CN108159396A - 一种藻蓝蛋白纳米制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂及其制备方法。采用的技术方案是：包括以下原料按重量份配比制成：藻蓝蛋白2‑4份、丹参酮2‑4份、羧甲基壳聚糖1‑2份、脂溶性乳化剂20‑100份、水溶性乳化剂50‑150份、表面活性剂50‑250份。本发明将两个药物先制备成复合纳米乳后，再利用离子交联法制备羧甲基壳聚糖纳米球制剂，对其处方工艺及理化性质进行优化和考察，制备出性质优良的纳米结构载体，具有逆转肿瘤细胞多药耐药作用。

Description

一种藻蓝蛋白纳米制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于中药学领域，具体涉及一种负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂及其制备方法。
背景技术
近年来，虽然各种新型化疗药物不断被研发出来，但是整个癌症邻域的治疗效果并没有得到改善，终其原因就是肿瘤细胞的自我保护机制导致其产生了耐药性，通过转运蛋白的外排自动将化疗药物泵出，导致有效药量减少，无法达到治疗效果，所以肿瘤细胞的多药耐药性质(MDR)是导致肿瘤化疗失败的最主要原因，因此在研发抗肿瘤药物时，应该考虑到相应的逆转肿瘤多药耐药药物的研究。
藻蓝蛋白(C-PC)是从藻蓝蛋白中分离出的一种深蓝色粉末，其颜色鲜艳，是自然界中少见的色素蛋白之一，营养丰富，其氨基酸组成非常齐全，必需氨基酸的含量很高，藻蓝蛋白不仅具有抗癌、逆转癌细胞的耐药性、抗氧化、清除自由基、促进血细胞再生和促使人体内合成弹力蛋白等功效，它还并有荧光，可作为生物学、细胞学一些光动力学的研究试剂。藻蓝蛋白可以帮助调节、合成人体代谢所需要的多种重要的酶，对抑制癌细胞的生长和促进人体细胞再生、保养卵巢具有重要作用，同时藻蓝蛋白调节人体免疫系统，增强免疫系统功能，提高人体对疾病的抵抗力。因此，藻蓝蛋白被食品专家形象地誉为″食物钻石″。1986年，由日本康派艾滋病研究所研制、CONFIDENCE藻类营养食品公司生产的康派奇(confident)藻蓝蛋白素作为癌症患者、白血病患者等的康复药品和营养食品，取得突出的配合疗效。但是藻蓝蛋白对光、热、酸等不稳定。在弱酸性和中性下稳定(pH4.5～8)，酸性(pH4.2)时会发生沉淀，强碱可至脱色。所以在制作成药物剂型时，应充分考虑到这一点。
丹参酮(Tanshinone)是从丹参(radixsalviaemiltiorrhizae)中提取的脂溶性菲醌类成分，包括丹参酮I、丹参酮IIA、丹参酮IIB、隐丹参酮、二氢丹参酮等。是作为对肿瘤细胞具有毒作用机制的代表性抗肿瘤中药单体，研究表明，丹参酮可对多种肿瘤细胞产生细胞毒作用，并可诱导肿瘤细胞分化和凋亡，抑制肿瘤细胞转移，还可降低端粒酶活性。
羧甲基壳聚糖纳米球(CMCNP)是壳聚糖的衍生物，是一种具有很好生物相容性的高分子材料，具有很好的水溶性，可作为良好的药物载体材料应用于医药领域，并且它可以生物降解，以亲水性材料壳聚糖作为载体，可以解决药物溶出慢、重复性差、载药率低、生物利用度低和靶向性差等问题，同时将藻蓝蛋白包合起来可以提高其对光、热、酸的稳定性，又因为藻蓝蛋白自身具有荧光效果，制成新剂型后可以直接利用活体成像仪检测给药后的不同时间点的体内组织分布。
中国发明专利CN201710989606.6公开了“一种藻蓝蛋白配制酒及其制备方法”该发明所述添加物包含藻蓝蛋白、党参、灵芝、佛手、枳椇子和葛根；中国发明专利CN201710809951.7公开了“一种丹参酮IIA羟基磷灰石固体分散体及其制备方法”，该固体分散体以丹参酮IIA为活性成分，以羟基磷灰石为固体载体，用95％乙醇超声溶解或分散均匀，进行喷雾冷冻干燥而得。目前未见藻蓝蛋白与丹参酮组合物制备成纳米结构载体，未见藻蓝蛋白与丹参酮组合物及其纳米结构载体在逆转肿瘤多药耐药中应用报道。
发明内容
本发明的目的在于将藻蓝蛋白与丹参酮制备成壳聚糖纳米球载体，对其处方工艺及理化性质进行优化和考察，制备出性质优良的纳米结构载体，体现逆转肿瘤多药耐药作用。
本发明采用的技术方案是：一种负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂，包括以下原料按重量份配比制成：
所述脂溶性乳化剂为聚氧乙烯蓖麻油EL或大豆卵磷脂中的一种或两种混合。
所述水溶性乳化剂为牛胆酸钠或泊洛沙姆中的一种或二种的混合。
所述表面活性剂为吐温80。
所述泊洛沙姆为泊洛沙姆407、泊洛沙姆338或泊洛沙姆188；优选泊洛沙姆407。
上述的负载藻蓝蛋白和丹参酮羧甲基壳聚糖纳米球制剂的制备方法如下：
1)将丹参酮和脂溶性乳化剂同时加入有机溶剂中，45-75℃水浴加热溶解，搅拌使分散均匀后，将表面活性剂缓慢加入，继续45-75℃水浴中加热搅拌使分散均匀，作为油相；
所述有机溶剂为无水乙醇；
2)将藻蓝蛋白和水溶性乳化剂溶于适量注射用水中，45-75℃水浴加热溶解，搅拌均匀，作为外水相；
3)在800-1500r/min搅拌下，将少量外水相缓慢注入油相中，搅拌20-30min，形成初乳；
4)在800-1500r/min搅拌下，将剩余的外水相缓慢注入油相中，充分搅拌乳化形成水包油型复乳；
5)在10ml羧甲基壳聚糖(CMC)溶液中加入5ml制得的复乳，不断搅拌5-10min，加入3-5ml二氯化钙溶液，继续搅拌20-30min，10000-12000g离心20min，取沉淀，蒸馏水洗涤三次后重悬，得液相负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂；
优选的，所述二氯化钙溶液浓度为1.5mg/ml；所述羧甲基壳聚糖(CMC)溶液浓度为1.5mg/ml；
6)向液相负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂中加入冻干保护剂溶液，冻干，得固相负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂；
优选的，所述冻干保护剂为质量百分比为10％的海藻糖溶液。
本发明的有益效果是：本发明将藻蓝蛋白和丹参酮两种药物采用纳米结构载体(CMCNP)进行负载，制成一种新型纳米给药体系，由于亲水性壳聚糖纳米球无法实现对难溶性药物丹参酮的直接装载，所以在用羧甲基壳聚糖装载前，先将丹参酮与藻蓝蛋白做成水包油型的复乳，再利用离子交联法制备负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂。通过本发明的方法制备负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂(C-PC-T/CMCNP)为圆形或类圆形实体球，粒径为93.7±1.4nm，多分散系数为0.15±0.01，Zeta电位为-33.2±0.24mV，藻蓝蛋白和丹参酮的包封率均可达60％以上，体外释放实验结果显示，藻蓝蛋白药物溶液10h内基本全部释放完全，相反，丹参酮药物溶液体外释放率低，而制得的藻蓝蛋白和丹参酮羧甲基壳聚糖纳米球制剂则缓释效果良好，缓释12h累积缓释率超过70％，24小时后释放出95％药量，因此本发明的负载藻蓝蛋白和丹参酮羧甲基壳聚糖纳米球制剂具有很好缓释性能，即解决了藻蓝蛋白的突释问题，又解决了丹参酮释放慢问题。本发明，通过将藻蓝蛋白和丹参酮制备成羧甲基壳聚糖纳米球制剂，不仅可以提高生物利用度，且对肿瘤多药耐药有良好逆转效果。
本发明通过藻蓝蛋白和丹参酮制备成复合纳米结构载体，两者联合使用能有效提高药物在肿瘤细胞内有效积累量，起到逆转肿瘤多药耐药作用，同时由于其剂型优势，可以减缓药物的排泄，达到缓释作用。本发明将藻蓝蛋白和丹参酮复合制备，并均得到50％以上的包封率，粒径在93nm左右，工艺可行，便于工业化生产。
附图说明
图1A是实施例1中空白调零溶液的紫外扫描图。
图1B是实施例1中丹参酮溶液的紫外扫描图。
图1C是实施例1中藻蓝蛋白溶液的紫外扫描图。
图1D是实施例1中藻蓝蛋白和丹参酮羧甲基壳聚糖纳米球的两次紫外扫描图。
图2是实施例1制备的藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球的透射电镜图。
图3是实施例1制备的藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球的粒径分布图。
图4是实施例1制备的藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球的Zeta电位分布图。
图5是实施例1中藻蓝蛋白、丹参酮、藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球体外药物释放曲线。
具体实施方式
实施例1 负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂(C-PC-T/CMCNP)
(一)制备方法如下：
1)将2mg丹参酮和20mg脂溶性乳化剂(聚氧乙烯蓖麻油EL)同时加入20ml无水乙醇中，45℃水浴加热溶解，搅拌使分散均匀后，将200mg表面活性剂(吐温80)缓慢加入，继续45℃水浴中加热搅拌使分散均匀，作为油相；
2)将2mg藻蓝蛋白和150mg水溶性乳化剂(牛胆酸钠)溶于20ml注射用水中，45℃水浴加热溶解，搅拌均匀，作为外水相；
3)在800r/min搅拌下，将2ml外水相缓慢注入油相中，搅拌20min，形成初乳；
4)在800r/min搅拌下，将剩余的外水相缓慢注入油相中，充分搅拌乳化形成水包油型复乳；
5)在10ml浓度为1.5mg/ml的羧甲基壳聚糖(CMC)溶液中加入5ml制得的复乳，不断搅拌10min，加入3ml浓度为1.5mg/ml的二氯化钙溶液，继续搅拌20min，10000g离心20min，取沉淀，蒸馏水洗涤三次后重悬，得液相负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂；
6)向液相负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂中加入10％的海藻糖溶液，冻干，得固相负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂；
(二)检测结果
1.专属性实验
1.1藻蓝蛋白(考马斯亮蓝法)：
考马斯亮蓝G-250溶液的配制：称取50mg考马斯亮蓝G-250溶于25ml 95％乙醇中，加入50ml 85％磷酸，加蒸馏水稀释至500mL。
标准品母液的配制：精密称取藻蓝蛋白对照品10mg，置于100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容，得浓度为0.1mg/ml的标准品母液。
专属性测定：取藻蓝蛋白母液1mL稀释10倍后，再取0.2mL，补充水到1mL，加入4mL考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀(充分混合)，室温放置5min后用紫外可见分光光度计(UV，Agilent Cary 60)进行全波长扫描，得最大吸收波长。
1.2丹参酮
标准品母液的配制：精密称取丹参酮对照品20mg，置于100ml的容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得浓度为0.2mg/ml的丹参酮标准品母液，
专属性测定：取标准品母液1ml，置于20ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用紫外可见分光光度计(UV，Agilent Cary 60)进行全波长扫描，得最大吸收波长。
结果如图1A和图1B所示，藻蓝蛋白的最大吸收波长在595nm处，而丹参酮的最大吸收波长在269nm处，两者最大吸收波长相差很大，说明专属性良好，本发明的检测方法可行。
2.线性关系考察
2.1藻蓝蛋白
分别精密量取上述藻蓝蛋白标准品母液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml，置于25ml试管中，加入蒸馏水稀释并定容至10ml，分别加入4mL考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀(充分混合)，得系列线性溶液，室温放置5min后在595nm波长处测定吸光度，以系列线性溶液浓度为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(Y)，进行线性回归。
2.2丹参酮
分别精密量取上述丹参酮标准品母液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，置于10ml容量瓶中，加入甲醇稀释并定容，得系列线性溶液，于269nm波长处测定吸光度，以系列线性溶液浓度为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(Y)，进行线性回归。
结果：藻蓝蛋白的线性回归方程Y＝841.5X-24.569(r2＝0.9998)，表明藻蓝蛋白在2～10μg/mL范围内线性关系良好；丹参酮的线性回归方程为Y＝4.626X+0.5184(r2＝0.9991)，表明丹参酮的浓度在20-100μg/mL范围内线性关系良好。
3.精密度实验
方法：取上述藻蓝蛋白线性溶液中低(2μg/mL)、中(6μg/mL)、高(10μg/mL)三个浓度溶液和丹参酮线性溶液中低(20μg/mL)、中(60μg/mL)、高(100μg/mL)三个浓度溶液，分别用专属性中的紫外条件测定，于1天内平行测定5次，连续测定5天，计算日内和日间精密度RSD。
结果见表1。由表1表明精密度良好。
表1 日内和日间精密度结果(n＝5)
4.回收率实验
方法：取3ml空白羧甲基壳聚糖纳米球制剂，分别加入藻蓝蛋白对照品母液0.2、0.6、1.0ml和丹参酮对照品母液1.0、3.0、5.0ml于10ml容量瓶，超声后，分别用专属性中的方法检测低、中、高三个浓度的样品，计算回收率。
结果：结果如表2。结果显示丹参酮和藻蓝蛋白的三个浓度溶液回收率均在99％～103％之间，RSD＜2％，表明该方法回收率良好。
表2 回收率实验结果(n＝3)
5.稳定性实验
方法：取上述线性溶液中浓度为8μg/ml的藻蓝蛋白溶液，浓度为80μg/ml的丹参酮溶液，分别于0、2、4、6、12、24h时间点测定各自的吸光度值，计算RSD。
结果显示，藻蓝蛋白溶液在24h内的吸光度RSD为1.52％和丹参酮溶液在24h内的吸光度RSD为1.82％，均小于2％，表明两者在24h内稳定性良好。
6.包封率测定方法
方法：实验采用超滤离心法测定其包封率。取4ml藻蓝蛋白和丹参酮羧甲基壳聚糖纳米球溶液于超滤离心管中，12000r/min离心20min，取超滤离心管中底部滤液10ul用专属性中的测定方法测定游离药物量(WF)；另取4.0ml藻蓝蛋白和丹参酮羧甲基壳聚糖纳米球溶液于10ml容量瓶中，加甲醇5ml，超声30分钟破乳，放置至室温后用流动定容，用专属性中的测定方法测定，其结果的10倍作为总药量(WT)。则包封率＝(WT-WF)/WT×100％。
结果：丹参酮包封率为66.14％，藻蓝蛋白包封率为69.17％。
7.形态学考察
方法：取藻蓝蛋白和丹参酮羧甲基壳聚糖纳米球适量于带有碳膜的铜网上，用2％磷钨酸染色，自然晾干后置于透射电镜下观察。
结果如图2所示，由图2可见纳米粒为圆形或类圆形实体小球，分散较好，基本无黏连。
8.粒径及Zeta电位测定
方法：取藻蓝蛋白和丹参酮羧甲基壳聚糖纳米球适量进行稀释，采用Zetasizer纳米激光粒度仪进行粒径与电位的测定。
结果如图3和图4所示，由图3和图4可见，纳米粒的粒径为93.7nm，PDI为0.15(n＝3)，电位为-33.2mV，可见制备的纳米载体粒径小，分散均匀，具有较好的稳定性。
9.释放曲线的建立
方法：取5ml藻蓝蛋白和丹参酮羧甲基壳聚糖纳米球置于透析袋(分子量为10KDa)中，同时分别配置相同浓度的丹参酮和藻蓝蛋白溶液5ml于相同的透析袋中，将透析袋置于200ml含有10％吐温80的缓冲盐释放介质(pH 7.4)中，转速80r/min，(37±0.5)℃动态透析，分别于0.5、1、2、3、4、5、6、8、12、24、36h时间点取样1m，过滤后备用进样，同时补加相同温度下的同种溶出介质1ml。采用专属性中的测定方法测定释放介质中药物浓度，并计算累积释放率。
结果如图5所示，由图可见，藻蓝蛋白药物溶液10h内基本全部释放完全，相反，丹参酮药物溶液体外释放率一直很低，而制得的藻蓝蛋白和丹参酮羧甲基壳聚糖纳米球制剂则缓释效果良好，缓释12h的累积缓释率超过70％，24小时后释放出95％的药量，因此该纳米载体具有良好的缓控释性能。
10.逆转多药耐药肿瘤细胞株耐药性的研究
白血病细胞株K562/S为敏感株，K562//MDR为多药耐药株，将这两种细胞株均培养于含10％胎牛血清和1％双抗的1640培养液中。
含药血清制备：SD大鼠适应性饲养10天后，称重，根据随机数目表随机分为高剂量组、中剂量组、低剂量组、空白对照组共4组，每组20只。
给药方法与剂量：藻蓝蛋白和丹参酮羧甲基壳聚糖纳米球高剂量组按20g/kg灌胃给药，中剂量组按10g/kg灌胃给药，低剂量组按5g/kg灌胃给药，空白对照组以生理盐水灌胃。
上述4组小鼠分别于给药2h后取血，3000g，4℃离心10分钟后，取上清，8000g，4℃再次离心10分钟分离血清，56℃灭活30min，用1640配制不同浓度的血清培养液。取对数生长期的K562/MDR细胞以1×106/ml、K562/S以1×106/ml分别接种于96孔培养板中，150μl/孔。在37℃、5％CO2条件下培养过夜后，分别加不同浓度的受试含药血清各200μl，调零组和对照组加相应体积的培养液，每组设4个平行孔。培养24h后，每孔加5mg/ml的MTT溶液20μl(调零组除外)，再培养2h，弃去培养液，加入DMSO 150μl/孔，置于振荡器上摇动10分钟，待结晶完全溶解后，用酶标仪在波长570nm处调零组调零后读取吸光度(A)值。
取4孔A值的均数按公式计算细胞抑制率，细胞抑制率(IR)＝[1-(试验孔A均值/对照孔A均值)]×100％；计算IR并求出半数抑制浓度(IC50)，以上实验重复3次；逆转倍数＝空白对照组IC50/用药组IC50，结果如表3所示，不同给药浓度对K562/MDR逆转倍数为1.42-8.00，且呈浓度正相关，提示本发明中藻蓝蛋白和丹参酮羧甲基壳聚糖纳米球对K562/MDR细胞的耐药性具有逆转作用。
表3 耐药性逆转效果
实施例2 负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂(C-PC-T/CMCNP)
制备方法如下：
1)将3mg丹参酮和40mg脂溶性乳化剂(大豆卵磷脂)同时加入20ml无水乙醇中，50℃水浴加热溶解，搅拌使分散均匀后，将150mg表面活性剂(吐温80)缓慢加入，继续50℃水浴中加热搅拌使分散均匀，作为油相；
2)将3mg藻蓝蛋白和50mg水溶性乳化剂(泊洛沙姆188)溶于20ml注射用水中，50℃水浴加热溶解，搅拌均匀，作为外水相；
3)在1000r/min搅拌下，将2ml外水相缓慢注入油相中，搅拌25min，形成初乳；
4)在1000r/min搅拌下，将剩余的外水相缓慢注入油相中，充分搅拌乳化形成水包油型复乳；
5)在10ml浓度为1.5mg/ml的羧甲基壳聚糖(CMC)溶液中加入5ml制得的复乳，不断搅拌10min，加入5ml浓度为1.5mg/ml的二氯化钙溶液，继续搅拌30min，10000g离心20min，取沉淀，蒸馏水洗涤三次后重悬，得液相负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂；
6)向液相负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂中加入10％的海藻糖溶液，冻干，得固相负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂；
藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球为圆形、类圆形实体球，藻蓝蛋白包封率可达69.4％，丹参酮包封率可达71.5％。
实施例3 负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂(C-PC-T/CMCNP)
制备方法如下：
1)将4mg丹参酮和60mg脂溶性乳化剂(大豆卵磷脂30mg、聚氧乙烯蓖麻油EL30mg)同时加入20ml无水乙醇中，55℃水浴加热溶解，搅拌使分散均匀后，将100mg表面活性剂(吐温80)缓慢加入，继续55℃水浴中加热搅拌使分散均匀，作为油相；
2)将4mg藻蓝蛋白和100mg水溶性乳化剂(泊洛沙姆407)溶于20ml注射用水中，55℃水浴加热溶解，搅拌均匀，作为外水相；
3)在1200r/min搅拌下，将2ml外水相缓慢注入油相中，搅拌20min，形成初乳；
4)在1200r/min搅拌下，将剩余的外水相缓慢注入油相中，充分搅拌乳化形成水包油型复乳；
5)在10ml浓度为1.5mg/ml的羧甲基壳聚糖(CMC)溶液中加入5ml制得的复乳，不断搅拌10min，加入5ml浓度为1.5mg/ml的二氯化钙溶液，继续搅拌25min，12000g离心20min，取沉淀，蒸馏水洗涤三次后重悬，得液相负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂；
6)向液相负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂中加入10％的海藻糖溶液，冻干，得固相负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂；
藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球为圆形、类圆形实体球，藻蓝蛋白包封率可达72.8％，丹参酮包封率可达75.1％。
实施例4 负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂(C-PC-T/CMCNP)
制备方法如下：
1)将2mg丹参酮和80mg脂溶性乳化剂(大豆卵磷脂30mg、聚氧乙烯蓖麻油EL50mg)同时加入20ml无水乙醇中，60℃水浴加热溶解，搅拌使分散均匀后，将50mg表面活性剂(吐温80)缓慢加入，继续60℃水浴中加热搅拌使分散均匀，作为油相；
2)将4mg藻蓝蛋白和80mg水溶性乳化剂(泊洛沙姆407)溶于20ml注射用水中，60℃水浴加热溶解，搅拌均匀，作为外水相；
3)在1500r/min搅拌下，将2ml外水相缓慢注入油相中，搅拌25min，形成初乳；
4)在1500r/min搅拌下，将剩余的外水相缓慢注入油相中，充分搅拌乳化形成水包油型复乳；
5)在10ml浓度为1.5mg/ml的羧甲基壳聚糖(CMC)溶液中加入5ml制得的复乳，不断搅拌5min，加入4ml浓度为1.5mg/ml的二氯化钙溶液，继续搅拌20min，12000g离心20min，取沉淀，蒸馏水洗涤三次后重悬，得液相负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂；
6)向液相负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂中加入10％的海藻糖溶液，冻干，得固相负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂；
藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球为圆形、类圆形实体球，藻蓝蛋白包封率可达65.7％，丹参酮包封率可达63.8％。
实施例5 负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂(C-PC-T/CMCNP)
制备方法如下：
1)将4mg丹参酮和100mg脂溶性乳化剂(大豆卵磷脂)同时加入20ml无水乙醇中，70℃水浴加热溶解，搅拌使分散均匀后，将250mg表面活性剂(吐温80)缓慢加入，继续70℃水浴中加热搅拌使分散均匀，作为油相；
2)将2mg藻蓝蛋白和60mg水溶性乳化剂(泊洛沙姆40720mg、牛胆酸钠40mg)溶于20ml注射用水中，70℃水浴加热溶解，搅拌均匀，作为外水相；
3)在1500r/min搅拌下，将2ml外水相缓慢注入油相中，搅拌20min，形成初乳；
4)在1500r/min搅拌下，将剩余的外水相缓慢注入油相中，充分搅拌乳化形成水包油型复乳；
5)在10ml浓度为1.5mg/ml的羧甲基壳聚糖(CMC)溶液中加入5ml制得的复乳，不断搅拌5min，加入5ml浓度为1.5mg/ml的二氯化钙溶液，继续搅拌20min，12000g离心20min，取沉淀，蒸馏水洗涤三次后重悬，得液相负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂；
6)向液相负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂中加入10％的海藻糖溶液，冻干，得固相负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂；
藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球为圆形、类圆形实体球，藻蓝蛋白包封率可达75.8％，丹参酮包封率可达74.2％。

Claims (4)

1.一种负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球的制剂，其特征在于，所述负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂属于缓释制剂，制备方法如下：
1)将丹参酮和脂溶性乳化剂同时加入有机溶剂中，45-75℃水浴加热溶解，搅拌使分散均匀后，将表面活性剂缓慢加入，继续45-75℃水浴中加热搅拌使分散均匀，作为油相；
2)将藻蓝蛋白和水溶性乳化剂溶于适量注射用水中，45-75℃水浴加热溶解，搅拌均匀，作为外水相；
3)在搅拌状态下，将少量外水相缓慢注入油相中，搅拌20-30分钟，形成初乳；
4)在搅拌状态下，将剩余的外水相缓慢注入油相中，充分搅拌乳化形成水包油型复乳；
5)在羧甲基壳聚糖溶液中加入适量制得的水包油型复乳，搅拌5-10分钟后，加入二氯化钙溶液，继续搅拌20-30分钟，以1000-1200转/分钟的速度离心20分钟，取沉淀，蒸馏水洗涤三次后重悬，得液相负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂；
其中，以下各原料按重量份配比如下：藻蓝蛋白2-4份、丹参酮2-4份、羧甲基壳聚糖1-2份、脂溶性乳化剂20-100份、水溶性乳化剂50-150份、表面活性剂50-250份；
所述脂溶性乳化剂为聚氧乙烯蓖麻油EL或大豆卵磷脂中的一种或两种混合；
所述水溶性乳化剂为牛胆酸钠或泊洛沙姆中的一种或二种的混合；
所述表面活性剂为吐温80。
2.一种负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂，其特征在于，所述负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂为缓释制剂，制备方法如下：
1)将丹参酮和脂溶性乳化剂同时加入有机溶剂中，45-75℃水浴加热溶解，搅拌使分散均匀后，将表面活性剂缓慢加入，继续45-75℃水浴中加热搅拌使分散均匀，作为油相；
2)将藻蓝蛋白和水溶性乳化剂溶于适量注射用水中，45-75℃水浴加热溶解，搅拌均匀，作为外水相；
3)在搅拌状态下，将少量外水相缓慢注入油相中，搅拌20-30分钟，形成初乳；
4)在搅拌状态下，将剩余的外水相缓慢注入油相中，充分搅拌乳化形成水包油型复乳；
5)在羧甲基壳聚糖溶液中加入适量制得的水包油型复乳，搅拌5-10分钟后，加入二氯化钙溶液，继续搅拌20-30分钟，以1000-1200转/分钟的速度离心20分钟，取沉淀，蒸馏水洗涤三次后重悬，得液相负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂；
6)向液相负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂中加入冻干保护剂溶液，冻干，得固相负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂；
其中，以下各原料按重量份配比如下：藻蓝蛋白2-4份、丹参酮2-4份、羧甲基壳聚糖1-2份、脂溶性乳化剂20-100份、水溶性乳化剂50-150份、表面活性剂50-250份；
所述脂溶性乳化剂为聚氧乙烯蓖麻油EL或大豆卵磷脂中的一种或两种混合；
所述水溶性乳化剂为牛胆酸钠或泊洛沙姆中的一种或二种的混合；
所述表面活性剂为吐温80。
3.如权利要求1或2所述的负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂，其特征在于：步骤5)中所述的羧甲基壳聚糖溶液浓度为1-2mg/ml；二氯化钙溶液浓度为1-1.5mg/ml。
4.权利要求1或2所述的负载藻蓝蛋白和丹参酮的羧甲基壳聚糖纳米球制剂在制备逆转肿瘤多药耐药药物中的应用。
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