CN108181155B - 改进了对革兰氏阴性细菌的结晶紫-碘复合物的脱色的革兰氏染色方法 - Google Patents
改进了对革兰氏阴性细菌的结晶紫-碘复合物的脱色的革兰氏染色方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及改进了对革兰氏阴性细菌的结晶紫‑碘复合物的脱色的革兰氏染色方法。本文中提供将生物材料染色以用于检测，且在一些例子中还鉴定微生物的目的的方法。使用慢作用脱色制剂，如一种包含1,2‑丙二醇或乙二醇的脱色制剂来对细菌革兰氏染色的方法可用于延长脱色步骤的时间，如此允许革兰氏染色方法的自动化。还提供用于在显微镜载玻片上实施自动化革兰氏染色的组合物和试剂盒。
Description
本申请是申请日为2013年2月22日、中国申请号为201380020183.7、发明名称为“改进了对革兰氏阴性细菌的结晶紫-碘复合物的脱色的革兰氏染色方法”的发明申请的分案申请。
技术领域
本公开涉及，为了检测微生物以及在一些例子中鉴定微生物的目的，而对生物材料进行染色的方法。更具体地，本公开涉及用于在显微镜载玻片上实施自动化革兰氏染色的方法、组合物和试剂盒。
背景
革兰氏染色是一种公知的、普遍使用的微生物学技术，其用于微生物尤其是细菌的检测、分类和鉴定。革兰氏染色的最常见方法涉及四个步骤：染色、捕获、脱色和复染色。组织学实验室中常用的革兰氏染色已知是不稳定的，特别是由于脱色步骤中的波动所致。影响脱色步骤的变量包括溶剂强度、浓度、体积和暴露持续时间。在手动革兰氏染色过程中，脱色步骤常规使用醇或丙酮，且该步骤仅需数秒。然而，对于自动化染色过程，该脱色过程发生得太快。本公开针对在自动化染色平台上的革兰氏染剂脱色的问题。
概述
本文中提供了能自动进行革兰氏染色的方法、组合物和试剂盒。发明人已鉴定出延长革兰氏染色脱色步骤的组合物，其允许革兰氏染色的自动化，例如，使用自动化的和/或计算机执行的染色装备来实现自动化。
本文中提供了对样品(如在显微镜载玻片上的样品)进行革兰氏染色的方法。所述方法可用于检测和区分革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。在一些例子中，所公开的革兰氏染色方法被用于检测并非细菌的微生物，如酵母(例如假丝酵母(Candida)和隐球酵母(Cryptococcus))。
在具体的例子中，所述方法包括使样品与慢作用脱色制剂(如一种包含1,2-丙二醇或乙二醇的制剂)在足以从革兰氏阴性细菌而非革兰氏阳性细菌显著除去初级染剂-捕获剂复合物的条件下接触。所述样品是先前与初级染剂(如结晶紫)和捕获剂(如碘)接触过的样品。在具体的例子中，所述方法包括革兰氏染色过程的一个或多个另外的步骤，如使所述样品与初级染剂在足以将革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞壁和细胞膜染色的条件下接触；使所述样品与捕获剂在足以形成初级染剂-捕获剂复合物的条件下接触；使所述样品与复染剂在足以对已脱色的革兰氏阴性细菌进行染色的条件下接触，或其组合。
本文还提供能充当慢作用脱色制剂的组合物。在一个例子中，所述组合物包含至少80％的慢作用脱色剂(如1,2-丙二醇或乙二醇)和不超过20％的快作用脱色剂(如0.1-20％的快速作用脱色剂，例如乙醇或丙酮)。这类组合物可用作自动化革兰氏染色中的慢作用脱色制剂。
本文还提供用于自动化革兰氏染色的试剂盒。在一个例子中，所述试剂盒在容器中包含慢作用脱色制剂，如包含至少80％或至少90％的慢作用脱色剂(如1,2-丙二醇或乙二醇)和不超过20％的快作用脱色剂(如0.1-20％或1-10％的快速作用脱色剂，例如乙醇或丙酮)的制剂。在一些例子中，试剂盒可另外包含其他组分，如在容器中的一种或多种初级染剂；在容器中的捕获剂；在容器中的复染剂，显微镜载玻片，盖玻片，其他染剂，和对照载玻片。在具体的例子中，所述容器配置为与自动化革兰氏染色平台一起使用。
本发明涉及下述技术方案。
1.一种对样品进行革兰氏染色的方法，包括：
使所述样品与慢作用脱色制剂在足以从革兰氏阴性细菌而非革兰氏阳性细菌除去初级染剂-捕获剂复合物的条件下接触，其中所述样品事先已与初级染剂和捕获剂接触过。
2.技术方案1的方法，进一步包括：
使所述样品与初级染剂在足以将革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞壁染色的条件下接触；
使所述样品与捕获剂在足以形成初级染剂-捕获剂复合物的条件下接触；
使所述样品与复染剂在足以将脱过色的革兰氏阴性细菌染色的条件下接触；或
其组合。
3.技术方案2的方法，其中复染色在脱色的至少30秒后进行。
4.技术方案1的方法，其中使所述样品与所述慢作用脱色制剂接触达至少30秒。
5.技术方案1-4中任一项的方法，进一步包括将所述样品加载到自动染色装置中。
6.技术方案1-5中任一项的方法，其中使用压缩空气完成所述样品与慢作用脱色制剂的接触。
7.技术方案1-6中任一项的方法，其中所述慢作用脱色制剂包含慢作用脱色剂和快作用脱色剂。
8.技术方案1-7中任一项的方法，其中所述脱色制剂包含至少80％的所述慢作用脱色剂和不超过20％的所述快作用脱色剂。
9.技术方案1-8中任一项的方法，其中所述慢作用脱色制剂包含1,2-丙二醇或乙二醇。
10.技术方案1-9中任一项的方法，其中从已知或怀疑有细菌感染的受试者获得所述样品。
11.技术方案1-9中任一项的方法，其中所述样品是环境样品或食物样品。
12.技术方案1-11中任一项的方法，其中已经、同时或将要对所述样品在相同或分开的载玻片上进行一种或多种另外的测定法。
13.技术方案12的方法，其中使所述样品与针对特定细菌的一种或多种抗体接触、与另一种染剂接触、或其组合接触。
14.技术方案1-13中任一项的方法，其中通过自动化染色装备实施所述方法。
15.技术方案14的方法，其中所述自动化染色装备是Ventana NexES SpecialStainer或Ventana BenchMark Special Stainer。
16.技术方案1-15中任一项的方法，其中所述方法进一步包括检测革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。
17.技术方案1-16中任一项的方法，其中所述方法是计算机执行的方法。
18.一种使用自动染色装备在载玻片上对细菌进行革兰氏染色的方法，其中所述自动染色装备包含：
用于放置多个载玻片的转盘式传送工具，每个上面都有待染色的样品
用于以预定速度旋转所述转盘式传送工具的工具；和
在所述转盘式工具旋转期间指引和控制各个试剂加载到所述载玻片和样品上的工具，
且其中所述方法包括：
将结晶紫试剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以使所述载玻片上的细菌与所述结晶紫试剂接触；
将水、水性缓冲液、或水性去污剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以从所述载玻片洗去结晶紫试剂；
将碘试剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以使所述载玻片上的细菌与所述碘试剂接触；
将水、水性缓冲液、或水性去污剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以从所述载玻片洗去碘试剂；
同时或分开地将慢作用脱色制剂和复染剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上；并
将水、水性缓冲液、或水性去污剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以从所述载玻片洗去混合试剂。
19.一种组合物，包含至少80％的一种或多种慢作用脱色剂和不超过20％的一种或多种快作用脱色剂。
20.技术方案19的组合物，其中所述一种或多种慢作用脱色剂包含1,2-丙二醇、乙二醇或其混合物。
21.一种用于自动化革兰氏染色的试剂盒，包含：
在第一容器中的慢作用脱色制剂。
22.技术方案21的试剂盒，进一步包含：
在第二容器中的初级染色制剂；
在第三容器中的捕获剂；和
在第四容器中的复染色制剂。
23.技术方案21或22的试剂盒，其中所述容器配置为加载到自动化染色装置中。
24.技术方案23的试剂盒，其中所述自动化染色装置是Ventana NexES SpecialStainer或Ventana BenchMark Special Stainer。
25.技术方案21-24中任一项的试剂盒，还包含一个或多个显微镜载玻片。
26.技术方案21-25中任一项的试剂盒，还包含一个或多个对照载玻片。
27.技术方案21-26中任一项的试剂盒，其中将所述各个容器的内容物按照以下次序接触样品：第二容器、第三容器、第一容器、第四容器；其中可同时使用两个容器的内容物。
本公开的前述和其他对象和特征将从下列详细描述并参照附图而变得更加明显。
附图简述
图1是显示用于自动化革兰氏染色的例示性方法的流程图。
详述
提供对术语和方法的以下解释以更好地描述本发明及指导本领域普通技术人员实施本发明。除非上下文清楚地另外指示，单数形式“一个”、“一种”和“该”指一种或超过一种。例如，术语“包含一个/一种标本”包括单数或复数标本，且视为等同于短语“包含至少一种标本”。除非上下文清楚地另外指示，术语“或”指所述备选要素中的单个要素或者指两个或更多个要素的组合。如本文中使用的，“包含”意指“包括”。如此，“包含A或B”意指“包含A、B或A和B”，而不排除别的要素。
除非另外解释，本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本公开所述领域中的普通技术人员普遍理解的相同的含义。在有冲突的情况下，将以包括术语解释的本说明书为准。微生物学中的常见术语和方法的解释可见于Wistreich and Lechtman,LaboratoryExercises in Microbiology(微生物学的实验室手册),第6版,1988和Boyd,GeneralMicrobiology(微生物学概述),第2版,1988。
本文中提到的所有公开出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过提述完整并入以用于所有目的。
尽管可将类似或等同于本文中描述的抗体和材料的那些用于实践或测试所公开的技术，但下文描述了适宜的方法和材料。所述材料、方法和例子仅为例示性的且不意图为限制的。
为了促进对本公开的各实施方案的评述，提供了对特定术语的以下解释：
抗体(Ab)：包含至少一个轻链或重链免疫球蛋白可变区，且特异性结合抗原(如靶试剂)的表位的多肽。抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、或抗体片段以及本领域已知的其他抗体。在一些例子中，抗体特异于靶物，如具体细菌或细菌类型，如此可与本文中提供的方法相伴进行测定。
抗体由重链和轻链构成，它们各自具有可变区，称为可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区。VH区和VL区一起负责结合抗体所识别的抗原。这包括完整的免疫球蛋白及本领域公知的它们的变体和组成部分，如Fab'片段、F(ab)'2片段、单链Fv蛋白(“scFv”)和被二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白是一种融合蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区由接头结合，而在dsFv中，各个链经突变引入了二硫键，从而稳定各个链的联合。该术语还包括重组形式如嵌合抗体(例如人源化的鼠抗体)和异偶联抗体(如双特异性抗体)。亦参见Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce ChemicalCo.,Rockford,IL)；Kuby,Immunology,第3版,W.H.Freeman&Co.,New York,1997。
“单克隆抗体”是由B淋巴细胞的单个克隆或由转染了单个抗体的轻链和重链基因的细胞所产生。单克隆抗体由本领域技术人员已知的方法来产生，例如通过从骨髓瘤细胞与免疫脾细胞制备杂合的抗体形成细胞来产生。这些融合的细胞及其子代称作“杂交瘤”。单克隆抗体包括人源化的单克隆抗体。
细菌：在一些例子中，原核生物导致疾病(病原菌)。根据其细胞壁的结构特征可将细菌分类。例如，“革兰氏阳性”细胞壁中多层厚厚的肽聚糖层染色呈紫色，而薄的“革兰氏阴性”细胞壁呈现粉色。通过将形态学和革兰氏染色组合，可将大部分细菌归属至四个组(革兰氏阳性球菌、革兰氏阳性杆菌、革兰氏阴性球菌和革兰氏阴性杆菌)。
可利用公开的革兰氏染色方法检测的细菌的例子，包括但不限于：鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、放线杆菌属物种(Actinobacillus sp.)、放射菌(Actinomycetes)、放线菌属物种(Actinomyces sp.)(如伊氏放线菌(Actinomycesisraelii)和内氏放线菌(Actinomyces naeslundii))、气单胞菌属物种(Aeromonas sp.)(如嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、维罗纳气单菌温和生物变种(Aeromonasveronii biovar sobria)(温和产气单胞菌(Aeromonas sobria)和豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、木糖产碱杆菌(Alcaligenes xylosoxidans)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、杆菌属物种(Bacillus sp.)(如炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、类杆菌属物种(Bacteroides sp.)(如脆弱类杆菌(Bacteroidesfragilis)、巴尔通体菌属物种(Bartonella sp.)(如杆状巴尔通体(Bartonellabacilliformis)和汉赛巴尔通体(Bartonella henselae)、双歧杆菌属物种(Bifidobacterium sp.)、鲍特菌属物种(Bordetella sp.)(如百日咳鲍特菌(Bordetellapertussis)、副百日咳鲍特菌(Bordetella parapertussis)和支气管败血性鲍特菌(Bordetella bronchiseptica)、包柔氏螺旋体菌属物种(Borrelia sp.)(如回归热包柔体(Borrelia recurrentis)和伯氏包柔体(Borrelia burgdorferi))、布鲁氏菌属物种(Brucella sp.)(如流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、羊布鲁氏菌(Brucella melintensis)和猪布鲁氏菌(Brucella suis))、伯克霍尔德氏菌属物种(Burkholderia sp.)(如类鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)和洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)、弯曲菌属物种(Campylobacter sp.)(如空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、大肠弯曲菌(Campylobacter coli)、红嘴鸥弯曲菌(Campylobacter lari)和胎儿弯曲菌(Campylobacter fetus))、二氧化碳噬纤维菌属物种(Capnocytophaga sp.)、人心杆菌(Cardiobacterium hominis)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydophila psittaci)、柠檬酸杆菌属物种(Citrobacter sp.)、贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium sp.)(比如，牛棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、杰氏棒杆菌(Corynebacterium jeikeum)和棒状杆菌(Corynebacterium))、梭菌属物种(Clostridium sp.)(如产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)和破伤风梭菌(Clostridium tetani))、侵蚀艾肯菌(Eikenella corrodens)、肠杆菌属物种(Enterobacter sp.)(如产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)和大肠杆菌(Escherichia coli)、包括条件性大肠杆菌(opportunistic Escherichia coli),如肠产毒性大肠杆菌(enterotoxigenic E.Coli),肠侵袭性大肠杆菌(enteroinvasive E.Coli)、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic E.Coli)、肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagicE.coli)、肠聚集性大肠杆菌(enteroaggregative E.Coli)和尿道致病性大肠杆菌(uropathogenic E.coli)肠球菌属物种(Enterococcus sp.)(如粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)和屎肠球菌(Enterococcus faecium)埃立克体属物种(Ehrlichia sp.)(如恰菲埃里希氏体(Ehrlichia chafeensia)和犬艾利希体(Ehrlichia canis))、猪丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、优杆菌属物种(Eubacterium sp.)、土拉热弗朗西氏菌(Francisella tularensis)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、阴道嗜血杆菌(Gardnerella vaginalis)、麻疹孪生球菌(Gemella morbillorum)、嗜血杆菌属物种(Haemophilus sp.)(如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、埃及嗜血杆菌(Haemophilus aegyptius)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、溶血嗜血杆菌(Haemophilus haemolyticus)和副溶血嗜血杆菌(Haemophilus parahaemolyticus)、螺杆菌属物种(Helicobacter sp.)(如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、同性恋螺杆菌(Helicobacter cinaedi)和芬纳尔螺杆菌(Helicobacter fennelliae))、金氏金氏菌(Kingella kingii)、克雷伯氏菌属物种(Klebsiella sp.)(如克雷白氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)、肉芽肿杆菌(Klebsiella granulomatis)和产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca),乳酸杆菌属物种(Lactobacillus sp.)、产单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、嗜肺性军团病杆菌(Legionella pneumophila)、问号钩端螺方定体(Leptospira interrogans)、消化链球菌属物种(Peptostreptococcus sp.)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、摩根氏菌属物种(Morganella sp.)、动弯杆菌属物种(Mobiluncus sp.)、细球菌属物种(Micrococcus sp.)、分枝杆菌属种(Mycobacteriumsp.)(如麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)和海分枝杆菌(Mycobacterium marinum))、支原菌属物种(Mycoplasm sp.)(如肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)、人支原体(Mycoplasma hominis)和生殖器支原体(Mycoplasmagenitalium))、诺卡氏菌属物种(Nocardia sp.)(如星形诺卡氏菌(Nocardiaasteroides)、盖尔森基兴诺卡氏菌(Nocardia cyriacigeorgica)和巴西诺卡氏菌(Nocardia brasiliensis))、奈瑟氏菌属物种(Neisseria sp.)(如淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis))、出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、类志贺氏邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)、普雷沃氏菌属物种(Prevotella sp.)、卟啉单胞菌属物种(Porphyromonas sp.)、产黑素普雷沃氏菌(Prevotella melaninogenica)、变形菌属物种(Proteus sp.)(如普通变形菌(Proteus vulgaris)和奇异变形菌(Proteus mirabilis))、普罗威登斯菌属物种(Providencia sp.)(如产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)和斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii))、绿胺假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、短小棒状杆菌(Propionibacterium acnes)、马红球菌(Rhodococcus equi)、立克次体属物种(Rickettsia sp.)(如立克氏立克次体(Rickettsiarickettsii)、螨立克次体(Rickettsia akari)和普氏立克次体(Rickettsiaprowazekii)、恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)(学名：恙虫病立克次体(Rickettsia tsutsugamushi)和地方性斑疫伤寒立克次氏体(Rickettsia typhi)、红球菌属物种(Rhodococcus sp.)、粘质沙雷氏杆菌(Serratia marcescens)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、沙门氏菌属物种(Salmonella sp.)(如肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、猪霍乱沙门菌(Salmonella cholerasuis)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属物种(Serratia sp.)(如粘质沙雷氏菌(Serratia marcesans)和液化沙雷氏菌(Serratialiquifaciens)、志贺氏菌属物种(Shigella sp.)(如志贺氏痢疾菌(Shigelladysenteriae)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、波伊德志贺氏菌(Shigella boydii)和宋内志贺菌(Shigella sonnei)、葡萄球菌属物种(Staphylococcus sp.)(如金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus hemolyticus)、腐生性葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、链球菌属物种(Streptococcus sp.)(如肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)(例如氯霉素-抗性血清型4肺炎链球菌(chloramphenicol-resistantserotype 4Streptococcus pneumoniae)、壮观霉素-抗性血清型6B炎链球菌(spectinomycin-resistant serotype 6B Streptococcus pneumoniae)、链霉素-抗性血清型9V肺炎链球菌(streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcuspneumoniae)、红霉素-抗性血清型14肺炎链球菌(erythromycin-resistant serotype14Streptococcus pneumoniae)、奥普托欣-抗性血清型14肺炎链球菌(optochin-resistant serotype 14Streptococcus pneumoniae)、利福平-抗性血清型18C肺炎链球菌(rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcus pneumoniae)、四环素-抗性血清型19F肺炎链球菌(tetracycline-resistant serotype 19F Streptococcuspneumoniae)、青霉素-抗性血清型19F肺炎链球菌(penicillin-resistant serotype 19FStreptococcus pneumoniae)和甲氧苄氨嘧啶-抗性血清型23F肺炎链球菌(trimethoprim-resistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae)、氯霉素-抗性血清型4肺炎链球菌(chloramphenicol-resistant serotype 4Streptococcus pneumoniae,e4Streptococcus pneumoniae)、壮观霉素-抗性血清型6B肺炎链球菌(spectinomycin-resistant serotype 6B Streptococcus pneumoniae)、链霉素-抗性血清型9V肺炎链球菌(streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae)、奥普托欣-抗性血清型14肺炎链球菌(optochin-resistant serotype 14Streptococcus pneumoniae)、利福平-抗性血清型18C肺炎链球菌(rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcuspneumoniae)、青霉素-抗性血清型19F肺炎链球菌(penicillin-resistant serotype 19FStreptococcus pneumoniae)或甲氧苄氨嘧啶-抗性血清型23F肺炎链球菌(trimethoprim-resistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、化胺性链球菌(Streptococcuspyogenes)、A 组链球菌(Group A streptococci)、化胺性链球菌(Streptococcuspyogenes)、B组链球菌属(Group B streptococci)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、C组链球菌属(Group C streptococci)、咽颊炎链球菌(Streptococcusanginosus)、类马链球菌(Streptococcus equismilis)、D组链球菌(Group Dstreptococci)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、F组链球菌(Group F streptococci)和咽颊炎链球菌(Streptococcus anginosus)、G组链球菌(Group G streptococci)、鼠咬热螺旋体(Spirillum minus)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformi)、密螺旋体属物种(Treponema sp.)(如品他病密螺旋体(Treponema carateum)、细弱密螺旋体(Treponema petenue)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)和地方性密螺旋体(Treponema endemicum)、Tropheryma whippelii、解服支原体(Ureaplasmaurealyticum)、韦荣球菌属物种(Veillonella sp.)、弧菌属物种(Vibrio sp.)(如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)、嗜盐弧菌(Vibriovulnificus)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、嗜盐弧菌(Vibriovulnificus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、霍氏弧菌(Vibrio hollisae)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、梅氏弧菌(Vibrio metchnikovii)、海鱼弧菌(Vibrio damsela)和弗氏弧菌(Vibrio furnisii)、耶尔森氏菌属物种(Yersiniasp.)(如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)和假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)和嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia)等。
接触：直接的物理结合；包括固体形式和液体形式两种。例如，接触可在体外发生于试剂(如革兰氏染料中的一个成分)和样品之间，所述样品位于溶液中或一个表面上(例如在显微镜载玻片上)。
脱色剂(decolorizing agent)：可从样品(利如用初级染剂和捕获剂染色的样品)中基本上去除初级染剂(例如结晶紫)和捕获剂(例如碘)复合物的试剂，比如从革兰氏阴性细菌而非革兰氏阳性细菌的细胞壁中基本上去除所述复合物的试剂。在一个例子中，这样的复合物称作结晶紫-碘(CV-I)复合物。在具体的例子中，脱色剂与含有初级染剂-捕获剂复合物(例如CV-I复合物)的样品一起孵育一段时间，所述时间足以从革兰氏阴性细胞而非革兰氏阳性细胞中基本上去除(比如去除至少90％、至少95％或至少99％的)所述复合物(且从而去除初级染剂)。
脱色制剂(decolorizing formulation)：组合物，包括一种或多种脱色剂。慢作用脱色剂是需要更长的时间才能从革兰氏阴性细胞中去除初级染剂-捕捉剂(例如，CV-I)复合物(且从而去除初级染剂，例如，结晶紫)的一种试剂，所述时间例如是，允许自动化设备完成脱色步骤、从而维持该自动化设备在完成所需脱色后将要发生另外的脱色作用(比如使革兰氏阳性细菌脱色)之前控制脱色步骤的完结的能力所需的时间。在一些例子中，缓慢脱色的时间是至少30秒、至少60秒、至少120秒、或至少220秒，例如1至4分钟，以从革兰氏阴性细菌中去除初级染剂-捕获剂(例如CV-I)复合物。慢作用脱色剂的例子包括1,2-丙二醇和乙二醇。快作用脱色剂是仅需要短时间就能从革兰氏阴性细胞中去除初级染剂-捕获剂(例如CV-I)复合物(且从而去除初级染剂,例如结晶紫)的一种试剂，所述时间比如少于20秒、少于15秒、少于10秒、或少于5秒，例如1至2秒、1至5秒、1至10秒或1至20秒。例子包括乙醇、丙酮、二乙醚、甲醚，乙醇与丙酮的共混物，以及乙醇与其他醇类如甲醇或2-丙醇的共混物。
检测：为确定一种因素(如信号或具体生物，如革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌)是否存在，例如具体细菌。在一些例子中，这可进一步包括定量。例如，本文公开的方法和试剂在具体例子中的应用允许报告出较强和较弱的信号。
革兰氏阳性细菌：在革兰氏染色过程中染色深蓝色或紫色的细菌，且具有厚的肽聚糖层。革兰氏阳性细菌的例子包括：
革兰氏阴性细菌：在革兰氏染色过程中染色较浅或不能维持深蓝色或紫色，而是被复染剂如番红着色并呈现粉色或红色的细菌。革兰氏阴性细菌具有薄的肽聚糖层。示例性的革兰氏阴性细菌包括：
初级染剂：在革兰氏染色中，其是应用于样品的第一种染料。初级染剂的例子是结晶紫染料。
定量：确定或测量靶标的量(如相对量)，如存在于样品中的靶细菌的量。
参考值：代表具体状况的数值或数值范围。实验值可以与参考值相比较，例如以进行诊断或预后。例如，参考值可以是期望来定义阳性或阴性结果(如革兰氏阳性或革兰氏阴性)的颜色的相对的或绝对的、最大的或最小的量(或范围)。
载玻片：通常用于装载或固定样品以用于显微镜检的基片，其通常是透明至浅色的，但不必须如此。样品可在装载到载玻片上之前和/或之后进行处理。在一些例子中，载玻片可以是差不多透明的或不透明的，且由玻璃、二氧化硅、石英或适应于革兰氏染色的任何其他材料制成。可将载玻片配置成容纳来自一个或多个受试者的一个或多个样品。如本文所用的载玻片还包括非常规的基片，比如条带、圆盘、平板，或适合于呈现用于革兰氏染色的样品的任何其他扁平的、弯曲的、矩形的或球形的表面或形状。
受试者：活的或死亡的多细胞生物，包括植物以及人类和非人动物，比如牲畜受试者(例如，鸟、猫、狗、奶牛、猪、马和啮齿动物)。在一个例子中，受试者已知有或怀疑有细菌感染。
捕获剂：与染料形成复合物且然后降低或减缓可能从样品或底物中洗掉染料的程度的试剂。在革兰氏染色方案中，碘是示例的捕获剂。捕获剂有时被称作媒染剂，但更精确地是捕获剂。媒染剂与底物更紧密地结合且不容易洗掉，并且，在革兰氏染色中，一些会被清洗去除的能力其实是为避免假阳性的目的而需要的。媒染剂与染料形成复合物，该复合物随后再与底物(比如织物)结合，然后有效避免了洗去染料。捕获剂也与染料形成复合物，但该复合物仅阻止洗的过程中染料的去除。捕获作用的机制通常是未知的，但可能归因于有益的扩散阻碍或空间阻碍。捕获剂一般不会通过与底物的强力键接起作用，与捕获剂一起形成的复合物中的染料仍可能在适宜的条件下被去除，比如，如在革兰氏染色中，通过足够有效的脱色剂的足够长的应用来去除。
在足以……的条件下：该短语用于描述允许所需活性的任何环境。这包括使试剂与样品在一定条件下相接触，所述条件允许所述试剂：在物理上或化学上与所述样品相互作用或反应、在所述样品中扩散、或置换出所述样品中的其他组分。在一个具体例子中，这包括将样品(比如一种已知含有或怀疑含有细菌的样品)与革兰氏染色的一种或多种试剂或组分相接触，以允许在样品中精确检测革兰氏阴性或革兰氏阳性。
总述
革兰氏染色是熟知的，常用于微生物技术以用于微生物尤其细菌的检测、分类和鉴定，比如基于其细胞膜结构将细菌分为两大类：革兰氏阳性和革兰氏阴性。革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌之间的首要区别在于，在革兰氏阳性细菌中，初级染剂吸收于整个细胞结构中，而在革兰氏阴性细菌中，染色仅发生在表面。因此，当随后利用脱色剂处理样品时，革兰氏阴性细菌倾向于失去其颜色，而革兰氏阳性细菌通常保持染色的蓝色或紫色。
革兰氏染色比较容易有不一致的和波动的结果。尤其是，脱色步骤可能在使细菌适当脱色方面存在问题。若脱色不足，革兰氏阴性细菌保留初级染剂(例如，结晶紫)，而若过度脱色，革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均会褪色。脱色中的不一致性可归因于初级染剂-捕捉剂复合物对脱色溶剂的亲和力、脱色溶剂的用量、脱色溶剂的相对溶解强度，以及脱色溶剂与样品接触的时间。
在常规人工革兰氏染色方法中，脱色步骤仅需要少量体积(比如2-3滴)，且仅花费几秒来使革兰氏阴性细菌脱色。革兰氏染色按常规制备并人工分析。然而，这对于自动化的程序而言太快了，因为仪器的限制可能在该步骤需要几分钟。结果，当在自动化的系统中使用常规的脱色剂时，发生不可接受的程度的脱色。因此，本文提供新的慢作用脱色剂以及能延长脱色步骤并允许自动化革兰氏染色的制剂。
革兰氏染色的方法
传统上，革兰氏染色包括4个步骤，各步骤对样品施用以下试剂之一：初级染剂，常见是结晶紫染料；捕获剂(有时称为媒染剂)，常见为碘；脱色剂，常见为乙醇或乙醇/丙酮；和复染剂，通常含有番红精O、品红或其他红色染料。本公开提供在包括非常快速脱色步骤(例如1-5秒)的革兰氏染色的现有手动方法上进行改进的方法。所公开的用于革兰氏染色的方法可用于自动化过程，因为已鉴定出延长脱色步骤的慢作用脱色剂(例如脱色花费至少30秒或至少60秒)。
本公开内容提供对样品进行革兰氏染色的方法。所述方法可用于检测和区分样品中存在的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。在具体的例子中，所述方法包括使一种样品(或多种样品)与慢作用脱色制剂在足以从革兰氏阴性细菌而非革兰氏阳性细菌除去初级染剂-捕获剂复合物(例如CV-I复合物)的条件下接触，其中所述样品先前与初级染剂和捕获剂接触过。
将领会在一些例子中，所述方法进一步包括革兰氏染色的一个或多个其他步骤。例如，该方法还可以包括以下一或多项：使样品与初级染剂在足以将革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的细胞壁(其包含肽聚糖)(且在一些例子中细胞膜)染色的条件下接触，使样品与捕获剂在足以形成初级染剂-捕获剂复合物的条件下接触，这可以阻止从革兰氏阳性细菌而非革兰氏阴性细菌除去初级染剂，以及使样品与复染剂在足以将脱色的革兰氏阴性细菌的细胞壁染色(其包含肽聚糖)(且在一些例子中细胞膜)的条件下接触。
使样品与初级染剂接触可包括使样品与包含结晶紫(CV)或甲紫(Gentianviolet)的制剂接触或将样品与其温育。在一个例子中，初级染剂制剂包含浓度为至少0.5g/L、至少0.75g/L、至少1g/L、至少2g/L、至少3g/L、至少4g/L,或至少5g/L,如1-4g/L,例如3g/L的CV或甲紫。在一些例子中，CV或甲紫存在于含有异丙醇、乙醇/甲醇和水(如50ml异丙醇、50ml乙醇/甲醇和900ml水)的溶液中。在一些例子中，所述CV或甲紫溶液含有草酸铵以增强稳定性。
使样品与捕获剂接触可包括使样品与包含碘的制剂如革兰氏碘或聚乙烯吡咯烷酮-碘(PVP-碘)溶液接触或将样品与其温育。革兰氏碘是一种混合物，其可以包含至少0.1％碘(例如至少0.2％、至少0.5％,或至少1％,如约0.1％-1％碘)和至少0.1％碘化钾(例如至少0.2％、至少0.5％、至少1％、至少1.5％,或至少2％,如约0.1％-2％碘化钾)，例如在水或醇混合物中。PVP-碘包含在水中至少1％聚乙烯吡咯烷酮(例如至少2％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％,或至少35％,如约1-35％聚乙烯吡咯烷酮)和至少1％碘(例如至少2％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％,或至少35％,如约1％-35％碘)(例如参见美国专利第2,739,922号和第3,898,326号)。
使样品与复染剂接触可包括使样品与包含品红(如碱性品红或石炭酸品红)、中性红、和/或番红精O的制剂接触或将样品与其温育。在一个例子中，所述复染剂制剂包含浓度为至少0.01％、至少0.02％、至少0.03％、至少0.05％、至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％,或至少0.5％，如0.02％至0.5％的品红。在一个例子中，所述复染剂制剂包含浓度为至少0.01％、至少0.02％、至少0.03％、至少0.05％、至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％,或至少0.5％，如0.02％至1％的中性红。在一个例子中，所述复染剂制剂包含浓度为至少0.1％,如至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％,或至少0.8％，如0.1％至1％或0.1％至0.8％的番红精O。复染剂可以配制在水中，但在一些例子中可包含1％-20％乙醇或甲醇。
在一些例子中，将样品与慢作用脱色制剂和复染剂同时温育。在一些例子中，慢作用脱色制剂在慢作用脱色制剂/复染色制剂组合中的浓度范围可从约75％至99％，如至少75％的慢作用脱色制剂、至少80％的慢作用脱色制剂、至少90％的慢作用脱色制剂，或至少95％的慢作用脱色制剂。在其他例子中，将样品首先与缓慢作用脱色制剂温育，接着是复染剂。
本领域技术人员会领会革兰氏染色方法的每个接触步骤在下一个接触步骤之前都可以包括或继之以漂洗步骤。漂洗可以使用能洗掉先前制剂而无不想要的反应的任何随后制剂完成。例如，随后制剂可以是后续的革兰氏染色制剂之一，将其过量与样品接触，并允许排掉，在该情况中将漂洗和使样品与下一个革兰氏染色制剂接触有效组合(例如以图1中显示的次序)。在另一个例子中，在接触步骤之后或作为其一部分加入分别的漂洗步骤(例如图1中显示的那些)。在该例子中，当样品与无活性制剂(例如水或缓冲液)接触时进行漂洗，然后允许排掉。
在一些例子中，样品与慢作用脱色制剂接触或温育的时间长于传统的手动革兰氏染色。例如，使用慢作用脱色制剂需要更长的时间以从革兰氏阴性细胞除去初级染剂-捕获剂(例如CV-I)复合物(及如此初级染剂，例如结晶紫)。在一些例子中，样品与慢作用脱色制剂接触或温育至少30秒、至少45秒、至少60秒、至少120秒、或至少220秒、例如30秒至4分钟，1至5分钟，或2至4分钟。在一些例子中，更长的脱色时间段允许自动化装置完成脱色步骤，如此维持自动化装置在发生超出期望的脱色(如将革兰氏阳性细菌脱色)之前控制脱色步骤完成的能力。如此，在一些例子中，一个或多个步骤之间或之中的时间设计为符合自动化，如通过特定装置部分的革兰氏染色自动化。
在一个例子中，将样品与初级染剂、捕获剂或复染剂温育或接触达至少30秒、至少40秒、至少50秒、至少60秒、至少70秒、至少80秒、至少90秒、至少100秒、至少120秒、至少150秒、至少180秒、至少210秒、至少220秒、至少240秒、至少270秒、或至少300秒。另外，在使样品与任意或每种革兰氏染色制剂(初级染剂，捕获剂，缓慢作用脱色制剂和复染剂)接触后，后续的样品与漂洗制剂或与任何随后革兰氏染色制剂的接触在一些例子中可在至少约10秒、20秒、30秒、40秒、50秒、60秒、70秒、80秒、90秒、100秒、120秒、150秒、180秒、210秒、240秒、270秒、或300秒后进行。如此，例如，在使样品与初级染剂接触后，与捕获剂的接触可发生在至少10秒后，如至少30秒或至少1分钟后。在其中包括使用无活性制剂的分开漂洗步骤的例子中，在该漂洗步骤后，与下一个革兰氏染色制剂接触可在至少约0.5秒、1秒、2秒、4秒、6秒、8秒、10秒、20秒、30秒、40秒、50秒、60秒、70秒、80秒、90秒、100秒、120秒、150秒、180秒、210秒、240秒、270秒或300秒后进行。
革兰氏染色方法中试剂的使用温度可以是周围环境，或者可以由自动化装置和本地设施来控制，达到对每种制剂相同或对一种或多种制剂有不同的程度。在一个例子中，无活性漂洗制剂比环境空气温度相对要冷。在一些例子中，无活性漂洗制剂在马上与样品接触之前的范围是5°至50℃。在一些例子中，一种或多种革兰氏染色制剂(初级染剂,捕获剂,缓慢作用脱色制剂和复染剂)在马上与样品接触之前为10°至60℃。
在一些例子中，调整革兰氏染色制剂的pH，并且可以包括酸、碱和缓冲剂。在一些例子中，一种或多种革兰氏染色制剂(初级染剂,捕获剂,缓慢作用脱色制剂和复染剂)在pH＝3至pH＝8，例如以实现更好的染色和在革兰氏染色后区分细菌细胞和非细菌细胞。
在一些例子中，所述方法还包括检测样品中的革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，例如使用显微镜或其他类似的装置。例如，所述方法可包括确定分析的样品是否含有革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌。
所公开的方法在图1中例示，该图显示了例示性的自动化染色方法，100，其包括革兰氏染色规程101。图1中显示的革兰氏染色规程101具有包括以下的步骤：使样品与初级染剂制剂107接触，使样品与捕获制剂108接触，使样品与缓慢作用脱色制剂109接触，使样品与复染色制剂110接触，和将样品111分类为革兰氏阳性、革兰氏阴性或不确定的。如此，所述方法包括使样品与缓慢作用脱色制剂109接触。图1显示使样品与缓慢作用脱色制剂109接触发生在样品与初级染剂制剂107和捕获制剂108接触之后，但在样品与复染色制剂110接触之前。如上文论述的，每个接触步骤107,108,109,and 110在下一个接触步骤之前可包括或继之以另外的漂洗步骤。例如，在样品与初级染剂制剂107接触之后，可在样品与捕获制剂108接触之前或期间将其漂洗。所述方法还可以包括步骤111，其分类或确定样品中的细菌是革兰氏阴性、革兰氏阳性、或者是否不能进行这类确定。
如此，在样品与任意或每种图1的革兰氏染色制剂接触后(107,108,109和/或110)，后续的与漂洗制剂或与随后的革兰氏染色制剂接触可在至少约10秒、20秒、30秒、40秒、50秒、60秒、70秒、80秒、90秒、100秒、120秒、150秒、180秒、210秒、215秒、220秒、240秒、270秒、或300秒后发生。在其中包括使用无活性制剂的分开漂洗步骤的例子中，在该漂洗步骤后，与图1的下一个革兰氏染色制剂(107、108、109和/或110)接触可在至少约0.5秒、1秒、2秒、4秒、6秒、8秒、10秒、20秒、30秒、40秒、50秒、60秒、70秒、80秒、90秒、100秒、120秒、150秒、180秒、210秒、240秒、270秒、或300秒后进行。
如图1中显示的，在用于自动化革兰氏染色100的方法中，该方法可包括获得样品102和将样品103加载到自动化装置中的步骤。该自动化装置可在平行的105中或在系列的先前104中或在随后的106中、革兰氏染色步骤101中进行测定。先前的104和随后的系列测定106可在相同的样品中进行，但例如在不同的载玻片上进行。先前104和随后系列测定106的例子包括免疫测定和另外的微生物学测定。
自动化
在一些例子中，使用自动染色装置进行一个或多个革兰氏染色步骤(例如使样品与初级染剂制剂、捕获剂制剂、慢作用脱色剂制剂、和/或复染色制剂接触)。例如，所公开的方法可与Ventana Medical Systems,Inc.装置如Ventana NexES Special Stainer、Ventana BenchMark Special Stainer、Benchmark XT、Benchmark Ultra和Discovery系统一起使用。例示性的系统在美国专利第6,352,861号、美国专利第5,654,200号、美国专利第6,582,962号、美国专利第6,296,809号和美国专利第5,595,707号中公开，且关于自动化系统和方法的另外的信息还可见于PCT/US2009/067042。
在一些例子中，用于自动化革兰氏染色的方法是计算机执行的方法，其中算法、自动化装置内的计算机、分开的计算机、和/或分布式计算机系统和/或网络经由一种或多种计算机可读介质中的计算机可执行指令作用于执行任意或所有的革兰氏染色步骤(例如图1中的一个或多个步骤，如图1的步骤107、108、109、110和111)。例如，所公开的革兰氏染色方法的计算机执行(例如如图1中显示的)可有助于样品的追踪、测定法的选择和/或时机和/或测定的步骤、装置的控制、结果的获得和/或分析、数据保留、向医学或其他信息系统的报告和与其交互、决策制定、样品流的变化、和/或通知操作者或其他人员。
在自动化的革兰氏染色方法中，自动化装置可能需要比传统的手动革兰氏染色方法更多的时间来处理多种样品和进行测试，如以分钟而不是以秒。例如，可就持续时间以及体积和溶剂化强度而言来调整脱色步骤，从而仅从革兰氏阴性细菌适宜地除去初级染剂-捕获剂复合物(例如CV-I复合物)。然而，对于自动化系统如Ventana Medical Systems,Inc.NexES Special Stainer,BenchMark Special Stainer,Benchmark XT,BenchmarkUltra，或Discovery系统，其中分配/施用和漂洗/除去之间的时间固定为确定的最小值，对脱色步骤的控制被限制为改变脱色制剂的体积或溶剂化强度。若体积太小，可发生不一致的脱色，且其可能改变乙醇的溶剂化强度以允许仅从革兰氏阴性细菌中进行初级染剂-捕获剂复合物(例如，CV-I复合物)的选择性脱色。例如，Ventana BenchMark SpecialStainer在分配和去除这两个过程之间的明确且不变的固定步骤中运行，且本文显示慢作用脱色制剂，比如包括1,2-丙烷的那些制剂，在该期限内有效地和选择性地使革兰氏阴性细菌脱色。
自动化染色设备可部分地通过使用压缩的空气来运行。因此，在一些例子中，当将样品与初级染色制剂、捕获剂制剂、缓慢作用脱色剂制剂和、或复染制剂相接触时，使用压缩的空气将初级染剂制剂、捕获剂制剂、慢作用脱色剂制剂，和、或复染剂递送至样品。
在一些例子中，所述方法包括将待分析有无细菌的样品加载到自动化染色的设备中。
在一个特定的例子中，提供了用于利用自动化染色设备在载玻片上对细菌进行革兰氏染色的方法。自动化染色设备可包括用于持有多个载玻片的转盘式传送工具，其中每个载玻片在其上具有待染色的样品，比如已知含有或怀疑含有细菌的样品。自动化染色设备还可包括用于以预定的速度旋转该转盘式传送工具的工具和在转盘式传送工具的旋转过程中用于导引和控制试剂(比如革兰氏染色试剂或其他染剂)在载玻片和样品上的应用的装置。该方法可包括将初级染剂试剂(比如含有结晶紫的一种试剂)导引到转盘式传送工具中的载玻片上以将载玻片上的细菌与初级染剂试剂相接触；将水、水-表面活性剂混合物，或缓冲液导引到转盘式传送工具中的载玻片上以从载玻片冲洗初级染剂试剂，所述冲洗例如在允许多余的染剂去除的条件下进行；将捕获试剂(比如含有碘的一种试剂)导引到转盘式传送工具中的载玻片上以将载玻片上的细菌与捕获试剂相接触，所述接触例如在允许在样品中的格兰仕阳性细菌中形成初级染剂-捕获剂复合物的条件下进行，将水或其他缓冲液导引到转盘式传送工具中的载玻片上以从载玻片冲掉过量的捕获试剂；将慢作用脱色制剂和复染剂单独地或共同地导引到转盘式传送工具中的载玻片上，所述导引例如在允许去除样品中的革兰氏阴性细菌中的初级染剂的条件下进行；和将水和缓冲液导引到转盘式传送工具中的载玻片上以从载玻片冲洗过量的慢作用脱色制剂和/或复染剂(若慢作用脱色制剂和复染剂是分别添加的，该方法可包括期间的洗涤步骤)。方法还可包括在载玻片上检测革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。
慢作用脱色制剂
所公开的方法中使用的慢作用脱色制剂依赖于慢作用脱色剂如1,2-丙二醇和乙二醇的鉴定。本文显示了脱色剂1,2-丙二醇，或通常所称的丙二醇(PG)，可在自动化的染色仪的定时的固定步骤(4分钟)内有效地从革兰氏阴性细菌中脱色CV-I复合物，所述染色仪例如BenchMark Special Stainer。与其他脱色剂相比，PG较慢地溶解革兰氏阴性细菌的脂多糖并允许CV-I复合物从细菌细胞膜(肽聚糖)扩散，从而仅允许革兰氏阴性细胞的选择性脱色以较慢的速率发生。因此PG允许通过自动化的染色系统进行革兰氏染色，所述自动化的染色系统在脱色剂应用和去除之间具有设定的时间，该设定的时间基本上长于利用常规脱色剂所用的时间。
这些和任何其他慢作用脱色剂中的一种或多种可以以纯的形式、用水或缓冲液稀释的形式、与快作用剂一起的形式来使用以产生具有所需脱色速率的脱色制剂。在一个例子中，慢作用脱色制剂包括慢作用脱色剂，如1,2-丙二醇，乙二醇，或其组合。在一个具体例子中，慢作用脱色制剂是1,2-丙二醇或乙二醇或由它们组成。在一些例子中，水可包括在慢作用脱色制剂中，例如以范围从约0％至25％，如0.5％至25％，1％至20％，5％至10％，如约10％的浓度。
在一些例子中，慢作用脱色制剂可包括缓慢作用脱色剂和快速作用脱色剂的混合物，如至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％的缓慢作用脱色剂(例如1,2-丙二醇,乙二醇或其组合)，如80％至99.99％、80％至95％、90％至99或90％至95％的缓慢作用脱色剂，和不超过20％、不超过19％、不超过18％、不超过17％、不超过16％、不超过15％、不超过14％、不超过13％、不超过12％、不超过11％、不超过10％、不超过9％、不超过8％、不超过7％、不超过6％、不超过5％、不超过4％、不超过3％、不超过2％、不超过1％、不超过0.5％或不超过0.01％的快速作用脱色剂，如0.01％至20％、1％至20％、1％至10％或1％至5％的快速作用脱色剂。快速作用脱色剂的例子包括丙二醇单甲醚、二乙醚、乙醇、丙酮、甲醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇或其组合，如乙醇和丙酮的共混物和乙醇和其他醇类如甲醇或2-丙醇的共混物。
样品
样品可以是待分析细菌的存在的任何材料。样品可以是生物的或非生物的且可获自受试者、环境、系统或过程。因此，在一些例子中，方法包括获得样品。例如，样品可获自已知有或怀疑有细菌感染的受试者，或获自已知或怀疑被细菌污染的来源。
在一个例子中，样品获自受试者，比如人类受试者。该样品可以是固体的或流体的样品，获自受试者或由受试者排泄或分泌，所述受试者比如细胞、细胞裂解物、外周血(或其成分，比如血清或血浆)、尿、胆汁、腹水、唾液、颊刮拭物、组织活检物(比如肿瘤活检物或淋巴结活检物)、外科样本、骨髓、羊水样品、细针吸入物、子宫颈样品(例如，PAP涂片、来自外子宫颈或内子宫颈的细胞)、脑脊髓液、水状体或玻璃体、渗出液、流出物(例如，获自脓肿或感染或炎症的任何其他位点的流体)、获自关节(例如，正常的关节或患病的关节，比如类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风关节炎或败血关节炎)的流体和尸检物质。
在一个例子中，样品获自环境，比如获自水体、空气、沉淀物、灰尘、土壤或获自自然环境或居民环境、商业、工业、医药、学校、农业或其他人造环境(例如，食物加工、生产和消耗设施和处理环境)中，且可获自工业来源，比如农场、废物流或水源。因此，样品通常可以是获自已知含有细菌、微生物或多细胞物质的那些。
在一个例子中，样品是食物样品(比如肉、水果、奶制品或蔬菜样品)活活子食物加工植物的样品。
在一些例子中，样品是收集的流体、刮擦物、过滤物或培养物。在一个例子中，样品是细胞学样品。在具体的例子中，直接使用样品(例如新鲜的或冷冻的)，或在使用前处理样品，例如通过浓缩、稀释、固定(例如使用福尔马林或热)和/或包埋于蜡中(如福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品)来进行处理。在一个例子中，样品是热固定于显微镜载玻片的。
另外的测定
在一些例子中，公开的方法可包括对样品进行另外的测定，例如以确定或鉴定样品中的特定的细菌。另外的测定可在革兰氏染色之前或之后，或甚至于革兰氏染色同时或同期进行。例如，可将样品涂覆于多个载玻片(例如，不同的载玻片或FFPE样品的不同的切片)，其中对每个载玻片进行特定的测定。因此，可对相同的样品载玻片和/或取自相同样品并固定在不同的载玻片上的多个切片，和/或固定在相同的和/或不同的载玻片上的来自相同的和/或不同的受试者的不同的样品平行地和/或连续地进行多个测定。
在一个例子中，对样品进行免疫测定，例如通过与对特定的靶细菌具有特异性的一种或多种抗体孵育，并利用标记物(比如抗体上的标记物或通过使用标记的第二抗体)检测来进行免疫测定。示例性的可检测的标记物包括荧光团、半抗原、酶、放射性标记物、量子点和本领域中已知的其他可检测标记物。
在另一个例子中，对样品进行另外的微生物测定。例如，可将样品与一种或多种其他染料相接触，比如一下染料中的一种或多种：Acid Fast Bacilli(AFB)III,AlcianBlue,Alcian Blue for Periodic Acid Schiff(PAS),Alcian Yellow,Congo Red,Diastase,Elastic,Giemsa,Grocott's Methenamine Silver stain(GMS)II,iron,JonesLight Green,Jones,Light Green for PAS,Mucicamine PAS,Reticulum,Steiner II,Trichrome Blue和Trichrome Green。在一个例子中，将样品与Ziehl–Neelsen或相似的染料相接触，例如以检测显示耐酸性但有时难以利用革兰氏染色鉴定的分支杆菌或诺卡氏菌。
试剂盒
提供了可与公开的方法一起使用的试剂盒。在一些例子中，该试剂盒可与具有较长的脱色步骤(如花费至少30秒、至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟或至少5分钟来完成的脱色步骤)的自动化的革兰氏染色方法一起使用。
在具体的例子中，公开的试剂盒包括容器中(例如，小瓶或器皿)的缓慢作用脱色制剂。在一些例子中，试剂盒还包括用于进行革兰氏染色方法的其他步骤中的一项或多项的试剂。例如，试剂盒还可包括初级染剂制剂、捕获剂制剂和/或复染制剂，例如其中每个制剂在分开的容器中。
在一个例子中，慢作用脱色制剂的容器包括一种或多种慢作用脱色剂，如1,2-丙二醇、乙二醇或其组合。在一个特定的例子中，慢作用脱色制剂1,2-丙二醇或乙二醇或由该二者组成。在一些例子中，慢作用脱色制剂可包括慢作用脱色剂和快作用脱色剂的组合，如至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％的一种或多种慢作用脱色剂(例如1,2-丙二醇、乙二醇或其组合)、如80％至99.99％、80％至99％、80％至90％、90％至99.9％或90％至98％的慢作用脱色剂，和不超过20％、不超过19％、不超过18％、不超过17％、不超过16％、不超过15％、不超过14％、不超过13％、不超过12％、不超过11％、不超过10％、不超过9％、不超过8％、不超过7％、不超过6％、不超过5％、不超过4％、不超过3％、不超过2％、不超过1％、不超过0.5％或不超过0.01％的一种或多种快作用脱色剂(例如丙二醇单甲醚、二乙醚、乙醇、丙酮、甲醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇,或其组合，如乙醇和丙酮的共混物和乙醇和其他醇类如甲醇或2-丙醇的共混物),如0.01％至20％、0.1％至20％、0.1％至10％、1％至20％或1％至10％的快作用脱色剂。
在一个例子中，初级染剂制剂的容器包括结晶紫(CV)或甲紫。在一个例子中，初级染剂制剂包括结晶紫，浓度至少0.5g/L、至少0.75g/L、至少1g/L、至少2g/L、至少3g/L、至少4g/L或至少5g/L、如1-4g/L,例如3/L。在一些例子中，CV存在于含有异丙醇、乙醇、甲醇和水的溶液中，如50ml异丙醇、50ml乙醇、甲醇和900ml水。在一些例子中，CV或甲紫溶液含有草酸铵以增强稳定性。
在一个例子中，捕获剂制剂的容器包括碘，如革兰氏碘或聚乙烯吡咯烷酮-碘(PVP-碘)溶液。在一些例子中，革兰氏碘包括至少0.1％碘(例如至少0.2％、至少0.5％或至少1％，如约0.1％-1％碘)和至少0.1％碘化钾(例如至少0.2％、至少0.5％、至少1％、至少1.5％,或至少2％,如约0.1％-2％碘化钾)，例如于水和乙醇混合物中。在一些例子中，PVP-碘可包括至少1％聚乙烯吡咯烷酮(例如至少2％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％,或至少35％,如约1-35％聚乙烯吡咯烷酮)和水中的至少1％碘(例如至少2％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％,或至少35％,如约1％-35％碘)(例如参见美国专利第2,739,922号和第3,898,326号)。
在一个例子中，复染制剂的容器包括洋红(如碳酸洋红或碱性洋红)、中性红和/或番红O。在一个例子中，含水复染制剂包括至少0.01％、至少0.02％、至少0.03％、至少0.05％、至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％,或至少0.5％，如从0.02％至0.50％的浓度的洋红。在一个例子中，复染制剂包括至少0.01％、至少0.02％、至少0.03％、至少0.05％、至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％,或至少0.5％，如从0.02％至1％的浓度的中性红。在一个例子中，复染制剂包括至少0.1％,如至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％,或至少0.8％,如0.1％至1％或0.1％至0.8％浓度的番红O。可在水中配制复染剂，但在一些例子中，复染剂可包括1％-20％乙醇或甲醇。
在一些例子中，容器或器皿包括初级染剂制剂、捕获剂制剂、缓慢作用脱色剂制剂，和/或复染剂制剂，所述容器或器皿经配置或成形以用于装载入自动的染色设备中。例如，可将容器配置为与Ventana Medical Systems,Inc.设备一起使用，如NexES SpecialStainer或Ventana BenchMark Special Stainer。在一些例子中，可将容器配置为与Benchmark XT,Benchmark Ultra或Discovery系统一起使用，如美国专利第6,352,861号、美国专利第5,654,200号、美国专利第6,582,962号、美国专利第6,296,809号和美国专利第5,595,707号中所公开的那些，其均通过引用并入本文。关于自动化的系统和方法的另外的信息还可见于PCT/US2009/067042，其通过引用并入本文。在一个例子中，容器是化学抗性的聚丙烯/聚乙烯小瓶，如Ventana BenchMark分药器。
试剂盒还可包括一个或多个显微镜载玻片，如适宜于固定的载玻片和在一些例子中为固定样品的载玻片，以及盖玻片、吸液器或其组合。
任选地，试剂盒还可包括对照载玻片以用于验证革兰氏染色方案的试剂和适当的执行。例如，一组对照载玻片可包括革兰氏阳性细菌，如金黄色葡萄球菌(或本文所列的那些中的任何细菌)，且另一组对照载玻片可包括革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌(或本文所列的那些中的任何细菌)。在一些例子中，试剂盒中的对照载玻片不包括细菌。
任选地，试剂盒还可包括用于进行另外的测定的另外的试剂。例如，试剂盒可包括包含其他染料或染剂的一个或多个器皿或容器，如包括以下染剂中的一种或多种的容器：Acid Fast Bacilli(AFB)III、Alcian Blue、Alcian Blue for Periodic Acid Schiff(PAS)、Alcian Yellow、Congo Red、Diastase、Elastic、Giemsa、Grocott's MethenamineSilver stain(GMS)II、iron、Jones Light Green、Jones、Light Green for PAS、Mucicamine PAS、Reticulum、Steiner II、Trichrome Blue和Trichrome Green。在一个例子中，试剂盒可包括包含细菌特异性的抗体的器皿或容器。在一些例子中，试剂盒包括包含经标记的第二抗体的器皿或容器(例如用荧光团或量子点标记的)。
慢作用脱色组合物
公开内容还提供了可用于本文提供的试剂盒和方法的慢作用脱色制剂。在一个例子中，慢作用脱色制剂包括慢作用脱色剂和快作用脱色剂的混合物，如一种或多种慢作用脱色剂和一种或多种快作用脱色剂。
在一个例子中，慢作用脱色制剂包括一种或多种慢作用脱色剂，如至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％,或至少99.9％的一种或多种慢作用脱色剂(例如1,2-丙二醇,乙二醇或其组合)，如80％至99.99％的一种或多种慢作用脱色剂。在一个例子中，慢作用脱色制剂包括一种或多种快作用脱色剂，如不超过20％、不超过19％、不超过18％、不超过17％、不超过16％、不超过15％、不超过14％、不超过13％、不超过12％、不超过11％、不超过10％、不超过9％、不超过8％、不超过7％、不超过6％、不超过5％、不超过4％、不超过3％、不超过2％、不超过1％、不超过0.5％或不超过0.01％的一种或多种快作用脱色剂(例如丙二醇单甲醚,二乙醚,乙醇,丙酮、甲醇、1-丙醇,2-丙醇,1-丁醇或其组合，如乙醇和丙酮的共混物和乙醇和其他醇类如甲醇或2-丙醇的共混物),如0.01％至20％,0.1％至20％,0.1％至10％,1％至20％,或1％至10％的快速作用脱色剂。
实施例1
革兰氏染色脱色剂的比较
该实施例描述了用于在革兰氏染色中比较脱色剂以优化脱色的速率的方法。根据Carson F,Hladik C.Histotechnology:A Self Instructional Text,第3版,第231-233页.Hong Kong:American Society for Clinical Pathology Press；2009(作为参考并入本文)制备了结晶紫和革兰氏碘。
利用标准的组织学技术对石蜡包埋的革兰氏阳性对照的组织切片进行脱蜡。然后在自动化的原型染色仪上对这些切片进行染色，其中将结晶紫逐滴(～90μL每滴)分散在水平放置的组织切片上，使其孵育持续约4分钟，且然后利用水性表面活性剂溶液冲洗。然后将革兰氏碘逐滴涂覆至切片，且将其孵育持续约4分钟，然后进行冲洗。此时，利用带刻度的移液器人工地将脱色溶剂添加至组织切片，然后以指定的时间段利用水性表面活性剂溶液人工地冲洗。然后人工地涂覆Carbol Fuchsin和Tartrazine的复染剂(分别为90秒和15秒孵育)。然后对载玻片进行脱水并进行二甲苯透明，然后利用永久固定介质覆盖盖玻片。在显微镜(20-200x)下检查，从而评估溶剂对于使革兰氏(-)细菌脱色的选择性。结果显示于下表中。
| 溶剂 | 类型 | 孵育时间 | 结果* |
| 1,2-丙二醇(PG) | 发明 | 210秒 | +/0 |
| 1,2-丙二醇(PG) | 发明 | 60秒 | + |
| 1,2-丙二醇(PG) | 发明 | 30秒 | + |
| 50％PG/50％丙二醇单甲醚 | 发明 | 57秒 | 0 |
| 50％PG/50％丙二醇单甲醚 | 发明 | 74秒 | 0 |
| 80％PG/20％丙二醇单甲醚 | 发明 | 74秒 | + |
| 2-丙醇 | 比较 | 20秒 | - |
*+＝革兰氏(-)为红色，革兰氏(+)为蓝色；
0＝革兰氏(+)的最少脱色；
-＝脱色的革兰氏(+)细菌
为展示可能应用本公开内容的原理的许多可能的实施方案，应认识到所示出的实施方案仅是公开内容的例子，且不应理解为限制本发明的范围。反之，本公开内容的范围由以下的权利要求所限定。因此我们要求我们的发明在这些权利要求的范围和精神中的所有权益。
Claims (16)
1.一种对样品进行革兰氏染色的非诊断方法，包括：
将所述样品加载到自动染色装置中；
使所述样品与初级染剂在足以将革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞壁染色的条件下接触；
使所述样品与捕获剂在足以形成初级染剂-捕获剂复合物的条件下接触；
使所述样品与慢作用脱色制剂在足以从革兰氏阴性细菌而非革兰氏阳性细菌除去初级染剂-捕获剂复合物的条件下接触，其中所述慢作用脱色制剂包含慢作用脱色剂，所述慢作用脱色剂是乙二醇；
使所述样品与复染剂在足以将脱过色的革兰氏阴性细菌染色的条件下接触。
2.权利要求1的非诊断方法，其中使所述样品与复染剂接触在使所述样品与慢作用脱色制剂接触的至少30秒后进行。
3.权利要求1的非诊断方法，其中使所述样品与慢作用脱色制剂接触达至少30秒。
4.权利要求3的非诊断方法，其中使所述样品与慢作用脱色制剂接触达至少60秒。
5.权利要求1-4中任一项的非诊断方法，其中使用压缩空气完成所述样品与慢作用脱色制剂的接触。
6.权利要求1-5中任一项的非诊断方法，其中所述慢作用脱色制剂还包含快作用脱色剂。
7.权利要求6的非诊断方法，其中所述慢作用脱色制剂包含至少80％的所述慢作用脱色剂和不超过20％的所述快作用脱色剂。
8.权利要求1-7中任一项的非诊断方法，其中所述方法进一步包括检测革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。
9.权利要求1-8中任一项的非诊断方法，其中所述初级染剂是结晶紫试剂且所述捕获剂是碘试剂。
10.权利要求9的非诊断方法，其中所述自动染色装置包含：
用于放置多个载玻片的转盘式传送工具，每个上面都有待染色的样品；
用于以预定速度旋转所述转盘式传送工具的工具；和
在所述转盘式工具旋转期间指引和控制各个试剂加载到所述载玻片和样品上的工具，
且其中所述方法包括：
将结晶紫试剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以使所述载玻片上的细菌与所述结晶紫试剂接触；
将水、水性缓冲液、或水性去污剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以从所述载玻片洗去结晶紫试剂；
将碘试剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以使所述载玻片上的细菌与所述碘试剂接触；
将水、水性缓冲液、或水性去污剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以从所述载玻片洗去碘试剂；
同时或分开地将慢作用脱色制剂和复染剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上；并
将水、水性缓冲液、或水性去污剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以从所述载玻片洗去混合试剂。
11.权利要求10的非诊断方法，其中所述慢作用脱色制剂从革兰氏阴性细菌中去除结晶紫试剂和碘试剂需要至少60秒。
12.一种组合物，其充当慢作用脱色制剂，其包含至少80％的一种或多种慢作用脱色剂和不超过20％的一种或多种快作用脱色剂，其中所述一种或多种慢作用脱色剂包含乙二醇。
13.一种用于自动化革兰氏染色的试剂盒，其包含：
在第一容器中的慢作用脱色制剂，其中所述慢作用脱色制剂包含乙二醇；
在第二容器中的初级染剂制剂；
在第三容器中的捕获剂制剂；和
在第四容器中的复染剂制剂。
14.权利要求13的试剂盒，其中所述容器配置为加载到自动化染色装置中。
15.权利要求13或14的试剂盒，其还包含一个或多个用于装载或固定待测样品的显微镜载玻片。
16.权利要求15的试剂盒，其还包含一个或多个对照载玻片。
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