CN108164538A - N-13酪氨酸衍生物取代的吲哚咔唑化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

N-13酪氨酸衍生物取代的吲哚咔唑化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种N‑13酪氨酸衍生物取代的吲哚咔唑化合物及其制备方法和应用，该化合物的结构如式I所示，该化合物结构骨架较为新颖并且具有抗肿瘤活性以及蛋白激酶抑制活性，可用于制备抗肿瘤药物和蛋白激酶抑制剂。新型吲哚咔唑类化合物的制备方法，用大米发酵方法从放线菌Streptomyces sp.CICC 11026的发酵产物中制备得到，可通过对发酵产物进行乙酸乙酯萃取后，再用凝胶色谱和反相色谱分离纯化得到，易于操作和实施。

Description

N-13酪氨酸衍生物取代的吲哚咔唑化合物及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及放线菌培养制备化合物领域，具体涉及一种N-13酪氨酸衍生物取代的吲哚咔唑化合物的制备方法。
背景技术
星孢菌素(STA)属于吲哚咔唑生物碱类天然产物，大量研究表明，其具较强的抗肿瘤活性、抗菌作用、抑制血小板聚集等药理活性并且对大部分的蛋白激酶均有较强的抑制活性，也正是由于其抑制蛋白激酶的选择性差，而限制了其成药性的可能。而随后发现的衍生物则呈现选择性的抗肿瘤和蛋白激酶抑制活性，并且已有多个进入临床相关试验。目前其半合成得到的衍生物Midostaurin在治疗FTL3突变急性髓性白血病(AML)临床研究取得了重大突破，并有诺华公司研发成一种口服多激酶抑制剂，开发用于具有FTL3突变的急性髓性白血病(AML)患者的治疗。从已经进入临床试验的吲哚咔唑类衍生物来看，该类化合物仍然具有进一步开发的前景，挖掘以新吲哚咔唑类化合物为主产物的放线菌，以求得结构新颖活性较优的衍生物，来用于治疗癌症相关的如急性髓系白血病、乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌等疾病以及蛋白激酶相关的神经性变性疾病如帕金森和皮肤类的如银屑病,重型牛皮癣等疾病的新药研发具有重要的社会和经济意义。
发明内容
本发明提供了一种N-13酪氨酸衍生物取代的吲哚咔唑化合物及其制备方法和应用，该化合物具有结构较为新颖的骨架类型，用大米发酵方法从放线菌Streptomycessp.CICC 11026的发酵产物中制备得到，该化合物具有抗肿瘤活性以及蛋白激酶抑制作用，可用于制备抗肿瘤药物和蛋白激酶抑制剂。
一种N-13酪氨酸衍生物取代的吲哚咔唑化合物，为式Ⅰ结构：
本发明提供式Ⅰ结构的具有抗肿瘤活性的新型吲哚咔唑类化合物的制备方法，由放线菌Streptomyces sp.CICC 11026经大米发酵产生，再通过分离纯化得到，易于操作和实施。
一种N-13酪氨酸衍生物取代的吲哚咔唑化合物的制备方法，包括以下步骤：
1)将放线菌Streptomyces sp.CICC 11026接种于高氏一号液体培养基中，摇床培养，得到接种有放线菌的发酵培养基；
2)取步骤1)中接种有放线菌的发酵培养基，接种于大米发酵培养基中，静置培养，得到固体发酵产物；
3)将固体发酵产物分离纯化得到N-13酪氨酸衍生物取代的吲哚咔唑化合物。
步骤1)中，放线菌Streptomyces sp.CICC 11026采用中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)市售菌种，编号为11026，选购网址：http://www.china-cicc.org/。
所述的摇床培养的条件为：20～35℃、100rpm～300rpm摇床培养2～5天；进一步，所述的摇床培养的条件为：25～30℃、150rpm～210rpm摇床培养3～4天。
步骤2)中，所述的大米发酵培养基由大米、水和海盐组成，所述的大米、水与海盐之比为40g：40mL～80mL：0.5g～3g。
所述的静置培养的条件为：23～33℃静置培养60～80天；进一步，所述的静置培养的条件为：25～30℃静置培养68～73天。
步骤3)中，所述的分离纯化包括：将固体发酵产物用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后常压凝胶色谱粗分离，得到混合组分；将混合组分通过中压制备液相分离，高效制备液相色谱分离，得到本发明式Ⅰ结构的化合物。
所述的常压凝胶色谱粗分离的条件：采用的填料为羟丙基葡聚糖凝胶(LH-20)，采用的洗脱剂为体积百分数20％-100％的甲醇-水体系，体积百分数20％甲醇-水体系是指甲醇和水的体积比为20：80，体积百分数100％甲醇-水体系是指甲醇和水的体积比为100：0。
所述的中压制备液相分离的条件：采用的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，采用的流动相为体积百分数40％-100％的甲醇-水溶液，体积百分数40％的甲醇-水溶液是指甲醇和水的体积比为40：60，体积百分数100％的甲醇-水溶液是指甲醇和水的体积比为100：0。
所述的高效制备液相色谱分离的条件：采用的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，采用的流动相为体积百分数38％-45％的乙腈-水溶液，体积百分数38％的乙腈-水溶液是指乙腈和水的体积比为38：62，体积百分数45％的乙腈-水溶液是指乙腈和水的体积比为45：65。
对本发明式Ⅰ结构具有较为新颖的骨架结构，采用人前列腺癌细胞株PC3细胞进行活性评价试验，显示出良好的抑制活性。并且用蛋白激酶(PKC-α，ROCK2)进行测试同样表现出抑制活性。说明本发明式Ⅰ结构骨架类型的化合物具有抗肿瘤活性以及蛋白激酶抑制作用，可用于制备抗肿瘤药物和蛋白激酶抑制剂。本发明提供的化合物可用于制备治疗与细胞增殖过度或异常相关的如乳腺癌、肝癌，肺癌等疾病的药物，本发明提供的化合物在激酶相关的神经性变性疾病如帕金森，皮肤类的如银屑病，重型牛皮癣等疾病的新药研发也同样具有重要的社会和经济意义。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
而本发明分离得到式I结构，其结构与其它吲哚咔唑衍生物结构相比较为新颖，在对其进行活性试验，发现其具有良好的蛋白激酶抑制活性，同时也具有良好的抗肿瘤活性。对于其结构的新颖性可在后续尝试该类化合物的衍生化，以挖掘该结构类型对于其在抗肿瘤，激酶抑制剂方面的药理作用。并进一步将其应用于治疗癌症相关的如非小细胞肺癌、肝癌、肾癌，乳腺癌疾病，蛋白激酶相关的神经性变性疾病如帕金森，以及皮肤类的如银屑病，重型牛皮癣等疾病的新药研发。
具体实施方式
实施例1
一、化合物的发酵
放线菌采用中国工业微生物菌种保藏管理中心出售的链霉菌Streptomycessp.CICC 11026；
1)将放线菌Streptomyces sp.CICC 11026接种于500mL锥形瓶中，每瓶含250mL高氏一号液体培养基，培养条件为28℃、180rpm的摇床中培养3天，获得可发酵培养的种子液；
2)将步骤1)所得的种子液接种至大米培养基(大米培养基，由以下组分制成：大米40g，水60mL，海盐1.5g)，接种体积为12mL，培养条件为28℃下恒温静置培养70天，得到含有本发明具有抗肿瘤活性的化合物的固体发酵产物。
二、化合物的制备及鉴定
将含有本发明具有抗肿瘤活性的化合物的固体发酵产物用乙酸乙酯浸泡萃取3次，溶剂回收浓缩，将所得乙酸乙酯部位进行常压凝胶色谱(采用的填料为羟丙基葡聚糖凝胶LH-20)粗分离，洗脱剂为体积百分数20％-100％的甲醇-水体系梯度洗脱，每1/4柱体积为一个馏分，TLC分析合并含有目标化合物的馏分。对目标组分采用中压制备色谱分离(Sepax Amethyst C-18(10μm,30×400mm)色谱柱，检测波长295nm)，流动相为体积百分数40％-100％的甲醇-水溶液以10mL/min梯度洗脱，TLC分析合并含该化合物的馏分。
所得含该化合物的馏分采用高效制备液相色谱分离(Agilent Pursuit C-18(10μm,21.2×250mm)色谱柱，检测波长292nm)，采用的流动相为体积百分数38％-45％(50min)乙腈/水体系以10mL/min梯度洗脱，收集15-16min的色谱峰，回收溶剂，得到化合物A61-34G，其结构如下所示，为式Ⅰ结构。分子式根据高分辨质谱HR-ESI-MS计算为C30H22N4O4(m/z＝[M+H]+503.1720,calculated 503.1719)核磁数据表1，因此鉴定该化合物为(13-N-((E)-3′-(4″-hydroxy-3″-methoxyphenyl)acrylamide)k252c)，命名为A61-34G，具体结构如下：
表1 1H 600MHz,13C 125MHz(CD3OD)
三、抗肿瘤活性实验
人前列腺癌细胞株PC3细胞测定IC50实验。采用SBR细胞实验，取对数生长期的细胞，1×105个/mL铺96孔板，CO2培养箱中培养24小时，取出培养板后于每孔中加入不同浓度的待测样品，加药完成后，培养板于微孔板振荡器上振荡混匀，置于CO2培养箱中继续培养48小时。取出培养板，在培养液表面每孔轻轻加入50μl预冷的50％的三氯醋酸(TCA)固定，静置5分钟后，再将培养板移至4℃放置1小时。倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入100μl SRB液，在室温25℃放置10分钟，去上清液，用体积百分数1％醋酸洗涤5次，空气干燥，结合的SRB用150μl 10mmol/L非缓冲Tris碱液(pH10.5)振荡溶解。置于酶标仪中测定各孔光吸收，测定波长为540nm。根据各孔OD值计算药物对细胞增殖抑制率，根据各浓度抑制率，采用Logit法计算半数抑制浓度IC50，如表2所示。
表2
化合物 IC50(μM)
A61-34G 6.7
四、蛋白激酶的抑制活性
采用KinEASETM-TK assay kit(Cisbio)，以星孢菌素(STA)阳性药测定所得不同浓度化合物对蛋白激酶(PKC-α，ROCK2)的抑制活性。HRFT值通过测定蛋白激酶在经340nm紫外光激发后665nm和620nm的荧光比值获得，即HTRF值T＝[F665nm/F620nm]×104。蛋白激酶抑制％＝((T待测)-(Tmin))/((Tmax)-(Tmin))×100，Tmax为反应液的HTRF值，Tmin为没有蛋白激酶的空白反应液HTRF值。最终根据各浓度抑制率计算半数抑制浓度IC50如表3所示：
表3
从表2可以看出，采用人前列腺癌细胞株PC3细胞进行活性评价试验，显示出良好的抑制活性。从表3可以看出，对本发明式Ⅰ结构显示出良好的蛋白激酶抑制活性。说明本发明式Ⅰ结构的化合物在抗肿瘤、激酶相关的神经性疾病如老年痴呆，视觉相关疾病如青光眼，老年黄斑病，皮肤类如银屑病，重型牛皮癣等疾病的新药研发等都具有巨大的应用潜力。

Claims (10)

1.一种N-13酪氨酸衍生物取代的吲哚咔唑化合物，其特征在于，为式Ⅰ结构：
2.根据权利要求1所述的N-13酪氨酸衍生物取代的吲哚咔唑化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将放线菌Streptomyces sp.CICC 11026接种于高氏一号液体培养基中，摇床培养，得到接种有放线菌的发酵培养基；
2)取步骤1)中接种有放线菌的发酵培养基，接种于大米发酵培养基中，静置培养，得到固体发酵产物；
3)将固体发酵产物分离纯化得到N-13酪氨酸衍生物取代的吲哚咔唑化合物。
3.根据权利要求2所述的N-13酪氨酸衍生物取代的吲哚咔唑化合物的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述的摇床培养的条件为：20～35℃、100rpm～300rpm摇床培养2～5天。
4.根据权利要求2所述的N-13酪氨酸衍生物取代的吲哚咔唑化合物的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述的大米发酵培养基由大米、水和海盐组成，所述的大米、水与海盐之比为40g：40mL～80mL：0.5g～3g。
5.根据权利要求2所述的N-13酪氨酸衍生物取代的吲哚咔唑化合物的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述的静置培养的条件为：23～33℃静置培养60～80天。
6.根据权利要求2所述的N-13酪氨酸衍生物取代的吲哚咔唑化合物的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述的分离纯化包括：将固体发酵产物用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后常压凝胶色谱粗分离，得到混合组分；将混合组分通过中压制备液相分离，高效制备液相色谱分离，得到本发明式Ⅰ结构的化合物。
7.根据权利要求6所述的N-13酪氨酸衍生物取代的吲哚咔唑化合物的制备方法，其特征在于，所述的常压凝胶色谱粗分离的条件：采用的填料为羟丙基葡聚糖凝胶，采用的洗脱剂为体积百分数20％-100％的甲醇-水体系。
8.根据权利要求6所述的N-13酪氨酸衍生物取代的吲哚咔唑化合物的制备方法，其特征在于，所述的中压制备液相分离的条件：采用的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，采用的流动相为体积百分数40％-100％的甲醇-水溶液。
9.根据权利要求6所述的N-13酪氨酸衍生物取代的吲哚咔唑化合物的制备方法，其特征在于，所述的高效制备液相色谱分离的条件：采用的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，采用的流动相为体积百分数38％-45％的乙腈-水溶液。
10.根据权利要求1所述的N-13酪氨酸衍生物取代的吲哚咔唑化合物在制备抗肿瘤药物和蛋白激酶抑制剂中的应用。
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