CN108181280A - 一种猪干扰素诱生剂的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种猪干扰素诱生剂的筛选方法，包括以下步骤：体外培养猪小肠细胞IPEC‑1；培养稳定表达绿色荧光蛋白基因和猪干扰素β基因的细胞株IPEC‑1/AcGFP1‑IFN‑β；将细胞IPEC‑1/AcGFP1‑IFN‑β接种到培养板中形成细胞爬片；用待筛选诱生剂处理细胞IPEC‑1/AcGFP1‑IFN‑β，得待测细胞，并观测待测细胞的AcGFP1荧光强度，根据AcGFP1荧光强度筛选出猪干扰素诱生剂。本发明提出的猪干扰素诱生剂的筛选方法，具有筛选快速、针对性强、结果准确的优点，筛选出来的猪干扰素诱生剂可直接作为饲料添加剂加入仔猪饲料中，用于诱导仔猪体内产生干扰素而实现抵抗仔猪疾病的作用。

Description

一种猪干扰素诱生剂的筛选方法
技术领域
本发明涉及猪饲料添加剂技术领域，特别涉及一种猪干扰素诱生剂的筛选方法。
背景技术
随着科学技术的进步及现代畜牧业的需要，免疫增强剂的预防、保健作用越来越受到重视，特性确定、高效、稳定、无毒的免疫增强剂将是未来防治畜禽疾病的理想物质。猪用免疫增强剂主要包括干扰素(Interferon，IFN)、猪用转移因子、免疫球蛋白、低聚糖、黄芪多糖等，其中，干扰素是多种诱导剂(病毒、细菌和大分子等)诱导细胞产生的具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能的一类蛋白质，在猪病的防治中起到至关重要的作用。
尽管干扰素具有广谱抗病毒活性，得到广泛的应用，但是由于干扰素具有较强的种属特异性，即人的干扰素只能用于人，鸡的干扰素只能用于鸡，因此，干扰素在实际使用过程中还需要经过严格的筛选。现有技术中，开展了大量以中草药为原材料，提取、筛选其有效成份配制成抗毒素I号，作为内源性干扰素诱生剂的研究，并应用到家畜、家禽及野生功物病毒性疾病的防治。但是这种方法的筛选周期长，而且由于筛选目的不明确使得筛选结果的准确性不高。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种猪干扰素诱生剂的筛选方法，旨在缩短猪干扰素诱生剂的筛选方法的筛选周期，并提高筛选结果的准确性。
为实现上述目的，本发明提出一种猪干扰素诱生剂的筛选方法，包括以下步骤：
步骤S10、体外培养猪小肠细胞系，获得猪小肠上皮细胞IPEC-1；
步骤S20、以猪血基因组为模板，用猪干扰素β基因的特异性引物p1和p2进行PCR扩增，得到目的基因IFN-β片段，并将目的基因IFN-β片段与pMD18T克隆载体连接后进行培养，然后提取质粒，命名为pMD18T-IFN-β；
步骤S30、用Xho I和Sal I酶对质粒pMD18T-IFN-β和含有绿色荧光蛋白基因的表达载体pIRES2-AcGFP1进行双酶切，并回收目的基因IFN-β片段和线性化的pIRES2-AcGFP1载体片段，将目的基因IFN-β片段与线性化的pIRES2-AcGFP1载体片段连接后进行培养，然后提取重组质粒，命名为pIRES2-AcGFP1-IFN-β；
步骤S40、将猪小肠上皮细胞IPEC-1接至孔板中，待细胞融合至75～85％时，转染重组质粒pIRES2-AcGFP1-IFN-β和对照质粒pIRES2-AcGFP1，转染22～26h后向IPEC-1细胞中加入培养基继续培养，获得稳定表达AcGFP1和IFN-β的细胞株，命名为IPEC-1/AcGFP1-IFN-β；
步骤S50、将细胞IPEC-1/AcGFP1-IFN-β接至培养板上，用待筛选诱生剂处理细胞IPEC-1/AcGFP1-IFN-β，70～74h后取出细胞爬片并观察细胞的AcGFP1荧光强度，并根据AcGFP1荧光强度，从待筛选诱生剂中筛选出猪干扰素诱生剂。
优选地，步骤S10包括：
将冻存有猪小肠上皮细胞IPEC-1的冻存管置于CO2培养箱中融化后，取出猪小肠上皮细胞IPEC-1并放入培养皿，向培养皿中加入细胞培养液后置于CO2培养箱中培养；
培养至细胞长满培养皿表面积的85～95％时，用磷酸盐缓冲液进行冲洗，然后加入胰酶，并置于CO2培养箱中消化8～12min，再加入完全培养基终止消化；
将终止消化后的细胞全部转移至离心管中，于800～1200rpm离心2～5min，然后加入完全培养基并转移至培养皿中继续培养1～3天，获得猪小肠上皮细胞IPEC-1。
优选地，步骤S20包括：
根据已知的猪干扰素β基因IFN-β(Gene ID：NC_010443.5)序列设计特异性引物上游引物p1和下游引物p2，在上下游引物对应加入Xho I和Sal I酶切位点；
采取猪血液，以淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，以血液RNA提取试剂盒提取RNA，以cDNA合成试剂盒通过反转录获得cDNA，然后以此cDNA为模板，用特异性引物p1和p2进行PCR扩增，对扩增片段进行凝胶电泳检测，得到猪干扰素β基因的目的基因IFN-β片段；
通过凝胶电泳回收目的基因IFN-β片段，并将目的基因IFN-β片段与pMD18T克隆载体进行连接后，转化到大肠杆菌感受态细胞DH5a中，通过氨苄抗性筛选，获得阳性克隆；
挑起阳性克隆进行培养后，以质粒提取试剂盒提取质粒，并通过Xho I和Sal I双酶切对所提取的质粒进行酶切鉴定和测序分析，测序分析正确的质粒命名为pMD18T-IFN-β；
其中，上游引物p1的序列为5-GCCTCGAGATGGCTAACAAGTGCA-3，下游引物p2的序列为5-GGTCGACTCAGTTCCGGAGGTAAT-3。
优选地，步骤S30包括：
用Xho I和Sal I酶对质粒pMD18T-IFN-β和含有绿色荧光蛋白基因的表达载体pIRES2-AcGFP1进行双酶切，通过凝胶电泳回收目的基因IFN-β片段和线性化的pIRES2-AcGFP1载体片段；
用T4连接酶将目的基因IFN-β片段和线性化的pIRES2-AcGFP1载体片段进行连接反应，并将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞DH5a中，通过卡拉霉素抗性筛选，获得阳性克隆；
挑起阳性克隆进行培养后，以质粒提取试剂盒提取重组质粒，并通过Xho I和SalI双酶切对所提取的质粒进行酶切鉴定，酶切鉴定正确的重组质粒命名为pIRES2-AcGFP1-IFN-β。
优选地，步骤S40包括：
将细胞IPEC-1按照每孔4×106～6×106个的量接种到6孔板中，待细胞融合至75～85％时，使用Lipofectamine2000转染重组质粒pIRES2-AcGFP1-IFN-β和对照质粒pIRES2-AcGFP1；
转染22～26h后，向IPEC-1细胞中加入含有800ug/ml G418的培养基，培养7～14天，每隔12～24h更换培养基，在培养期间，未转染的细胞逐渐死亡，转染成功的细胞存活，即为稳定表达AcGFP1和IFN-β的细胞株，命名为IPEC-1/AcGFP1-IFN-β。
优选地，步骤S50包括：
在6孔细胞培养板上放置载玻片，将IPEC-1/AcGFP1-IFN-β细胞接种至载玻片上，形成细胞爬片；
用待筛选诱生剂处理细胞IPEC-1/AcGFP1-IFN-β，70～74h后取出细胞爬片，依次经冲洗、固定后，用80％的冷丙酮透化细胞，得到待测细胞；
用倒置荧光显微镜观察待测细胞中的AcGFP1荧光强度，并根据AcGFP1荧光强度的比较，筛选出可显著增加AcGFP1荧光强度的待筛选诱生剂，即为猪干扰素诱生剂。
优选地，在步骤S50之后，还包括：
步骤S60、通过仔猪饲养试验，观测筛选出的猪干扰素诱生剂对仔猪体内干扰素的诱生效果，进一步筛选高效的猪干扰素诱生剂。
优选地，步骤S60包括：
选取健康且体重相近的三周龄无特定病原体的仔猪，作为试验仔猪，并将试验仔猪随机分为对照组试验组，开始试验；
试验过程中，对照组试验仔猪使用正常日粮饲喂，试验组试验仔猪使用对应添加有步骤S50中所筛选的猪干扰素诱生剂的日粮饲喂，试验期为15天；
分别于试验第8天和第15天，通过前腔静脉方式采集对照组和试验组试验仔猪的血液样品，以IFN-β试剂盒测定试验仔猪血液中的IFN-β浓度，根据IFN-β浓度评价所筛选的猪干扰素诱生剂诱生猪干扰素β的表达效果，进而筛选出高效的猪干扰素诱生剂。
本发明提供的猪干扰素诱生剂的筛选方法，通过扩增猪干扰素β的基因，利用含有荧光素标记的载体pIRES2-AcGFP1，构建稳定表达猪干扰素β和绿色荧光蛋白AcGFP1的猪小肠上皮细胞IPEC-1，并利用此细胞中AcGFP1的表达强度，也即此细胞在荧光显微镜下的荧光强度，来评判筛选出的猪干扰素诱生剂诱生干扰素的产生能力，具有筛选快速、针对性强、结果准确的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中猪IFN-β基因扩增片段的凝胶电泳测试结果图；
图2为本发明实施例1中质粒pMD18T-IFN-β的凝胶电泳测试结果图；
图3为本发明实施例1中重组质粒pIRES2-AcGFP1-IFN-β的凝胶电泳测试结果图；
图4为本发明实施例1中Ⅰ组细胞的AcGFP1荧光强度测定结果图；
图5为本发明实施例1中Ⅱ组细胞的AcGFP1荧光强度测定结果图；
图6为本发明实施例1中Ⅲ组细胞的AcGFP1荧光强度测定结果图；
图7为本发明实施例1中Ⅳ组细胞的AcGFP1荧光强度测定结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提出一种猪干扰素诱生剂的筛选方法，在本发明提供的猪干扰素诱生剂的筛选方法的一实施例中，所述猪干扰素诱生剂的筛选方法包括以下步骤：
步骤S10、体外培养猪小肠细胞系，获得猪小肠上皮细胞IPEC-1(Intestinalporcine epithelial cells,IPEC-1)；
其中，步骤S10包括：
步骤S11、将冻存有猪小肠上皮细胞IPEC-1的冻存管置于CO2培养箱中融化后，取出猪小肠上皮细胞IPEC-1并放入培养皿，向培养皿中加入细胞培养液后置于CO2培养箱中培养；
培养至细胞长满培养皿表面积的85～95％时，用磷酸盐缓冲液(PBS)进行冲洗，然后加入胰酶，并置于CO2培养箱中消化8～12min，再加入完全培养基终止消化；
将终止消化后的细胞全部转移至离心管中，于800～1200rpm离心2～5min，然后加入完全培养基并转移至培养皿中继续培养1～3天，获得猪小肠上皮细胞IPEC-1。
步骤S20、以猪血基因组为模板，用猪干扰素β(IFN-β)基因的特异性引物p1和p2进行PCR(聚合酶链式反应)扩增，得到目的基因IFN-β片段，并将目的基因IFN-β片段与pMD18T克隆载体连接后进行培养，然后提取质粒，命名为pMD18T-IFN-β；
其中，步骤S20包括：
根据已知的猪IFN-β基因(Gene ID：NC_010443.5)序列设计特异性引物上游引物p1和下游引物p2(上游引物p1的序列为5-GCCTCGAGATGGCTAACAAGTGCA-3，下游引物p2的序列为5-GGTCGACTCAGTTCCGGAGGTAAT-3，如SEQ ID NO.1所示)，在上下游引物对应加入Xho I和Sal I酶切位点；
采取猪血液，以淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，以血液RNA提取试剂盒提取RNA，以cDNA合成试剂盒通过反转录获得cDNA，然后以此cDNA为模板，用特异性引物p1和p2进行PCR扩增，对扩增片段进行凝胶电泳检测，得到猪干扰素β基因的目的基因IFN-β片段；
通过凝胶电泳回收目的基因IFN-β片段，并将目的基因IFN-β片段与pMD18T克隆载体进行连接后，转化到大肠杆菌感受态细胞DH5a中，通过氨苄抗性筛选，获得阳性克隆；
挑起阳性克隆进行培养后，以质粒提取试剂盒提取质粒，并通过Xho I和Sal I双酶切对所提取的质粒进行酶切鉴定和测序分析，测序分析正确的质粒命名为pMD18T-IFN-β，其中，质粒pMD18T-IFN-β测序得出的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
步骤S30、用Xho I和Sal I酶对质粒pMD18T-IFN-β和含有绿色荧光蛋白(AcGPF1)基因的表达载体pIRES2-AcGFP1进行双酶切，并回收目的基因IFN-β片段和线性化的pIRES2-AcGFP1载体片段，将目的基因IFN-β片段与线性化的pIRES2-AcGFP1载体片段连接后进行培养，然后提取重组质粒，命名为pIRES2-AcGFP1-IFN-β；
其中，步骤S30包括：
用Xho I和Sal I酶对质粒pMD18T-IFN-β和含有绿色荧光蛋白基因的表达载体pIRES2-AcGFP1进行双酶切，通过凝胶电泳回收目的基因IFN-β片段和线性化的pIRES2-AcGFP1载体片段；
用T4连接酶将目的基因IFN-β片段和线性化的pIRES2-AcGFP1载体片段进行连接反应，并将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞DH5a中，通过卡拉霉素抗性筛选，获得阳性克隆；
挑起阳性克隆进行培养后，以质粒提取试剂盒提取重组质粒，并通过Xho I和SalI双酶切对所提取的质粒进行酶切鉴定，酶切鉴定正确的重组质粒命名为pIRES2-AcGFP1-IFN-β。
步骤S40、将猪小肠上皮细胞IPEC-1接至孔板中，待细胞融合至75～85％时，转染重组质粒pIRES2-AcGFP1-IFN-β和对照质粒pIRES2-AcGFP1，转染22～26h后向IPEC-1细胞中加入培养基继续培养，获得稳定表达AcGFP1和IFN-β的细胞株，命名为IPEC-1/AcGFP1-IFN-β；
其中，步骤S40包括：
将细胞IPEC-1按照每孔4×106～6×106个的量接种到6孔板中，待细胞融合至75～85％时，使用Lipofectamine2000转染重组质粒pIRES2-AcGFP1-IFN-β和对照质粒pIRES2-AcGFP1；
转染22～26h后，向IPEC-1细胞中加入含有800ug/ml G418的培养基，培养7～14天，每隔12～24h更换培养基，在培养期间，未转染的细胞逐渐死亡，转染成功的细胞存活，即为稳定表达AcGFP1和IFN-β的细胞株，命名为IPEC-1/AcGFP1-IFN-β。
步骤S50、将细胞IPEC-1/AcGFP1-IFN-β接至培养板上，用待筛选诱生剂处理细胞IPEC-1/AcGFP1-IFN-β，70～74h后取出细胞爬片并观察细胞的AcGFP1荧光强度，并根据AcGFP1荧光强度，从待筛选诱生剂中筛选出猪干扰素诱生剂。
其中，步骤S50包括：
在6孔细胞培养板上放置载玻片，将IPEC-1/AcGFP1-IFN-β细胞接种至载玻片上，形成细胞爬片；
用待筛选诱生剂处理细胞IPEC-1/AcGFP1-IFN-β，70～74h后取出细胞爬片，依次经冲洗、固定后，用80％的冷丙酮透化细胞，得到待测细胞；
用倒置荧光显微镜观察待测细胞中的AcGFP1荧光强度，并根据AcGFP1荧光强度的比较，筛选出可显著增加AcGFP1荧光强度的待筛选诱生剂，即为猪干扰素诱生剂。
本发明提供的猪干扰素诱生剂的筛选方法，通过扩增猪IFN-β基因，利用含有AcGFP1标记的载体pIRES2-AcGFP1，构建稳定表达猪IFN-β和AcGFP1的细胞IPEC-1，并利用此细胞中AcGFP1的表达强度，也即此细胞在荧光显微镜下的荧光强度，来评判筛选出的猪干扰素诱生剂诱生干扰素的产生能力，具有筛选快速、针对性强、结果准确的优点；筛选出来的猪干扰素诱生剂可直接作为饲料添加剂加入仔猪饲料中，用于诱导仔猪体内产生干扰素而实现抵抗仔猪疾病的作用，在饲料业与养猪业中具有广阔的应用前景。
在本发明提供的猪干扰素诱生剂的筛选方法的另一实施例中，在步骤S50之后，还包括：
步骤S60、通过仔猪饲养试验，观测筛选出的猪干扰素诱生剂对仔猪体内干扰素的诱生效果，进一步筛选高效的猪干扰素诱生剂。
在本实施例中，步骤S60具体包括：
选取健康且体重相近的三周龄无特定病原体的仔猪，作为试验仔猪，并将试验仔猪随机分为对照组试验组，开始试验；
试验过程中，对照组试验仔猪使用正常日粮饲喂，试验组试验仔猪使用对应添加有步骤S50中所筛选的猪干扰素诱生剂的日粮饲喂，试验期为15天；
分别于试验第8天和第15天，通过前腔静脉方式采集对照组和试验组试验仔猪的血液样品，以IFN-β试剂盒测定试验仔猪血液中的IFN-β浓度，根据IFN-β浓度评价所筛选的猪干扰素诱生剂诱生猪干扰素β的表达效果，进而筛选出高效的猪干扰素诱生剂。
对通过上述步骤S10至步骤S50筛选出来的猪抗生素诱生剂进行仔猪饲养试验，并通过试验仔猪血液中的IFN-β浓度水平，直观地验证筛选出来的猪抗生素诱生剂在仔猪体内诱生干扰素的能力，最终进一步筛选出高效的猪干扰素诱生剂。
以下根据具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1猪干扰素诱生剂的筛选
(1)猪小肠细胞系IPEC-1的体外培养
从液氮中取出装有猪小肠细胞系IPEC-1(美国德克萨斯农工大学伍国耀教授提供)的冻存管，放入CO2培养箱中融化后，将猪小肠细胞系IPEC-1放入培养皿(表面积为75cm2)中，并加入10倍表面积的培养液，混匀后置于CO2培养箱中培养(CO2体积浓度为5％、培养温度为37℃)。
待细胞长满培养皿表面积的90％时，用PBS冲洗两遍，再加入2mL胰酶，并置于CO2培养箱中消化10min后，加入3mL完全培养基终止消化，然后全部转移至50mL的离心管中，于1000rpm离心3min后，加入完全培养基混匀，再转移至培养皿中继续培养2天，获得猪小肠细胞IPEC-1。
(2)猪干扰素β(IFN-β)基因的获得
根据目前已公开报道的猪IFN-β基因(Gene ID：NC_010443.5)序列(来自NCBIGenebank)设计特异性上游引物p1和下游引物p2(由Takara生物科技有限公司合成)，其中，上游引物p1的序列为：5-GCCTCGAGATGGCTAACAAGTGCA-3，下游引物p2的序列为：5-GGTCGACTCAGTTCCGGAGGTAAT-3；在上下游引物分别加入Xho I和Sal I酶切位点。
采取10mL猪血液，以淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，以血液RNA提取试剂盒提取RNA，以cDNA合成试剂盒(Takara生物科技有限公司)，通过反转录获得cDNA，然后以此cDNA为模板，用特异性引物p1和p2进行PCR扩增，对扩增片段进行凝胶电泳检测，得到大小为560bp的目的条带，如图1所示(图1中，M为DL2000的marker，1和2为猪IFN-β基因的RT-PCR扩增结果，3为空白对照)，与预期结果相符。
凝胶回收目的基因IFN-β片段，与pMD18T克隆载体(Takara生物科技有限公司)进行连接后，转化到大肠杆菌感受态细胞DH5a(Takara生物科技有限公司)中，通过氨苄抗性筛选，获得阳性克隆，挑起阳性克隆进行培养后，以质粒提取试剂盒提取质粒。
将提取的质粒用Xho I和Sal I双酶切，酶切产物经凝胶电泳检测，结果如图2所示(图2中，M为DL2000的marker，1为质粒pMD18T-IFN-β的Xho I和Sal I双酶切结果，2为空载体的酶切结果)，结果显示酶切出大小为2800bp左右的pMD18T载体片段和大小为560bp左右的目的基因IFN-β片段，表明质粒构建正确，并将此质粒命名为pMD18T-IFN-β。
将质粒pMD18T-IFN-β送往北京奥科生物科技有限公司进行序列测定，测定的基因序列如SEQ ID NO.1所示，序列大小为561bp，所测得的序列通过blast分析，结果表明该质粒pMD18T-IFN-β具有猪IFN-β的基因序列，即目的基因片段导入成功。
(3)重组质粒pIRES2-AcGFP1-IFN-β的构建
用Xho I和Sal I酶对质粒pMD18T-IFN-β和含有AcGFP1基因的表达载体pIRES2-AcGFP1进行双酶切，通过凝胶电泳回收目的基因IFN-β片段和线性化的pIRES2-AcGFP1载体片段，用T4连接酶将目的基因IFN-β片段与线性化的pIRES2-AcGFP1载体片段进行连接反应，将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞DH5a(Takara生物科技有限公司)中，通过卡拉霉素抗性筛选，获得阳性克隆，挑起阳性克隆进行培养后，以质粒提取试剂盒提取重组质粒。
将提取的重组质粒用Xho I和Sal I双酶切，酶切产物经凝胶电泳检测，结果如图3所示(图3中，M1为DL2000的marker，M2为DL15000的marker，1为重组质粒pIRES2-AcGFP1-IFN-β的Xho I和Sal I双酶切结果，2为重组质粒pIRES2-AcGFP1-IFN-β的Xho I单酶切结果，3为重组质粒pIRES2-AcGFP1-IFN-β的Sal I单酶切结果)，结果显示酶切出大小为5300bp左右的pIRES2-AcGFP1载体片段和大小为560bp的目的基因IFN-β片段，表明重组质粒构建正确，并将此重组质粒命名为pIRES2-AcGFP1-IFN-β。
(4)稳定表达目的蛋白的细胞株的筛选
将细胞IPEC-1按照5×106个/孔的量接种6孔板中，待细胞融合至80％时，使用Lipofectamine2000转染重组质粒pIRES2-AcGFP1-IFN-β和对照质粒pIRES2-AcGFP1。
转染24h后，向细胞IPEC-1中加入含有800ug/ml G418的培养基，培养10天，每隔15h更换培养基；在培养期间，未转染的细胞逐渐死亡，转染成功的细胞存活，即为稳定表达AcGFP1和IFN-β的细胞株，命名为IPEC-1/AcGFP1-IFN-β。
(5)利用稳定表达IFN-β的细胞株筛选IFN-β的诱生剂
在6孔细胞培养板中放置载玻片，接种细胞IPEC-1/AcGFP1-IFN-β，形成细胞爬片，取4组细胞爬片，命名为Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组，其中，Ⅰ组为空白对照组，Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组为试验组。
Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组分别用待筛选的诱生剂A、诱生剂B和诱生剂C(诱生剂A、诱生剂B和诱生剂C分别为来自植物提取物、功能性氨基酸、核苷酸的饲用功能性添加剂)处理细胞IPEC-1/AcGFP1-IFN-β，Ⅰ组不使用诱生剂处理；72小时后取出细胞爬片，冲洗后固定在载玻片上，用80％冷丙酮透化细胞，得到4组待测细胞。
用倒置荧光显微镜观察待测细胞中的AcGFP1荧光强度结果如图4至图7所示，其中，图4、图5、图6和图7分别对应为Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组的AcGFP1荧光强度测定结果图。由图4至图7可知，使用诱生剂A处理的细胞的AcGFP1荧光强度最强，使用诱生剂C处理的次之，而使用诱生剂B处理的细胞和没有使用诱生剂处理的细胞的AcGFP1荧光强度基本相同，且明显弱于使用诱生剂A和诱生剂C处理的两组。结果表明，本实施例中的待筛选诱生剂A和诱生剂C均为能用于诱生猪IFN-β的诱生剂，对诱导仔猪体内干扰素的产生有显著的促进作用，而诱生剂B则对诱导仔猪体内干扰素的产生没有明显的促进作用。
实施例2猪干扰素诱生剂的进一步筛选
(2)选取40头健康且体重相近的三周龄无特定病原体的仔猪，作为试验仔猪，随机分为a组、b组、c组和d组(每组10头仔猪)，其中，a组为空白对照组，饲喂正常日粮；b组、c组和d组为试验组，分别在日粮中添加诱生剂A、诱生剂B和诱生剂C，饲喂时间为15天。
(2)在试验的第8天和第15天，分别以前腔静脉方式采集a组、b组、c组和d组试验仔猪的血液样品，采用固相夹心ELISA定量检测IFN-β试剂盒(Abcam公司的Interferon betaPig ELISA Kit)，测定血液样品中IFN-β的浓度水平，测定方法如下：
①将固相夹心ELISA定量检测IFN-β试剂盒的试剂组份和待测样本放置在室温的条件下平衡30min；然后把5个标准品(分别为10pg/ml，50pg/ml，200pg/ml，400pg/ml和1000pg/ml)按每孔50μl的量依次加入一排孔中，并做好标记；相应的，再将待测样本液体按每孔50μl的量依次加入标记好的孔中。
②在两种孔中都加入25μl酶联亲和物，在微量振荡器上振荡15s，使液体混合均匀(在混合的过程中注意不要出气泡)。③把塑料膜包被在微孔板上，在37℃的恒温环境中反应1h后，用洗板机吸去孔内液体；然后用预先稀释好的清洗液反复冲洗5次微孔板。④每孔依照次序分别迅速滴加50μl底物I和50μl底物II，在振荡器上振荡混合均匀后，室温下避光反应15min；然后在每个孔中均滴加终止液50μl，在酶标仪上振荡混匀，使反应终止，并在450nm波长下读取OD值。⑤根据IFN-β试剂盒中各标准品对应的浓度，测出OD值，利用CurveExpert l.3作图软件绘制出标准曲线；然后将测出各个样品的OD值输入软件中，经过计算即可得到在不同时间各检测样品相应的IFN-β浓度。
试验仔猪血液样品中IFN-β的浓度测定结果如表1所示(表1中，同一行肩标字母不同者表示差异显著(p<0.05))。
表1实施例2中各组试验仔猪血液中的IFN-β浓度(pg/mL)
a组 b组 c组 d组
第8天 53.34±1.28c 180.45±4.67a 57.65±3.77c 150.61±7.35b
第15天 60.27±3.05c 212.77±6.19a 62.48±6.17c 173.42±8.37b
由表1可知，将本发明实施例1中筛选的猪干扰素诱生剂添加到日粮中饲喂试验仔猪后，使得试验仔猪血液中的IFN-β水平明显高于空白对照组，其中，使用诱生剂A饲喂的试验仔猪血液的IFN-β浓度最高，使用诱生剂C饲喂的次之，而使用诱生剂B饲喂的试验仔猪与使用正常日粮饲喂的试验仔猪血液的IFN-β浓度无显著差别，与上述实施例1中图4的测定结果一致，表明使用不同诱生剂诱导试验仔猪体内产生IFN-β的能力与使用不同诱生剂处理细胞IPEC-1/AcGFP1-IFN-β后测定的荧光强度一致，充分说明本发明提供的猪干扰素诱生剂的筛选方法确实有效，既可以筛选出能够诱导仔猪体内干扰素产生的干扰素诱生剂，也可以排除掉对诱导仔猪体内干扰素产生无明显促进作用的添加剂，准确性高；而且筛选出来的猪干扰素诱生剂可显著提高仔猪血液中的IFN-β水平，也即，筛选出来的猪干扰素诱生剂用于饲喂仔猪时，可在仔猪体内促进IFN-β的产生。
综上所述，本发明提供的猪干扰素诱生剂的筛选方法，通过扩增猪IFN-β基因，利用含有AcGFP1标记的载体pIRES2-AcGFP1，构建稳定表达猪IFN-β和AcGFP1的细胞IPEC-1，并利用此细胞中AcGFP1的表达强度，也即此细胞在荧光显微镜下的荧光强度，来评判筛选出的猪干扰素诱生剂诱生干扰素的产生能力，具有筛选快速、针对性强、结果准确的优点；筛选出来的猪干扰素诱生剂可直接作为饲料添加剂加入仔猪饲料中，用于诱导仔猪体内产生干扰素而实现抵抗仔猪疾病的作用，对应用诱生剂抵抗仔猪疾病的提供了新的技术手段，在饲料业与养猪业中具有广阔的应用前景。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种猪干扰素诱生剂的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S10、体外培养猪小肠细胞系，获得猪小肠上皮细胞IPEC-1；
步骤S20、以猪血基因组为模板，用猪干扰素β基因的特异性引物p1和p2进行PCR扩增，得到目的基因IFN-β片段，并将目的基因IFN-β片段与pMD18T克隆载体连接后进行培养，然后提取质粒，命名为pMD18T-IFN-β；
步骤S30、用Xho I和Sal I酶对质粒pMD18T-IFN-β和含有绿色荧光蛋白基因的表达载体pIRES2-AcGFP1进行双酶切，并回收目的基因IFN-β片段和线性化的pIRES2-AcGFP1载体片段，将目的基因IFN-β片段与线性化的pIRES2-AcGFP1载体片段连接后进行培养，然后提取重组质粒，命名为pIRES2-AcGFP1-IFN-β；
步骤S40、将猪小肠上皮细胞IPEC-1接至孔板中，待细胞融合至75～85％时，转染重组质粒pIRES2-AcGFP1-IFN-β和对照质粒pIRES2-AcGFP1，转染22～26h后向IPEC-1细胞中加入培养基继续培养，获得稳定表达AcGFP1和IFN-β的细胞株，命名为IPEC-1/AcGFP1-IFN-β；
步骤S50、将细胞IPEC-1/AcGFP1-IFN-β接至培养板上，用待筛选诱生剂处理细胞IPEC-1/AcGFP1-IFN-β，70～74h后取出细胞爬片并观察细胞的AcGFP1荧光强度，并根据AcGFP1荧光强度，从待筛选诱生剂中筛选出猪干扰素诱生剂。
2.如权利要求1所述的猪干扰素诱生剂的筛选方法，其特征在于，步骤S10包括：
将冻存有猪小肠上皮细胞IPEC-1的冻存管置于CO2培养箱中融化后，取出猪小肠上皮细胞IPEC-1并放入培养皿，向培养皿中加入细胞培养液后置于CO2培养箱中培养；
培养至细胞长满培养皿表面积的85～95％时，用磷酸盐缓冲液进行冲洗，然后加入胰酶，并置于CO2培养箱中消化8～12min，再加入完全培养基终止消化；
将终止消化后的细胞全部转移至离心管中，于800～1200rpm离心2～5min，然后加入完全培养基并转移至培养皿中继续培养1～3天，获得猪小肠上皮细胞IPEC-1。
3.如权利要求1所述的猪干扰素诱生剂的筛选方法，其特征在于，步骤S20包括：
根据已知的猪干扰素β基因IFN-β(Gene ID：NC_010443.5)序列设计特异性引物上游引物p1和下游引物p2，在上下游引物对应加入Xho I和Sal I酶切位点；
采取猪血液，以淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，以血液RNA提取试剂盒提取RNA，以cDNA合成试剂盒通过反转录获得cDNA，然后以此cDNA为模板，用特异性引物p1和p2进行PCR扩增，对扩增片段进行凝胶电泳检测，得到猪干扰素β基因的目的基因IFN-β片段；
通过凝胶电泳回收目的基因IFN-β片段，并将目的基因IFN-β片段与pMD18T克隆载体进行连接后，转化到大肠杆菌感受态细胞DH5a中，通过氨苄抗性筛选，获得阳性克隆；
挑起阳性克隆进行培养后，以质粒提取试剂盒提取质粒，并通过Xho I和Sal I双酶切对所提取的质粒进行酶切鉴定和测序分析，测序分析正确的质粒命名为pMD18T-IFN-β；
其中，上游引物p1的序列为5-GCCTCGAGATGGCTAACAAGTGCA-3，下游引物p2的序列为5-GGTCGACTCAGTTCCGGAGGTAAT-3。
4.如权利要求1所述的猪干扰素诱生剂的筛选方法，其特征在于，步骤S30包括：
用Xho I和Sal I酶对质粒pMD18T-IFN-β和含有绿色荧光蛋白基因的表达载体pIRES2-AcGFP1进行双酶切，通过凝胶电泳回收目的基因IFN-β片段和线性化的pIRES2-AcGFP1载体片段；
用T4连接酶将目的基因IFN-β片段和线性化的pIRES2-AcGFP1载体片段进行连接反应，并将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞DH5a中，通过卡拉霉素抗性筛选，获得阳性克隆；
挑起阳性克隆进行培养后，以质粒提取试剂盒提取重组质粒，并通过Xho I和Sal I双酶切对所提取的质粒进行酶切鉴定，酶切鉴定正确的重组质粒命名为pIRES2-AcGFP1-IFN-β。
5.如权利要求1所述的猪干扰素诱生剂的筛选方法，其特征在于，步骤S40包括：
将细胞IPEC-1按照每孔4×106～6×106个的量接种到6孔板中，待细胞融合至75～85％时，使用Lipofectamine2000转染重组质粒pIRES2-AcGFP1-IFN-β和对照质粒pIRES2-AcGFP1；
转染22～26h后，向IPEC-1细胞中加入含有800ug/ml G418的培养基，培养7～14天，每隔12～24h更换培养基，在培养期间，未转染的细胞逐渐死亡，转染成功的细胞存活，即为稳定表达AcGFP1和IFN-β的细胞株，命名为IPEC-1/AcGFP1-IFN-β。
6.如权利要求1所述的猪干扰素诱生剂的筛选方法，其特征在于，步骤S50包括：
在6孔细胞培养板上放置载玻片，将IPEC-1/AcGFP1-IFN-β细胞接种至载玻片上，形成细胞爬片；
用待筛选诱生剂处理细胞IPEC-1/AcGFP1-IFN-β，70～74h后取出细胞爬片，依次经冲洗、固定后，用80％的冷丙酮透化细胞，得到待测细胞；
用倒置荧光显微镜观察待测细胞中的AcGFP1荧光强度，并根据AcGFP1荧光强度的比较，筛选出可显著增加AcGFP1荧光强度的待筛选诱生剂，即为猪干扰素诱生剂。
7.如权利要求1所述的猪干扰素诱生剂的筛选方法，其特征在于，在步骤S50之后，还包括：
步骤S60、通过仔猪饲养试验，观测筛选出的猪干扰素诱生剂对仔猪体内干扰素的诱生效果，进一步筛选高效的猪干扰素诱生剂。
8.如权利要求7所述的猪干扰素诱生剂的筛选方法，其特征在于，步骤S60包括：
选取健康且体重相近的三周龄无特定病原体的仔猪，作为试验仔猪，并将试验仔猪随机分为对照组试验组，开始试验；
试验过程中，对照组试验仔猪使用正常日粮饲喂，试验组试验仔猪使用对应添加有步骤S50中所筛选的猪干扰素诱生剂的日粮饲喂，试验期为15天；
分别于试验第8天和第15天，通过前腔静脉方式采集对照组和试验组试验仔猪的血液样品，以IFN-β试剂盒测定试验仔猪血液中的IFN-β浓度，根据IFN-β浓度评价所筛选的猪干扰素诱生剂诱生猪干扰素β的表达效果，进而筛选出高效的猪干扰素诱生剂。
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