSP纯度达98%以上。

测定纯化Flag-PSP

1. 冻存Flag-PSP蛋白液放到37℃水浴中，快速溶化，放到冰块中，用PBS 1:20 稀释蛋白液

2.30ul 稀释BSA蛋白液（5ug/ml）和30ul稀释Flag-PSP蛋白液，分别加10ul 4X 蛋白加样液,100℃3分钟

3.2ul,4ul处理后蛋白液样本加到10% SDS-PAGE 凝胶的孔中，进行电泳，100V， 2小时

4.完成电泳后，获取SDS-PAGE凝胶

转移SDS-PAGE凝胶上蛋白到硝基纤维素膜上用蛋白转移缓冲液，30V，3小时

5.用5%脱脂牛奶粉在TBS Buffer(20mM Tris,pH7.5, 150mM NaCl, 0.05%Tween-20),封闭硝基纤维素膜，室温，2小时，用TBS Buffer 洗涤硝基纤维素膜一次，

6.加1：5000稀释羊抗PSP多克隆抗体（R & D systems）在1% 脱脂牛奶粉-TBSBuffer 到硝基纤维素膜容器中，在6℃条件下，缓慢摇动，过夜

7.吸出抗体液，用TBS Buffer 洗涤硝基纤维素膜4次，每次10分钟

8.加1：5000稀释抗羊IgG抗体-HRP（Promega）在1% 脱脂牛奶粉-TBS Buffer 到硝基纤维素膜容器中，室温下，缓慢摇动，1.5小时

9.吸出抗体液，用TBS Buffer 洗涤硝基纤维素膜4次，每次10分钟

10.加ECL Western blotting底物（Pierce）液到硝基纤维素膜上，反应2分钟

11.用ImageReader LAS-4000(FUJIFILM)测定Westernblot结果。

C． Bradford法测定Flag-PSP浓度

1．取2ml浓缩染料试剂（Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate）与6ml H₂O混合均匀

2. 用PBS稀释BSA标准液, 浓度分别为0，25，50，100，200ug/ml

3. 加80ul PBS 到微量滴定板孔中，加5ul不同浓度BSA标准液，5ul纯化Flag-PSP到微量滴定板

孔中，每个样本加3个孔

4. 加80ul稀释染料试剂到微量滴定板孔中，反应5分钟

5. 放微量滴定板到Victor3V 1420MultilabelCounter，选用波长495nm,测定OD值

6. 根据BSA浓度标准曲线，计算出Flag-PSP 浓度为110ug/ml。

。

二．制备测定PSP时间分辨免疫层析试纸条

（一）检测PSP侧向免疫层析试纸条组成

本发明实施例中，检测PSP侧向免疫层析试纸条（图1）包括底板（1）以及沿所述底板长度方向顺次粘覆于底板上的吸水纸（7）、硝酸纤维素膜（4）、结合垫（3）和样品垫（2）;其中，硝酸纤维素膜粘覆于底板中间部位，其上有相间隔的由PSP单克隆抗体涂层形成的检测线（5）和由兔抗羊IgG抗体涂层形成的质控线（6），检测线位于结合垫一侧，质控线靠近吸水纸一侧;结合垫喷涂有羊抗PSP抗体-铕螯合物微球涂层；吸水纸（7）、硝酸纤维素膜（4）、结合垫（3）以及样品垫（2）之间，依次与相邻部位接触且部分重叠。

本发明实施例中，检测线（5）与质控线（6）平行设置，检测线与质控线之间的距离为5mm,检测线与结合垫边缘之间的距离为8mm（图2）。

吸水纸（7）位于硝酸纤维素膜（4）靠近质控线（6）一端，且吸水纸一端与硝酸纤维素膜有部分重叠，其重叠部分长度为2mm；吸水纸重叠在硝酸纤维素膜上方（图1）。

结合垫（3）位于硝酸纤维素膜（4）靠近检测线（5）一端；且结合垫一端与硝酸纤维素膜部分重叠，其重叠部分长度为2mm；结合垫重叠在硝酸纤维素膜上方（图1）。

样品垫（2）位于结合垫（3）的外侧，并与结合垫部分重叠，其重叠部分长度为3mm;样品垫重叠在结合垫上方。

本发明实施例中，所有测定PSP时间分辨免疫层析试纸条宽度为5mm。

将上述结构试纸条装入塑料外壳里，外壳包括底座和卡盖（10），看图3，卡盖上设置有加样窗口（8）检测窗口（9），露出试纸条局部区域；加样窗口开口于样品垫（2）上部，露出部分样品垫区域；观察窗口开口于硝酸纤维素膜（4）上部，以露出全部检测线（5）和质控线（6）。

本发明选用纤维素纤维样品垫（EMDMillipore），为30cm X 17mm 条带，侵泡在样品垫处理液（0.5% BSA，0.1% Tween-20，0.1% NaN3,100mmol NaCl, 20磷酸盐缓冲液pH7.4)，室温下，2 小时，再37°C烘干6小时，干燥封闭保持。

本发明选用玻璃纤维结合垫（EMD Millipore），为30cm X 10mm 条带，侵泡在结合垫处理液（0.1% Tween-20，0.1% NaN3,100mmol NaCl, 20磷酸盐缓冲液pH7.4)，室温下，2小时，再37°C烘干8小时，干燥封闭保持。

（二）PSP抗体化学偶联到铕螯合物(Europium Chelate)荧光标记羧基修饰微粒上

本发明实施例中，选用铕螯合物(Europium Chelate)荧光标记羧基修饰微粒（Fluoro-Max™ Fluorescent Carboxylate-Modified Particles），购于ThermoFisherScientific, 选用铕螯合物荧光标记羧基修饰微粒直径为100nm,200nm, 300nm。

本发明实施例中，选用羊抗PSP多克隆抗体（R & D Systems）,用InnovaBiosciences公司抗体浓缩和净化离心柱（AbSelect™ Antibody Concentrationand Clean-Up Kit）预处理羊抗PSP多克隆抗体, 步骤如下：

1.加500ul羊抗PSP多克隆抗体到抗体浓缩和净化离心柱中，

2.离心，15000g 1-3分钟, 减少PSP抗体到100ul

3.去除收集管中液体,加400ul20mmol磷酸盐缓冲液(pH7.2)到抗体浓缩和净化离心柱中

4.离心，15000g 1-3分钟, 减少离心柱中液体积到100ul

5.重复3-4步骤，5次以上

6.吸出抗体浓缩和净化离心柱中约100ulPSP抗体

测定PSP抗体浓度，20mmol磷酸盐缓冲液(pH7.2)稀释PSP抗体浓度到1.0mg/ml。

本发明实施例中，用碳二亚胺（EDC）和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)化学试剂，购于Thermo Scientific，把羊抗PSP抗体偶联到铕螯合物荧光标记羧基修饰微粒（直径100nm）上,步骤如下：

1.取0.4ml铕螯合物荧光标记羧基修饰微粒(10mg/ml),直径100nmm，加入1.5ml离心管中，再加入0.6ml 50mmolMES缓冲液(pH6.2)到离心管中

2.离心，17000g，10分钟，去除上清液

3.加入1.2ml 50mmolMES缓冲液(pH6.2)到离心管中

4.离心，17000g，10分钟，去除上清液，重复3-4步骤2次

5.新鲜制备50mmolMES缓冲液(pH6.2)含有4mmol碳二亚胺(EDC)和10mmol N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)，立即加0.5ml上述液体到离心管中,混均,

25°C，反应30分钟

6.离心，17000g，10分钟，去除反应液

7.加入1.2ml 20mmol磷酸盐缓冲液(pH7.2)到离心管中

8.离心，17000g，10分钟，去除上清液，重复8-9步骤3次

9.加入0.1ml净化理过羊抗PSP抗体（1mg/ml）加入到上述离心管中,

25°C，反应3小时

10.加入1.2ml 5% BSA，25mmol磷酸盐缓冲液(pH7.2)到离心管中,

25°C，反应30分钟

11.离心，17000g，10分钟，去除上清液，

12.重复10-11步骤3次

加入20ml抗体稀释液（0.5% BSA，2% Sucrose，0.5% Trehalose,0.02% Tween-20,0.05% NaN3，100mmol NaCl，20mmol磷酸盐缓冲液pH7.4)到离心管中,混均，4°C储存备用。

（三）．喷涂PSP抗体到结合垫和硝酸纤维素膜上

1. 将上述制备完成PSP抗体-铕螯合物微粒液体，用定量喷膜仪以10ul/cm速度,喷涂在结合垫上，37°C，烘干2小时，加入干燥剂封存备用。

2. 用抗体浓缩和净化离心柱预处理PSP单克隆抗体(ThermoFisher)及兔抗羊IgG抗体(abcam)后，用包被液（0.5% Trehalose, 5% Surcose,0.02% Tween-20， 0.05% NaN3，100mmol NaCl, 20mmol磷酸盐缓冲液pH7.4)把两抗体浓度分别调到1.5mg/ml和0.5mg/ml,用定量喷膜仪，lul/cm速度，将两抗体以5mm间隔喷涂于硝酸纤维素膜上，37℃，烘干2小时，加入干燥剂封存备用。

（四）．测定PSP时间分辨免疫层析试纸条的组装

组装操作在湿度小于30%，稳定25°C的房间进行, 底板中间先铺放硝酸纤维素膜，然后在硝酸纤维素膜质控线相临近一侧铺放吸水纸，使吸水纸与硝酸纤维素膜部分重叠（2mm），吸水纸在硝酸纤维素膜上方；然后在硝酸纤维素膜检测线相临近一端铺放结合垫，使硝酸纤维素膜与结合垫一端部分重叠（2mm），结合垫在硝酸纤维素膜上方; 随后，结合垫另一端铺设样品垫，使结合垫与样品垫一端部分重叠（3mm），样品垫在结合垫上方；最后用切割机切割成宽度为5mm试纸条。

（五）．组装测定PSP时间分辨免疫层析试纸条

时间分辨免疫层析试纸条结构不牢固，不利于直接进行定量检测操作，存放携带不方便等问题，将上述宽度5mm试纸条装入外壳内，用于固定试纸条组成结构，方便储存和检测。其中外壳包括底座和卡盖。看图3，卡盖上设置有加样窗（8）和观察窗口（9），露出试纸条局部区域；加样窗口开口在述样品垫上部，露出部分样品垫区域；检测窗口开口在硝酸纤维素膜上部，露出全部检测线和质控线，方便检测线和质控线发出荧光信号测定。

（六）．测定PSP时间分辨免疫层析试纸条操作过程

用时间分辨免疫层析试纸条测定PSP时，在样品垫窗口上加入样品液，在毛细现象作用下，样品液向吸水纸方向泳动，当样品液中含有PSP移动到结合垫时，PSP蛋白与PSP抗体-铕螯合物微粒结合，形成PSP蛋白-PSP抗体-铕螯合物微粒复合物，随着层析作用，复合物向前移动，到达硝酸纤维素膜检测线处，与此处PSP抗体进一步结合，形成PSP抗体-PSP蛋白-PSP抗体-铕螯合物微粒夹心复合物，聚集在检测线上；而未结合PSP蛋白的PSP抗体-铕螯合物微粒继续前移，到达质控线时，此处兔抗羊IgG抗体与PSP抗体-铕螯合物微粒结合，在质控线处出现兔抗羊IgG抗体-PSP抗体-铕螯合物微粒复合物聚集。检测线和质控线都会产生相应的荧光信号，使用时间分辨荧光分析仪, 选定激发波长365nm,检测波长625nm，其中发射荧光在延时后,测量荧光强度。TRFIA定量测定试纸条的检测线及质控线上铕螯合物发出荧光强度，并计算出样品中PSP含量。整个反应在15分钟内完成。

（七）．建立时间分辨免疫层析试纸条定量检测PSP程序

1. 建立PSP浓度标准曲线

在制备好测定PSP时间分辨免疫层析试纸卡的加样区，用样品稀释液稀释纯化Flag-PSP，制成不同浓度PSP校准品(0, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400ng/ml),加50ulPSP校准品到样品窗口部位，进行膜层析反应，15分钟后，用时间分辨荧光分析仪, 选定激发波长365nm,检测波长625nm，TRFIA法测定试纸条上检测线及质控线荧光强度。以Flag-PSP校准品浓度为纵坐标，校准品荧光强度单位为横坐标，建立PSP校准品浓度标准曲线，得到方程式，y=120.11X-3.7869，R²=0.9998，看图10，通过此标准曲线得到PSP浓度标准卡，作为对样品中所含PSP浓度进行定量分析的基础。

。

输入上述标准卡到时间分辨荧光分析仪，建立自动运行系统，通过相应的分析软件自动计算出待测样品中的PSP浓度。

测定PSP时间分辨免疫层析试纸条的灵敏度

用样品稀释液稀释Flag-PSP，制成低浓度PSP校准品(0，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6ng/ml)，加50ulPSP校准品到测定PSP时间分辨免疫层析试纸卡加样窗口部位，进行膜层析反应，15分钟后，用时间分辨荧光分析仪, 选定激发波长365nm,检测波长625nm，TRFIA法测定试纸条上检测线及质控线荧光强度。0.1ng/mlPSP荧光强度相似本底值，确定测定PSP时间分辨免疫层析试纸条灵敏度为0.2ng/ml。

。

用PSP时间分辨免疫层析试纸盒检测血清中PSP浓度

加50ul血清样品到测定PSP时间分辨免疫层析试纸卡加样窗口部位，进行膜层析反应，15分钟后，用时间分辨荧光分析仪, 选定PSP时间分辨免疫层析试剂盒自动检测系统，测定血清样品中PSP浓度，结果如下：

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序列表

<110> 吉林大学

长春恒晓生物科技有限责任公司

<120> 昆虫细胞表达PSP为校准品的检测PSP试剂盒

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 436

<212> DNA

<213> PSP

<400> 1

cccggagtcc cagacagagc tgcctaatcc ccgaatcagc tgcccagaag gcaccaatgc 60

ctatcgctcc tactgctact actttaatga agaccctgag acctgggttg atgcagatct 120

ctattgccag aacatgaatt caggcaacct ggtgtctgtg ctcacccagg cggagggtgc 180

cttcgtggcc tcactgatta aggagagtag cactgatgac agcaatgtct ggattggcct 240

ccatgaccca aaaaagaacc gccgctggca ctggagtagt gggtccctgg tctcctacaa 300

gtcctgggac actggatccc cgagcagtgc taatgctggc tactgtgcaa gcctgacttc 360

atgctcagga ttcaagaaat ggaaggatga atcttgtgag aagaagttct cctttgtttg 420

caagttcaaa aactag 436

Claims

1.一种昆虫细胞表达PSP为校准品的检测PSP试剂盒，其特征在于：

1.①提取胃癌细胞细胞 RNA，合成cDNA基因库，

②用PCR扩增出PSP DNA，核酸序列66-501，

③构建pFastBac-Flag-PSP载体，

④此载体 DNA 转导到DH10Bac 细菌中，产生重组Flag-PSP AcNPV 质粒，

⑤再把步骤④重组质粒DNA 转导进到SF9细胞，产生重组Flag-PSP AcNPV；

⑥重组Flag-PSP AcNPV感染SF9细胞并表达出带有8个氨基酸残基短肽和PSPFlag-PSP融合蛋白，用Anti-Flag M2 affinity agarose纯化出具有自然蛋白抗原性Flag-PSP，作为PSP校准品；

2.建立检测PSP侧向免疫层析法试剂条，包括卡壳和试纸条；卡壳为试纸条外部壳结构，由底座和卡盖构成，卡盖上设置有加样窗口和观察窗口；

3.侧向免疫层析试纸条由底板及附着于底板上依次相互交错排列的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸构成；结合垫上喷涂羊抗PSP抗体-铕螯合物荧光微粒；硝酸纤维素膜上喷涂PSP抗体形成检测线，兔抗羊IgG 抗体形成质控线，其中，检测线固定PSP抗体与结合垫上PSP抗体识别不同的PSP抗原表位；

4.把样品垫浸泡在样品垫处理液中，室温条件下，2-4小时，36-38°C，烘干6-12小时，加入干燥剂封存备用；把结合垫浸泡在结合垫处理液中，室温条件下，2-4小时，36-38°C，烘干6-12小时，加入干燥剂封存备用；

5.用抗体净化和浓缩离心柱，净化和浓缩羊抗PSP抗体；选用铕螯合物，荧光标记羧基修饰微球,直径为100-300nmn，用2-20mmol碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺处理铕螯合物羧基修饰微球后，把0.5-2.0mg/ml羊抗PSP抗体偶联到铕螯合物微球上，PSP抗体与铕螯合物微球重量比为1：50-5：50，用喷膜仪以5ul-15ul/cm 速度将微球喷涂于结合垫上，在35-37°C，烘干1-4小时，加入干燥剂封存备用；

6.用抗体净化和浓缩离心柱，把PSP单克隆抗体和兔抗羊IgG抗体净化后，用包被液把两抗体浓度调到0.5-2.0mg/ml；用定量喷膜仪以0.8-1.5ul/cm速度，将两抗体以4-6mm间隔喷涂硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线，其中，检测线距离结合垫边缘为6-12mm，35-37°C，烘干1-4小时，加入干燥剂封存备用；

7.底板上中间铺放硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜质控线一侧铺放吸水纸，吸水纸位于硝酸纤维素膜上方，吸水纸与硝酸纤维素膜相重叠长度为1.8mm-2.2mm；硝酸纤维素膜检测线一端铺放结合垫，结合垫位于硝酸纤维素膜上方，结合垫与硝酸纤维素膜相重叠长度为1.8mm-2.2mm；结合垫另一端铺设样品垫，样品垫位于结合垫上方，样品垫与结合垫相重叠长度为3mm-4mm；最后切割成宽度为5mm试纸条，将试纸条装入塑料卡壳里，组装成检测试纸条；

8.铕螯合物微球上荧光染料为铕螯合物，激发波长310-380nm,检测波长610-670nm，其中，发射荧光在延时后再测量荧光强度,建立时间分辨荧光法测定试纸条上荧光强度；

9.Flag-PSP作为校准品，用TRFIA检测仪测定不同浓度PSP校准品试纸条检测线上呈现荧光强度，建立PSP浓度标准曲线，获得PSP浓度标准卡，输入TRFIA检测仪，建立自动显示待测样品中PSP浓度的运行系统；

10.抗体稀释液：0.5-2% BSA, 2-10% Sucrose，0.02-0.1% Tween-20，0.4-1.0%Trehalose，0.02-0.1% NaN3,100-300mmol NaCl, 20-50mmol磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液pH7.0-7.5，

包被液：0.2-1.0% Trehalose，1-5% Sucrose，0.02-0.1% Tween-20，0.05-0.1% NaN3,100-300mmolNaCl, 20-50mmol磷酸盐缓冲液

样品垫处理液：0.2-1.0%BSA，0.05-0.2% Tween-20，0.05-0.2% NaN3,100-300mmolNaCl, 20-50mmol磷酸盐缓冲液

结合垫处理液：0.05-0.2% Tween-20，0.05-0.2% NaN3,100-300mmolNaCl, 20-50mmol磷酸盐缓冲液

样品稀释液：1-5% BSA,0.02-0.1% Tween-20，0.02-0.1% NaN3,100-200mmol NaCl,20-50mmolTris。